專利名稱：一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基及其培養方法和其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基及其培養方法和其應用。
背景技術：
產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)又名魏氏梭菌,是一種重要的人畜共患病的病原體，可引起多種畜禽疾病，如仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥等，也能引起人的氣性壞疽和食物中毒。人們根據其發病快的特征將其命名為“猝死癥”。發病動物多以發病急、病程短、病死率高為特征，往往未見任何前期癥狀就來不及治療而導致牲畜死亡，造成畜牧養殖業極大的經濟損失。
孔繁德(孔繁德，陳瓊，我國家畜促死癥的病因與防治對策，《中國獸醫雜志》，1999年，(3):50-52)等研究認為，“目前魏氏梭菌是家畜猝死癥的主要病原”，引起猝死癥的致病因子在于產氣莢膜梭菌產生的外毒素。Haagsma (J.Haagsma.Pathogenetic anaerobic bacteria and the environment[J].Rev.sc1.tech.0ff.1nt.Eqiz.，1991，10(3):749-764)、柴同杰(柴同杰，馬瑞華，常維山，等.產氣莢膜梭狀芽孢桿菌病的流行致病機制探討，《中國預防獸醫學報》，2001年，23 (I): 70-72)等研究指出，“魏氏梭菌的致病原因在于其分泌的毒素和代謝產物，無毒素產生則不會出現臨床癥狀”，“動物魏氏梭菌感染導致的猝死癥，主要由腸毒血癥造成機體主要器官的衰竭所致”。迄今已發現α，β，γ，δ，ε，η，θ，ι，κ，λ，μ，ν12種外毒素,其中，以α，β，ε，ι外毒素較為常見。根據產生外毒素種類的不同,將產氣莢膜梭菌分為Α、B、C、D、E五種毒素型。每種毒素型菌均可產生α毒素。A型菌主要產α毒素；B型菌主要產α、β、ε毒素；C型菌主要產α、β毒素；B型菌、C型菌的致病因素主要為β毒素；D型菌主要產α、ε毒素，且ε毒素為主要的致病因子；E型菌主要產α、ι毒素，但其發病率較低。外毒素的化學成分為蛋白質，具有較好的免疫原性。根據魏氏梭菌的發病機理，制備不同型的魏氏梭菌毒素，然后將其滅活脫毒制成類毒素疫苗或將類毒素制備成抗毒素，用于預防和治療畜禽的“猝死癥”，具有比菌苗更為高效、可靠的免疫效果。Uzal等(Uzal FA.,Kelly WR.Protection of goats against experimental enterotoxaemiaby vaccination with Clostridium perfringens type D epsilon toxoid.VeterinaryRecord，1998，142:722-725)以山羊為對象，設置ε類毒素疫苗免疫組、商用菌苗免疫組和不免疫對照組，研究了魏氏梭菌類毒素疫苗的免疫效果。結果表明，類毒素免疫組抗體效價最高，攻毒后獲得保護；菌苗免疫組抗體效價較低，攻毒后有輕度的腹瀉；未免疫對照組攻毒后出現嚴重的腹瀉等癥狀。柴同杰等(柴同杰，劉文波，魏氏梭菌類毒素疫苗研制及其免疫家兔抗體消長規律，《中國預防獸醫學報》，2006年，28(1):101-104)制備類毒素疫苗免疫家兔，保護效果可靠。魏氏梭菌類毒素疫苗可有效控制魏氏梭菌病的流行，用類毒素制備的抗毒素血清還能夠用于患畜的緊急搶救治療。
大量生長繁殖產氣莢膜梭菌，使其分泌高效價的外毒素是制備高質量類毒素疫苗的關鍵。目前，一般使用厭氣肉肝湯、厭氣肉肝胃酶消化湯培養產氣莢膜梭菌。這些培養基的配制工藝復雜，包括購肉、冷庫保存、剔選、絞碎、保溫消化、提清過濾等工序，需要消耗大量的人力、物力，且生產周期較長，并受肉品質的影響而影響培養基質量的穩定性，進而影響疫苗的品質。產氣莢膜梭菌的產毒素能力與細菌菌株、培養基組成有關，還與培養溫度、PH值、培養時間等培養條件相關。因此，研究適合產氣莢膜梭菌生長繁殖且良好產毒的培養基及其培養方法具有十分重要的現實意義。發明內容
本發明的目的在于提供一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基，所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaCl3-6重量份，加水至1000重量份。
本發明的優選技術方案中，所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
本發明的優選技術方案中，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為7.5-8.0。
本發明的優選技術方案中，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。
本發明的另一目的是提供一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養方法，包括下述步驟:
I)一級種子的培養:將產氣莢膜梭菌接種于血平板，在33_37°C下培養16_24h，制得產氣莢膜梭菌的一級種子；
2)二級種子的培養:從產氣莢膜梭菌的一級種子培養物中挑取有雙層溶血環的單菌落，將其接種于培養基中，在33-37°C下培養16-18h，制得產氣莢膜梭菌的二級種子；
3)發酵培養:按照70% (v/v)在發酵罐中加入本發明所述的培養基，以培養基體積計，加入0.1% (v/v)的消泡劑，高壓滅菌，將培養基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接種量接種產氣莢膜梭菌的二級種子，在33-37°C下和pH值6.5-8.0下培養5_7h，制得產氣莢膜梭菌的發酵培養物，優選在116°C高壓蒸汽滅菌30min ；
其中，所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份,葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份，優選所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaCl5重量份，加水至1000重量份。
本發明的優選技術方案中，所述產氣莢膜梭菌的培養方法選自厭氧培養、靜置培養、靜置厭氧培養的任一種或其組合。
本發明的優選技術方案中，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為7.5-8.0。
本發明的優選技術方案中，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。
本發明的優選技術方案中，發酵培養溫度為35_36°C。本發明的優選技術方案中，發酵培養中采用氨水調節其pH值，優選pH值7.0-7.4。本發明的另一目的在于將本發明的產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用。本發明的優選技術方案中，所述產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物經滅活脫毒制成的類毒素用于制備用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用。本發明的優選技術方案中，所述的相關疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。本發明的另一目的在于提供外毒素提取物的滅活脫毒方法，包括下述步驟:在37°C條件下，在外毒素或其提取物中加入甲醛，混合均勻，使其終濃度為0.4%-0.5%，放置，即得，優選放置3-8日，更優選放置3-5日。本發明的另一目的在于提供一種產氣莢膜梭菌類毒素疫苗，所述的疫苗由滅活脫毒的毒素液與20%氫氧化招膠按體積比為5:1均勻混合而成。為了清楚地表述本 發明的保護范圍，本發明對術語進行如下界定:本發明所述的產氣莢膜梭菌外毒素又稱產氣莢膜梭菌毒素、產氣莢膜梭菌分泌毒素、產氣莢膜梭菌培養分泌毒素，是指從產氣莢膜梭菌培養菌液離心后獲得的毒素上清液。本發明所述的牛肉浸粉購自上海盛思生化科技有限公司，貨號為SSC004。本發明所述的大豆蛋白胨購自北京雙旋微生物培養基制品廠，貨號02-19。本發明所述的血平板購自廣東環凱微生物科技有限公司，貨號024070。本發明采用小鼠最小致死量方法測定外毒素的含量。測定方法為:用生理鹽水將Iml培養物上清液作200倍稀釋，再以0.13ml,0.16ml,0.2ml,0.25ml,0.3ml,0.4ml對體重16 20g昆明小鼠進行尾靜脈注射，每組的實驗動物數為2只。觀察小鼠在24小時內的存活情況，計算最小致死量(MLD)或Iml上清液含有的小鼠MLD數。若靜脈注射0.2ml能使小鼠致死，則MLD為(0.2/200) ml=0.001ml, Iml上清液含有的小鼠MLD數為1000，即1000小鼠MLD。本發明所述類毒素含量的計算方法為:若脫毒前外毒素含量為A，濃縮前、后的毒素上清體積分別為V1、V2，濃縮回收率按85%計，則濃縮后的類毒素含量為(AX Vl X 85%) /V2。除非另有說明，本發明涉及液體與液體之間的百分比時，所述的百分比為體積/體積百分比；本發明涉及液體與固體之間的百分比時，所述百分比為體積/重量百分比；本發明涉及固體與液體之間的百分比時，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量百分比。與現有技術相比，本發明具有下述有益技術效果:1、本發明改進產氣莢膜梭菌的培養基組成，所述培養基含有牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl等商品化生物化學試劑，具有培養基組成成份獲取方便，且其培養方法具有工藝簡便、質量穩定、生產周期短、制造成本低等優點。2、本發明的產氣莢膜梭菌培養基可在適宜環境下實現產氣莢膜梭菌的靜置發酵培養，且相較于厭氣肉肝胃酶消化湯(培養時間為16_20h)的發酵培養時間更短(僅需5-7h)，還利于促進產氣莢膜梭菌高產外毒素，其外毒素的含量可達到500-1200小鼠MLD/ml，具有極好的產業應用價值。
3、本發明的外毒素或其提取物經滅活脫毒后制成類毒素，可用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病，所述的相關疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。
圖1C型產氣莢膜梭菌外毒素的SDS-PAGE蛋白電泳分析結果。
具體實施方式
以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方案，并非限定本發明的實質。
實施例1本發明培養基的組成及其制備方法
技術領域：
本發明培養基的組成為:
牛肉浸粉 25g
大豆蛋白胨IOg
葡萄糖5g
NaCl5g
蒸餾水適量，將培養基定容至1000ml。
本發明培養基的制備方法，包括下述步驟:按照上述培養基組成稱取所需量的組份，均勻混合后，加入適量的蒸餾水，充分溶解后，用ION氫氧化鈉調pH值7.5-8.0，再加入蒸懼水定容至1000ml, 116°C滅菌30min,即得。
實施例2產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養方法
技術領域：
本發明所述產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養方法，包括下述步驟:
I) 一級種子的培養:將生產用凍干菌種C型產氣莢膜梭菌C59-2 (由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應)接種于血平板，于培養箱中33-37°C厭氧培養16-24h ；
2) 二級種子的培養:挑取有雙層溶血環的單菌落，接種于本發明所述的培養基，于培養箱中33-37°C靜置培養16-18h ；
3)發酵罐培養:按發酵罐容積的70% (v/v)加入實施例1制得的培養基，以培養基體積計，加入0.1% (v/v)的消泡劑，116°c高壓蒸汽滅菌30min，將培養基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)接種量接入二級種子，靜置培養，在35-36°C和pH7.0-7.4條件下培養5-7h,即得。
實施例3產氣莢膜梭菌外毒素的制備方法
產氣莢膜梭菌外毒素提取物的制備方法，包括下述步驟:將實施例2制得的產氣莢膜梭菌的發酵培養物經管式離心機(GQ105B，上海知正離心機有限公司生產)，14800g離心，取上清，即得。
實施例4產氣莢膜梭菌外毒素的檢測
I)外毒素含量的測定
采用小鼠最小致死量方法測定外毒素的含量。實施例2培養后的產氣莢膜梭菌的外毒素含量可達到500-1200MLD/ml。
2 ) SDS-PAGE 蛋白電泳將實施例3制得的產氣莢膜梭菌外毒素上清進行SDS-PAGE蛋白電泳，結果見圖1。電泳結果表明，實施例3制得的產氣莢膜梭菌外毒素主要含有分子量約為43KD的α毒素和約為34KD的β毒素2條蛋白條帶。實施例5本發明類毒素疫苗的制備本實施例類毒素疫苗的制備方法，包括下述步驟:I)外毒素的滅活脫毒:在實施例3制得的外毒素上清中加入甲醛，使其終濃度為0.4%-0.5%，在37°C條件下作用3-8日，期間振蕩數次；2)外毒素的脫毒檢驗:將脫毒后的毒素液靜脈注射16_20g小鼠2只，每只0.4ml,觀察24小時，若均健活，即脫毒完全；若有死亡，則要繼續脫毒；3)類毒素的濃縮:采用Pellicon切向流超濾系統(改良聚醚砜膜包，貨號為P2B005A05)對類毒素進行適當倍數的濃縮，并計算濃縮后的類毒素含量；4)類毒素疫苗的制備:取類毒素濃縮液與20%氫氧化鋁膠按5:1混合，制成疫苗，其中，類毒素含量為2000MLD/ml (以脫毒前計算)。實施例6本發明類毒素疫苗的評價試驗I)安全檢驗用體重1.5_2kg的健康家兔4只`，各肌肉注射疫苗4ml，觀察10日，觀察是否健活，有無局部或全身異常反應。在觀察期內，試驗兔全部健活，食欲正常，體溫正常，接種部位無紅腫發熱現象，表明制備的類毒素疫苗安全性較好。2)效力試驗①血清中和法用1.5-2.0kg健康家兔4只，各肌肉注射疫苗0.4ml，免疫后14日采血并分離血清。將4只家兔的血清等量混合，取混合血清Iml與等量的C型產氣莢膜梭菌毒素(含10小鼠MLD)混合，置37°C作用40分鐘后，靜脈注射體重16_20g小鼠2只，每只0.2ml ;同時，用同批小鼠2只，靜脈注射I小鼠MLD的C型產氣莢膜梭菌毒素作為對照組。觀察24小時，判定結果。統計各組小鼠的健活情況。結果顯示，對照組小鼠全部死亡，血清中和組小鼠全部健活，效力檢驗合格。②懷孕母豬定量免疫、仔豬定量攻毒試驗將4頭懷孕69-74日左右的初胎母豬設置為免疫組和不免疫對照組，每組2頭。免疫組于臨產前40-45日和15-20日各接種I次，每次每頭接種2ml。母豬分娩后，對免疫組和不免疫對照組母豬所產I日齡仔豬各取5頭，耳靜脈注射致死量的C型產氣莢膜梭菌毒素，另設不免疫對照組母豬所產仔豬5頭為正常對照，攻毒后連續觀察14日，統計各試驗組仔豬的發病和保護情況。結果顯示，免疫母豬所產I日齡仔豬，經耳靜脈注射致死量的C型產氣莢膜梭菌毒素，連續觀察14日，各仔豬均健活，保護率均為100% ;對照組I日齡仔豬攻毒后在24小時內全部死亡，結果見表I。表IC型產氣莢膜梭菌毒素攻毒試驗結果
權利要求
1.一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基，所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13_6重量份，加水至1000重量份，優選所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份，大豆蛋白胨10重量份，葡萄糖5重量份，NaC15重量份,加水至1000重量份。
2.根據權利要求1所述的培養基，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為7.5—8.0 ο
3.根據權利要求1-2任一項所述的培養基，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。
4.一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養方法，包括下述步驟: 1)一級種子的培養:將產氣莢膜梭菌接種于血平板，在33-37°C下培養16-24h，制得產氣莢膜梭菌的一級種子； 2)二級種子的培養:從產氣莢膜梭菌的一級種子培養物中挑取有雙層溶血環的單菌落，將其接種于培養基中，在33-3 7°C下培養16-18h，制得產氣莢膜梭菌的二級種子； 3)發酵培養:按照70%(v/v)在發酵罐中加入培養基，以培養基體積計，加入0.1% (v/V)的消泡劑，高壓滅菌，將培養基降至35°C ±3°C，再按1%-3% (v/v)的接種量接種產氣莢膜梭菌的二級種子，在33-37°C下和pH6.5-8.0下培養5_7h，制得產氣莢膜梭菌的發酵培養物，優選在116 °C高壓蒸汽滅菌30min ； 其中，所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉18-30重量份，大豆蛋白胨6-15重量份，葡萄糖4-8重量份，NaC13-6重量份,加水至1000重量份,優選所述培養基由下述重量份的成分組成:牛肉浸粉25重量份,大豆蛋白胨10重量份,葡萄糖5重量份，NaC15重量份，加水至1000重量份。
5.根據權利要求4所述的培養方法，所述產氣莢膜梭菌的培養方法選自厭氧培養、靜置培養、靜置厭氧培養的任一種或其組合。
6.根據權利要求4-5任一項所述的培養方法，發酵培養中采用氨水調節其pH值，優選pH 值為 7.0-7.4。
7.根據權利要求4-6任一項所述的培養方法，所述培養基的pH值為7.0-8.5，優選pH值為 7.5-8.0。
8.根據權利要求4-7任一項所述的培養方法,發酵培養溫度為35-36°C。
9.根據權利要求4-8任一項所述的培養方法，所述的產氣莢膜梭菌選自A型產氣莢膜梭菌、B型產氣莢膜梭菌、C型產氣莢膜梭菌、D型產氣莢膜梭菌、E型產氣莢膜梭菌的任一種或其組合，優選為C型產氣莢膜梭菌。
10.一種產氣莢膜梭菌外毒素提取物，由下述方法制備得到:將權利要求4-9任一項制得的產氣莢膜梭菌的發酵培養物在4°C條件下14800g離心，取上清，即得。
11.一種產氣莢膜梭菌外毒素提取物的制備方法，包括下述步驟:將將權利要求4-9任一項制得的產氣莢膜梭菌的發酵培養物在4°C條件下14800g離心，取上清，即得。
12.權利要求4-11任一項制得的產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用，優選所述產氣莢膜梭菌外毒素或其提取物經滅活脫毒制成的類毒素用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用，所述的相關疾病選自仔豬紅痢、雞壞死性腸炎、兔出血性下痢、羔羊痢疾、羊腸毒血癥、牛腸毒血癥、人氣性壞疽、食物中毒的任一種或其組合。
13.—種外毒素提取物的滅活脫毒方法，包括下述步驟:在37°C條件下，在權利要求10所述的外毒素提取物中加入甲醛，混合均勻，使其終濃度為0.4%-0.5%，放置，即得，優選放置3-8日，更優選放置3-5日。
14.一種產氣莢膜梭菌類毒素疫苗，所述的疫苗由類毒素液與20%氫氧化鋁膠按體積比為5:1均勻混合 而成。
全文摘要
本發明公開了一種促進產氣莢膜梭菌高產外毒素的培養基及其培養方法和其應用。本發明所述培養基由牛肉浸粉、大豆蛋白胨、葡萄糖、NaCl和蒸餾水組成，產氣莢膜梭菌在適宜環境下厭氧靜置發酵培養，外毒素的含量可達到500-1200小鼠MLD/ml。外毒素經滅活脫毒制成的類毒素用于預防由產氣莢膜梭菌引起的相關疾病的藥物或疫苗中的應用。本發明培養基具有原料易得，制備工藝簡便、質量穩定，生產周期短，外毒素產量高，制造成本低等優點。
文檔編號C12P21/00GK103160555SQ20131008623
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者熊媛媛, 蔣玉文, 漆世華, 黃濤, 鄭佳, 朱薇, 謝紅玲, 溫文生 申請人:武漢中博生物股份有限公司