專利名稱：內毒素的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種內毒素的新用途。
背景技術：
急性呼吸功能不全是由于肺內外各種原因引起的肺通氣和(或)換氣功能障礙，以至不能進行有效的氣體交換，產生低氧血癥，可伴有高碳酸血癥，從而引起一系列生理功能和代謝紊亂的臨床綜合癥。
心血管臨床診療中可以見到急性左心心肌梗死的患者伴有急性的呼吸功能不全/障礙，此類急性呼吸功能不全/障礙的患者往往在心梗發病前有全身性感染或呼吸道局部感染的情況。
發明內容
本發明的目的是提供一種內毒素的新用途。本發明提供了內毒素在制備產品中的應用；所述產品的作用為加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征。所述“加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征”可體現為如下(a)至Cd)中的至少一種:(a)肺組織損傷加重；(b)肺組織含水量增高；(c)動脈血的氧分壓降低；(d)動脈血的二氧化碳分壓增高。所述“呼吸功能不全家兔模型”的制備方法具體如下:家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處,將胸骨切口邊緣向兩側拉開,暴露心包,夾起心包壁層并剪開,暴露心臟,探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處迅速將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。給予所述內毒素的方法具體如下:以所述“呼吸功能不全家兔模型”心電圖顯示ST段抬高超過0.1mv為心肌缺血標志立即經耳緣靜脈注射內毒素溶液(用雙蒸水配制內毒素溶液，每千克體重注射20μ g內毒素)。所述家兔具體可為新西蘭白兔。本發明還保護內毒素在制備產品中的應用；所述產品的作用為在預期通過左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作制備呼吸功能不全家兔模型的實驗動物術前給予所述內毒素，從而加重左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作后得到的呼吸功能不全家兔模型的發病表征。所述“加重左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作后得到的呼吸功能不全家兔模型的發病表征”可體現為如下(a)至(d)中的至少一種:(a)肺組織損傷加重；(b)肺組織含水量增高；(c)動脈血的氧分壓降低；(d)動脈血的二氧化碳分壓增高。所述左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作的步驟具體如下:家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處，將胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處迅速將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。給予所述內毒素的方法具體如下:加入經耳緣靜脈注射內毒素溶液(用雙蒸水配制內毒素溶液，每千克體重注射20 μ g內毒素),24h后進行左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作。所述家兔具體可為新西蘭白兔。本發明還保護一種制備呼吸功能不全家兔模型的方法，依次包括如下步驟:(I)家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處,將胸骨切口邊緣向兩側拉開,暴露心包,夾起心包壁層并剪開,暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處迅速將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎；(2)經耳緣靜脈注射內毒素。所述呼吸功能不全家兔模型與術前的家兔相比具有體現為如下(I)至(9)中的至少一種表征:(I)吸氣持續時間降低；(2)呼氣持續時間降低；(3)呼吸幅度降低；(4)呼吸頻率增高；(5)心肌缺血表征加重；(6)肺組織損傷加重；(7)肺組織含水量增高；(8)動脈血的氧分壓降低；(9)動脈血的二氧化碳分壓增高。所述步驟(2)具體可為:完成步驟I的家兔，當心電圖顯示ST段抬高超過0.1mv為心肌缺血標志立即經耳緣靜脈注射內毒素溶液(用雙蒸水配制內毒素溶液，每千克體重注射20 μ g內毒素)。所述家兔具體可為新西蘭白兔。本發明還保護另一種制備呼吸功能不全家兔模型的方法，依次包括如下步驟:
(I)家兔經耳緣靜脈注射內毒素；(2)家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處,將胸骨切口邊緣向兩側拉開,暴露心包,夾起心包壁層并剪開,暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處迅速將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。所述呼吸功能不全家兔模型與術前的家兔相比具有體現為如下(I)至(9)中的至少一種表征:(I)吸氣持續時間降低；(2)呼氣持續時間降低；(3)呼吸幅度降低；(4)呼吸頻率增高；(5)心肌缺血表征加重；(6)肺組織損傷加重；(7)肺組織含水量增高；(8)動脈血的氧分壓降低；(9)動脈血的二氧化碳分壓增高。所述步驟(I)具體可為:加入經耳緣靜脈注射內毒素溶液(用雙蒸水配制內毒素溶液，每千克體重注射20 μ g內毒素),24h后進行所述步驟(2)。所述家兔具體可為新西蘭白兔。本發明中選擇心電圖和心肌的常規HE染色作為判斷心肌缺血情況的指標，選擇肺組織含水量、HE染色和透射電鏡下超微結構作為判斷肺損傷的指標，選擇呼吸曲線的參數和Pa02、PaC02作為判斷呼吸功能的指標(PaO2是反映肺換氣功能的指標，PaCO2是反映通氣功能的重要指標)。通過對三組家兔上述指標的對比分析，發現內毒素+左心缺血雙重因素作用下家兔的呼吸功能損害的情況加重，明確了內毒素+左心缺血雙重因素的作用復制急性呼吸功能不全家兔模型的可行性。第II組、第III組家兔在狹窄結扎左冠狀動脈的前降支后心電圖均表現出ST段抬高，T波高尖的急性心肌缺血的表現，并且心肌組織的HE染色也從形態學上證實第II組、第III組家兔心肌急性缺血性損傷改變，第I組家兔的心電圖和心肌HE染色均無心肌急性缺血性損傷改變。在反映肺組織損傷的指標的結果中顯示第II組、第III組表現出肺組織結構的炎性損傷和細胞結構的損傷，提示左心缺血可以引起肺部的損傷性改變，同時結果中還顯示第III組家兔的肺組織的炎性損傷如白細胞的浸潤、肺泡間隔的增厚、淤血和血栓的形成明顯較第II組家兔的肺組織的炎性損傷程度嚴重，此外第III組家兔的肺組織細胞微觀結構出現I型肺泡上皮細胞水腫、II型肺泡內板層小體呈空泡樣改變、微絨毛減少、胞質內出現空泡等急性損傷的表現，而第II組家兔的肺組織細胞的微觀結構基本完整，提示內地素作用下的左心缺血后的急性肺損傷程度更為嚴重。在對三組家兔肺組織含水量的對比中顯示在呼吸反映呼吸功能的指標的結果中顯示第II組、第III組家兔的肺組織含水量高于第I組，第III組家兔的肺組織含水量高于II組，進一步證實了內毒素和左心缺血雙重因素作用下肺損傷更為嚴重。在對三組家兔PaO2和PaCO2比較可知:第III組家兔PaO2低于第II組、第II組家兔PaO2低于第I組，而PaCO2的對比情況則相反，即第III組家兔PaO2高于第II組、第II組家兔PaO2高于第I組，提示內毒素和左心缺血雙重因素作用下的肺損傷所致的肺通氣和肺換氣功能障礙更為明顯。因此，在第三組家兔的上述指標的考察對比后，認為單純左心缺血可以損害呼吸功能，但內毒素和左心缺血的雙重作用可以導致肺急性損傷，由此引起急性呼吸功能不全。本發明發現了內毒素的新功能，對于呼吸功能不全家兔模型的制備具有實際價值。
圖1為實施例1中各組動物Tl時刻的心電圖。圖2為實施例1中各組動物T2時刻的心電圖。圖3為實施例1中三組家兔右肺下葉組織透射電鏡觀察結果(8000X )。圖4為實施例1中三組家兔心肌組織HE染色結果(HE，400X )。圖5為實施例1中三組家兔右肺下葉組織HE染色結果(HE，400X )。圖6為實施例2中各組動物Tl時刻的心電圖。圖7為實施例2中各組動物T2時刻的心電圖。圖8為實施例2中三組家兔右肺下葉組織透射電鏡觀察結果(8000X )。圖9為實施例3中三組家兔心肌組織HE染色結果(HE，400X )。圖10為三組家兔右肺下葉組織HE染色結果(HE，400X )。圖11為實施例3中三組家兔右肺下葉組織透射電鏡觀察結果(8000X )。圖12為實施例3中三組家兔右肺下葉組織HE染色結果(HE，400X )。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。所有數據均 帶入SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數土標準差C I 土S)表示，采用獨立樣本t檢驗進行檢驗。檢驗水準a=0.05。健康成年新西蘭白兔:雌雄不限，體重1.5-2.5kg ;購于山東魯抗醫藥股份有限公司。內毒素(purifiedby:phenol extraction ；E.Coli 0111B4):凍干粉制劑，Sigma,貨號為L2880。BL-420生物信號采集分析系統:成都泰盟生物儀器有限公司。M248全自動血氣分析儀:德國拜耳公司。OLYMPUS BH2照相顯微鏡:日本OLYMPUS公司。H-7500高性能日立電子透射電鏡:日本日立公司。在實驗操作中的注意事項:一是選擇左冠狀動脈的前降支作為狹窄血管，保證左心室缺血操作的成功率。二是打開胸腔的切口部位在第三肋-第五肋對應胸骨正中線上，避開胸肋關節以免破壞胸廓的順應性，影響呼吸功能指標，其次可以避開肋間血管和胸廓內動脈，以免家兔大出血。三是取肺時先以止血鉗將肺自胸膜腔完全游離，再結扎左、右肺根部，將左右肺完整取出，避免動作粗暴撕裂肺組織所致肺含水量測量不準確。實施例1、一、分組處理實驗動物為36只新西蘭白兔，實驗前禁食12h，自由飲水，隨機分為3組，每組12只，分別進行如下處理(各組處理同一時刻進行試驗，所以Tl時刻和T2時刻均為同一時間):第III組(內毒素+左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作處理組):實驗動物經耳緣靜脈注射內毒素溶液(用雙蒸水配制內毒素溶液，注射體積為0.2ml每千克體重，即每千克體重注射20 μ g內毒素)，24h后經耳緣靜脈注射氨基甲酸己酯溶液(氨基甲酸己酯溶液的溶劑為生理鹽水，每千克體重注射5ml 20g/100mL的氨基甲酸己酯溶液)以麻醉實驗動物；仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后將電極夾在兔四肢及胸部相應位置并與BL-420生物信號采集處理系統連接，記錄心電圖，然后將張力換能器與胸壁隨呼吸 運動起伏最明顯處相連，并將信號導入BL-420生物信號采集分析系統，記錄呼吸曲線；然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚(切開皮膚之前的時刻定義為Tl時刻)、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，用手術刀從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處(切口時注意保持胸膜腔的完整性)，以止血鉗夾住胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，用鑷子或止血鉗夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，用棉簽探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處迅速將雙股縫線由血管下穿過，深度約2mm，盡量減少對心肌的創傷，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎，減少動脈血流，引起相應心肌缺血，以心電圖顯示ST段抬高超過0.1mv為心肌缺血標志開始計時(60min后的時刻定義為T2時刻)。第II組(左心缺血組):用生理鹽水代替內毒素溶液(注射體積為0.2ml每千克體重)，其它同第III組；第I組(健康組):實驗動物經耳緣靜脈注射生理鹽水(注射體積為0.2ml每千克體重)，24h后經耳緣靜脈注射氨基甲酸己酯溶液(氨基甲酸己酯溶液的溶劑為生理鹽水，每千克體重注射5ml 20g/100mL的氨基甲酸己酯溶液)以麻醉實驗動物；仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后將電極夾在兔四肢及胸部相應位置并與BL-420生物信號采集處理系統連接，記錄心電圖，然后將張力換能器與胸壁隨呼吸運動起伏最明顯處相連，并將信號導入BL-420生物信號采集分析系統，記錄呼吸曲線；然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚(切開皮膚之前的時刻定義為Tl時刻)、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，用手術刀從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處(切口時注意保持胸膜腔的完整性)，以止血鉗夾住胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，用鑷子或止血鉗夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，用棉簽探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支。二、心電圖比較各組動物Tl時刻的心電圖見圖1，T2時刻的心電圖見圖2。第I組、第II組和第III組動物Tl時刻的心電圖無差異。第I組動物Τ2時刻的心電圖與其Tl時刻的心電圖相比無顯著變化。第II組動物Τ2時刻的心電圖與Tl時刻的心電圖相比，ST段抬高，T波高尖，呈急性心肌缺血圖形，部分出現室性早搏。第III組動物Τ2時刻的心電圖與Tl時刻的心電圖相比，ST段抬高，T波高尖，呈急性心肌缺血圖形，部分出現室性早搏。三、呼吸曲線比較各組動物Tl時刻的呼吸曲線參數見表1，Τ2時刻的呼吸曲線參數見表2。表I三組動物Tl時刻的呼吸曲線參數的比較(X土s, η=12)
權利要求
1.內毒素在制備產品中的應用；所述產品的作用為加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述“加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征”體現為如下(a)至(d)中的至少一種: Ca)肺組織損傷加重； (b)肺組織含水量增高； (C)動脈血的氧分壓降低； Cd)動脈血的二氧化碳分壓增高。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述“呼吸功能不全家兔模型”的制備方法如下:家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處,將胸骨切口邊緣向兩側拉開,暴露心包,夾起心包壁層并剪開,暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。
4.內毒素在制備產品中的應用；所述產品的作用為在預期通過左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作制備呼吸功能不全家兔模型的實驗動物術前給予所述內毒素，從而加重左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作后得到的呼吸功能不全家兔模型的發病表征。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:所述“加重左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作后得到的呼吸功能不全家兔模型的發病表征”體現為如下(a)至(d)中的至少一種: Ca)肺組織損傷加重； (b)肺組織含水量增高； (C)動脈血的氧分壓降低； (d)動脈血的二氧化碳分壓增高。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特征在于:所述左冠狀動脈的前降支狹窄致左心缺血操作的步驟如下:家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處，將胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。
7.一種制備呼吸功能不全家兔模型的方法，依次包括如下步驟: (1)家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處，將胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎； (2)經耳緣靜脈注射內毒素。
所述呼吸功能不全家兔模型與術前的家兔相比具有體現為如下(I)至(9)中的至少一種表征:(1)吸氣持續時間降低； (2)呼氣持續時間降低； (3)呼吸幅度降低； (4)呼吸頻率增高； (5)心肌缺血表征加重； (6)肺組織損傷加重； (7)肺組織含水量增高； (8)動脈血的氧分壓降低； (9)動脈血的二氧化碳分壓增高。
8.一種制備呼吸功能不全家兔模型的方法，依次包括如下步驟: (1)家兔經耳緣靜脈注射內毒素； (2)家兔仰臥位固定，胸頸部備皮，先行氣管插管術和左側頸總動脈插管術，然后沿胸骨正中線逐層切開皮膚、皮下組織、肌肉，暴露胸骨，從第三肋對應的胸骨處切開切口至第五肋骨對應處，將胸骨切口邊緣向兩側拉開，暴露心包，夾起心包壁層并剪開，暴露心臟，探入心臟背面，向右旋轉心臟暴露左冠狀動脈的前降支，在此動脈上三分之一處將縫線由血管下穿過，深度2mm，放置直徑0.3mm銀絲，縫線束緊銀絲后結扎。
所述呼吸功能不全家兔模型 與術前的家兔相比具有體現為如下(I)至(9)中的至少一種表征: (1)吸氣持續時間降低； (2)呼氣持續時間降低； (3)呼吸幅度降低； (4)呼吸頻率增高； (5)心肌缺血表征加重； (6)肺組織損傷加重； (7)肺組織含水量增高； (8)動脈血的氧分壓降低； (9)動脈血的二氧化碳分壓增高。
全文摘要
本發明公開了一種內毒素的新用途。本發明提供了內毒素在制備產品中的應用；所述產品的作用為加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征。所述“加重呼吸功能不全家兔模型的發病表征”可體現為如下(a)至(d)中的至少一種(a)肺組織損傷加重；(b)肺組織含水量增高；(c)動脈血的氧分壓降低；(d)動脈血的二氧化碳分壓增高。本發明發現了內毒素的新功能，對于呼吸功能不全家兔模型的制備具有實際價值。
文檔編號A61D1/00GK103211842SQ20131015364
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月27日 優先權日2013年4月27日
發明者姬明麗, 千智斌, 姚朝陽, 常海敏, 牛敬媛, 官立萍, 李霞飛, 吳云紅, 蔣抗, 李陽, 李濤, 范順陽, 王珺 申請人:新鄉醫學院