一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑的制作方法

專利名稱：一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因制劑，特別涉及一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑。
背景技術：
hTERTC27 (C-terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase, hTERTC27)，是一個27kD的人端粒酶逆轉錄酶C_末端多肽，能引起端粒的 功能異常，使染色體末端快速融合而不影響端粒酶的活性，導致hTERT+ HeLa細胞的凋亡和 老化，在HeLa細胞的裸鼠模型上產生了明顯的抑瘤效果(Huang，J. J.，Lin, M. C.，Bai YX, Jing D, Wong BC, Han Sff, Lin J, Xu B, Huang CF, Kung HF. Ectopic expression of a COOH—terminal fragment of the human telomerase reverse transcriptase leads to telomere dysfunction and reduction of growth and tumorigenicity in HeLa cells. Cancer Research. 62:3226-3232, 2002. ；. Huang, J. J., Han Sff, Bai YX, Ng SSM, Jing DD, Wong BCY, Huang CF, Kung HF, and Lin MC. A human TERT C-terminal polypeptide sensitizes HeLa cells to H202_induced senescence without affecting telomerase enzymatic activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301:627-632，2003.)。在接種了人惡性膠質瘤細胞(U87-MG)的裸鼠 中，hTERTC27也明顯地抑制腫瘤的生長(Ng SS, Gao Y, Chau DH, Li GH, Lai LH, Huang PT, Huang CF, Huang JJ, Chen YC, Kung HF, Lin MC. A novel glioblastoma cancer gene therapy using AAV—mediated long-term expression of human TERT C-terminal polypeptide. Cancer Gene Therapy. 14:561-72,2007.)。hTERTC27可以作為抗hTERT+腫瘤細胞的有效基因療法，同時，hTERTC27能夠誘 導黑色素瘤C57BL/6小鼠體內細胞和體液免疫，顯著地抑制黑色素瘤的生長。由此可見 hTERTC27可以通過基因調節和免疫調節雙重機制共同作用于hTERT+腫瘤細胞，起到一種廣 譜的抗腫瘤效果。目前黃君健教授和孔祥復院士等發現hTERTC7能引起端粒功能失調不影 響端粒酶活性并抑制腫瘤細胞生長，成功申請并獲得美國專利(US 7294708 )。在US 7294708中，采用的是單純的攜帶hTERTC27的質粒對腫瘤細胞轉染并觀察 其對腫瘤細胞端粒功能的影響，并篩選出穩定轉染hTERTC27及EGFP質粒的HeLa細胞株， 在裸鼠皮下接種成瘤，觀察hTERTC27對腫瘤生長的抑制作用。這樣極大的限制了 hTERTC27 作用的發揮；同時，穩定轉染hTERTC27的HeLa細胞裸鼠皮下種植，與自然成瘤有一定的差B.

發明內容
本發明的目的在于提供一種基因免疫治療腫瘤的制劑。本發明所采取的技術方案是
一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉錄酶 C"末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。
優選的，復制缺陷型腺病毒為Ad5。本發明的抗腫瘤基因制劑rAdv_hTERTC27，轉染效率高，對腫瘤細胞的增值和凋亡 調節更為有效。同時，本發明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉染進入樹突狀細胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并進一步刺激T淋巴細胞增殖，并促使T淋巴細 胞對相應腫瘤細胞產生特異性的殺傷效應CTL，對腫瘤進行免疫調節。


圖1是hTERTC27的毒種鑒定電泳圖2是rAdv-hTERTC27病毒感染靶細胞后的RT-PCR、Western blot電泳圖； 圖3是rAdv-hTERTC27對肝癌(H印a 1_6)、膠質瘤(U87)細胞增殖和凋亡的影響圖； 圖4是rAdv-hTERTC27對細胞端粒酶活性的影響圖； 圖5是rAdv-hTERTC27轉染骨髓來源DCs效果圖； 圖6是rAdv-hTERTC27轉染對DCs分泌細胞因子的影響； 圖7是rAdv-hTERTC27-DCs促進T淋巴細胞增殖的作用； 圖8是rAdv-hTERTC27-DCs促進T淋巴細胞殺傷腫瘤靶細胞的作用； 圖9是注射rAdv-hTERTC27后對小鼠肝癌腫瘤體積和生存期的影響圖。
具體實施例方式一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉錄 酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。可接受的藥用輔料是本領導技術 人員所熟知的，如生理鹽水等。優選的，復制缺陷型腺病毒為Ad5。復制缺陷型腺病毒Ad5是由骨架質粒pBHGlox_El，3Cre和穿梭質粒 pDC316-hTERTC27-EGFP雙質粒共轉染293細胞，同源重組產生重組腺病毒。下面結合實施例，進一步說明本發明。rAdv-hTERTC27 (recombinant adenovirus-hTERTC27_EGFP)的制備及鑒定
1)將293細胞接種于六孔板中，每孔5 X 105個細胞，培養基為DMEM+10% Hyclone胎 牛血清，置37°C含5% C02的培養箱中培養過夜；
2)換液，用新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養至細胞生長至底面積的 80 90% ；取24 ii g骨架質粒和6 ii g穿梭質粒，混合均勻，其中骨架質粒選用pBHGlox_El， 3Cre,穿梭質粒選用 pDC316-hTERTC27-EGFP ；
3)將混合均勻的質粒用1800 u 1的DMEM培養液進行稀釋，室溫放置5min ；取60 yl 的Lipofectamine2000脂質體用1800 u 1的DMEM培養液進行稀釋，室溫放置5min ；
4)將稀釋的混合質粒與稀釋的脂質體混合，室溫避光放置30imn ；將室溫避光放置 的混合物均勻地與培養好的細胞混合，參照LipofectamindOOO脂質體說明書進行轉染；
5)轉染后第二天，將長滿的細胞傳代于25cm2細胞培養瓶中，用含5%胎牛血清的 DMEM培養基繼續培養，每天觀察，待細胞長滿瓶底時，再傳入75 cm2細胞培養瓶中，當細胞 變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現明顯噬斑，表明細胞出毒，待細胞大部分病變并從底部脫 落后收取出毒細胞；6)將出毒的細胞培養瓶先后置于-70°C冰箱和37°C水浴鍋中反復凍融三次，使病毒 從病變細胞中充分釋放，將凍融液3000rpm離心5min，收集含病毒的上清液，得第一代毒種 (P1)；
7)用P1轉染293細胞，培養之后收毒，PCR擴增、電泳鑒定無誤后，得到第二代毒種 (P2)；
8)用P2轉染293細胞，培養之后收毒，將收獲的病毒上清用DNase酶消化后，用 0. 45um的濾膜過濾，然后過離子柱純化，之后再過分子篩進一步純化病毒；
9)將純化的病毒保存于腺病毒保存液中，經除鹽處理后用0. 22 ym —次性濾器過濾 除菌，從而得到無菌的純化病毒重組腺病毒人端粒酶多肽基因rAdv-hTERTC27。電泳鑒定圖如圖1所示。RT-PCR、Western blot檢測重組腺病毒在H印al_6細胞株中的表達
1)將生長狀態良好、70% 80%融合的Ifepal-6細胞消化計數，5X 105cells/孔傳代 接種于 6 孔培養板中，按 M0I=20 轉染 rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP，用含 10%FCS 的 RPMI 1640 完全培養基于37°C、5%C02培養箱中孵育48h，用于RT-PCR和Western blot檢測；
2)取 1 P g 總 RNA 逆轉錄成為 cDNA，反應為 42 °C 70min, 70 °C 15min, 4 °C 保存；lOiil cDNA與0. 4iil蛋白酶k混合56 °C 30min,沸水浴lOmin，冰上驟 冷，以破裂病毒衣殼；用Premix Taq進行聚合酶鏈式反應PCR，hTERTC27的引物 為hTERTC27-F (5'-ATGACAGTGGTGAACTTCC-3' ) (SEQ ID NO1)，hTERTC27_R (5，-TCAGTCCAGGATGGTCTTG-3，)(SEQ ID NO 2) (PCR 產物 716bp) ;PCR 反應程序94 °C 5min，30 個循環(94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin),72°C lOmin，PCR 產物上樣到含有 SYBR Safe DNA染料(0. 1 u g/ml)的1. 0 %瓊脂糖上，在TBE中以100V的電壓跑30min，用 凝膠成像儀觀察結果；
3)取15ii g總蛋白100°C變性5min，加入等體積2XSDS蛋白電泳上樣緩沖液，混勻 上樣，并加蛋白質分子量預染Marker —起電泳(200V，至溴酚藍到達分離膠底部或進入電 泳槽)；電轉膜，70V, lh，可見預染Marker亦轉至PVDF膜上；TBST洗膜，5minX3次；封閉液 室溫封閉，2h(封閉完不洗膜);加一抗(1:1000)孵育，4°C振蕩過夜；TBST洗膜，5minX6次； 加HRP標記的二抗(1 1000)，室溫孵育lh ；TBST洗膜，5minX6次；暗室曝光現配發光液， 將ECL試劑盒的A液和B液按1 1混合的，滴加至膜上，在暗室進行曝光。小鼠原位肝癌模型的建立
實驗動物C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，體重18_21g ；瘤株采用小鼠肝癌細胞 H印al-6，由上海細胞庫提供。方法取對數期生長的Ifepal-6細胞制備密度為5X 107個/ml的細胞懸浮液，采 用微量注射器于每只小鼠肝包膜下注射細胞0. lml(5X106個)，分籠飼養于SPF環境下，所 有裸鼠自由飲食，觀察體重變化繼續喂養至產生肝癌，備用。rAdv-hTERTC27對肝癌(Ifepa 1-6)細胞增殖和凋亡的影響
1) 將對數生長期的H印1-6細胞，以每孔6000個細胞接種在96孔板中；分為3 組，rAdv-hTERTC27、rAdv_EGFP24 和 PBS 組，每組 4 個復孔；24 小時后 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP 分別按照 M0I=30 感染 rAdv_hTERTC27 和 rAdv-EGFP, PBS 組加入與 rAdv-hTERTC27等體積的PBS ；重新置于37°C、5%C02培養箱中培養48小時；2)細胞的增值采用CCK-8 clolrimetric assays (Dojindo Molecular Technologies, Inc. , Gaithersbury，MD, USA)進行測定；取出96孔板，各孔中加入10 μ 1 CCK-8溶液，繼 續培養4小時，室溫振蕩5分鐘后，通過化學發光酶標儀測定在450nm處的吸光值(參比波長 650nm)；
3)觀察不同處理組細胞凋亡的差異；同步驟1，24小時后用光學顯微鏡觀察各組 細胞形態學變化；然后在各孔細胞中分別加入Hochest 33258與PI使其終濃度分別為 10 μ g/ml與100 μ g/ml，4°C避光保存10分鐘后在熒光顯微鏡上進行觀察，Hochest染色以 紫外光340nm波長激發，熒光顯微鏡下觀察。凋亡細胞染色呈強藍色熒光，而正常細胞只呈微弱熒光，死細胞則不被染色，由此 可檢測出凋亡；在熒光顯微鏡下選用大于536nm的激發光觀察PI染色結果，染色呈紅色熒 光為死亡細胞，通過計數不同組凋亡和死亡細胞數量比較不同處理組間差別。其結果如圖 3所示。rAdv_hTERTC27對細胞端粒酶活性的影響
端粒酶活性采用PCR ELISA試劑盒(Roche，Mannheim, Germany)進行測定。1) 取對數生長期的H印1-6細胞，當細胞生長至約90%融合時用0.25胰酶消 化，0. OlM pH7.3 PBS洗細胞3次，于15mL離心管中制成單細胞懸液；將細胞稀釋至濃度為 2X105cellS/ml，以每孔500μ 1細胞懸液將細胞接種在24孔板中；輕輕搖動，使細胞均勻， 置于37°C、5%C02培養箱中培養48小時；
2)將各孔細胞分為3組，每組設4個復孔，rAdv-hTERTC27和rAdv_EGFP分別按照 M0I=30感染靶細胞，第三組加入與rAdv-hTERTC27同體積的PBS，重新置于37°C、5%C02培 養箱中培養24小時；
3)端粒酶活性檢測每個EP管加200 μ 1細胞裂解液，冰上孵育30分鐘，期間搖動 EP管使細胞充分裂解，16000Xg 4°C離心20分鐘；取上清，轉移至一新的EP管；另取一組 蛋白樣品經過100°C水浴10分鐘變性，作為陰性對照組，用BCA法測量各組蛋白濃度，按每 個樣品2 μ g蛋白計算上樣量并上樣，具體操作步驟見Telomerase PCR ELISA Kit說明書。分別采用銀染法和ELISA法對端粒酶活性進行標記，各組端粒酶活性結果如圖4 所示。骨髓來源樹突狀細胞(DCs)及rAdv_hTERTC27感染DCs轉染效率觀察
1)骨髓來源樹突狀細胞的分離取5-6周齡的C57BL/6小鼠，斷頸椎處死，無菌剝離 股骨和脛骨，剪至紅骨髓，用30 mL注射器吸取RPMI1640將骨髓沖至培養皿中，100目篩網 過濾后458Xg離心6min收集骨髓細胞，細胞沉淀加入預溫的0. 83% Tris-NH4C1 3mL裂解 紅細胞，裂解5min后加入40 mL RPMI 1640 :458 X g離心6 min，棄上清；
2)臺盼藍拒染法計數活細胞數(測定細胞活力大于95%)，細胞沉淀加入RPMI1640完 全培養基(含10%胎牛血清)，接種至6孔培養板，加入lOng/mL rmGM_CSF、5 ng/mL IL-4， 每孔加完全培養基至4 mL ；至第3天，換含相同濃度細胞因子的完全培養液；至第5天，半 量換液并補足細胞因子；至第6天，輕輕吹打收集所有的懸浮細胞，即為體外擴增的小鼠骨 髓來源的DCs ；每日用相差顯微鏡觀察細胞的生長和形態變化。3)與 200 ng/mL LPS共培養養 2 4 h 后，按照M0I=200 分別加入rAdv_hTERTC27 或rAdv-EGFP孵育24 h，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。
表達綠色熒光即為有效轉染入DCs的rAdv-hTERTC27或rAdv_EGFP。結果如圖5 所示。rAdv-hTERTC27 刺激 DCs 分泌細胞因子 11-2、INF- γ 增加
1、收集rAdv-hTERTC27，rAdv-EGFP或PBS感染24小時的各組DC培養上清；
2、ELISA法檢測DC培養上清中INF-γ和IL-2的含量 1) NF-y-ELISA (R&D Systems, USA)
①用IXCalibrator Diluent RD5P 剃度稀釋配制 5000pg/mL、2500 pg/mL、1250 pg/ mL、625 pg/mL、312 pg/mL、156 pg/mL 禾口 78 pg/mL 的標準品，以 1 XCalibrator Diluent RD5P作為Opg/mL (零對照)；
②用IXCalibratorDiluent RD5P將待檢測樣品稀釋50倍；
③在酶標板中加入AssayDiluent RD1-55，每孔100 L ；
④分別在相應的孔中加入100 L標準品、100 L零對照和100 L待測樣品，各設2 個復孔，粘貼膜封蓋，置于水平軌道震蕩器上，室溫、500rpm振蕩孵育2h ；
⑤吸掉液體，用WashBuffer約500 L/孔洗滌4次，在濾紙上印干洗滌液；
⑥加入6CkineConjugate 200 L/孔，粘貼膜封蓋，置水平軌道震蕩器上，室溫、 500rpm振蕩孵育2h ；
⑦重復步驟⑥1次；
⑧加入Substrate Solution 200 L/孔，避光、室溫孵育 20min ；
⑨加入Stop Solution 50 L/ 孔；
⑩在30min內用酶標儀測定450nm波長處的光密度(OD)值，以570nm為參考波長； 繪制標準曲線，計算樣品的濃度。2) IL-2-ELISA (R&D Systems, USA) 具體操作步驟同上，結果如圖6所示。轉染rAdv_hTERTC27的DCs對T細胞增值及細胞毒性T細胞(CTL)效應的觀察 (1) T淋巴細胞的培養
斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1 2分鐘。在超凈臺中小心剪開小鼠的腹 部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠的腹腔，用鑷子取出小鼠脾臟；在35mm培養皿中放入 4-5mL EZ-Sep Mouse IX淋巴細胞分離液(使用前搖勻淋巴細胞分離)；用鑷子固定尼龍 網，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分 離液中；把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到離心管中，離心前再覆蓋上大約200μ1的 1640培養基。(2) DCs對淋巴細胞的增殖實驗
在重組腺病毒感染24h后的rAdv-hTERTC27-DC、rAdv_EGFP-DC、未處理的DC和T淋 巴細胞共培養；按刺激細胞(S)效應細胞(T)=I :5、1 :10、1 :20、1 40的比例，在96孔 板加入中加入1X1 O 4/孔的3種DCs各100 μ 1和5X1 O4 μ 1/孔、1 X IO5 μ 1/孔、 2 X IO5 μ 1/孔、4X IO5 μ 1/孔淋巴細胞100 μ 1，同時設立對照，每組各設3個復孔；細胞培 養箱孵72h，加入CCK-8試劑20 μ 1/孔，繼續孵育3 h后，用酶標儀在450nm波長測定吸光 度值(參比波長650nm)。結果如圖7所示。(3) rAdv-hTERTC27-DC刺激的T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用收集體外培養的Hepal-6細胞，按每孔1 X IO4個細胞的密度接種細胞于96孔板中， 作為靶細胞。以分別與rAdv-hTERTC27-DC、rAdv-EGFP-DC、未處理的DC與T淋巴細胞共同 培養24h，收集T淋巴細胞作為效應細胞。效靶比(E:T)為5:1、20:1、40:1，另外設只有靶 細胞和只有效應細胞的對照孔，共培養48h后用CCK-8法檢測各組在波長450 nm下吸光 度值(參比波長650nm)。按下式計算CTL的殺傷活性
殺傷率=[1_ (效靶孔值一效應孔值)/靶細胞孔值]X 100% 結果如圖8所示。體內實驗觀察rAdv_hTERTC27對腫瘤生長的抑制作用
1)動物分為3組，每組8只小鼠組 1 :rAdv-hTERTC27(5X 107pfu)4i2: rAdv-EGFP (5 X 107pfu)；組 3 與 rAdv-hTERTC27 等體積的 PBS ；
2)用微量注射器肝包膜下注射Hepal-6小鼠肝癌細胞建立小鼠原位肝癌腫瘤模型， 肝包膜下接種后第7天根據分組尾靜脈注入rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS ；
3)各組動物治療后生存期觀察及腫瘤大小測量觀察小鼠生活狀態及生存期；
4)小鼠于瀕死前即取肝臟組織麻醉動物，剪開大鼠腹腔，切取肝臟組織，觀察各組腫 瘤生長情況，并按垂直和水平方向測量腫瘤大小，腫瘤體積=a2XbX π /6(a為腫瘤的短徑， b為腫瘤的長徑)。結果如圖9所示。結果
圖1是hTERTC27的毒種鑒定電泳圖，由可見在750bp條帶稍下方有明亮條帶，與陽性 對照的位置和亮度相仿，且兩個樣本均產生該條帶，從圖中可以確定hTERTC27成功包裝進 了腺病毒載體中。圖2是rAdv_hTERTC27病毒感染靶細胞后的RT-PCR及Western Blot電泳圖，由 圖可見，在小鼠肝癌細胞中成功檢測到了 hTERTC27的DNA片段和蛋白片段，由此可知重組 腺病毒成功將hTERT攜帶入靶細胞內。圖3是rAdv_hTERTC27對肝癌(!fepa 1-6)細胞增殖和凋亡的影響圖。為了檢測 hTERTC27對腫瘤細胞生長的抑制作用，將rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染靶細胞 孵育48小時后，細胞分別用PI和Hochest進行染色。由圖可見rAdv_hTERTC27感染細胞 后誘導腫瘤細胞凋亡或死亡明顯強于rAdv-EGFP和PBS組(Fig. 3A)。通過CCK-8檢測法 可看到rAdv-hTERTC27較rAdv-EGFP或PBS相比明顯抑制了腫瘤細胞的增值(圖3B)。圖4是rAdv-hTERTC27對細胞端粒酶活性的影響圖。為了證明hTERTC27是否是通 過影響端粒酶活性而起到促進凋亡作用的，將重組腺病毒感染靶細胞，48小時后收集細胞 提取蛋白，采用TRAP-ELISA檢測端粒酶活性，如圖所示，在rAdv_hTERTC27、rAdv-EGFP和 PBS三組中端粒酶活性都是陽性的，三者之間并沒有明顯差別。ELISA法和銀染法均證實了 同樣的結果。圖5是rAdv_hTERTC27轉染骨髓來源DCs效果圖。其中A所示為從小鼠骨髓分離 得到的DCs，培養至第八天，DCs成熟可以進行下一步實驗。B所示為病毒感染DCs 24小時 后，綠色熒光所示為轉染入DCs的病毒顆粒。當M0I=200時，轉染效率可達到80%。圖6是rAdv-hTERTC27 Ad_6Ckine/IFN γ轉染對DC分泌細胞因子的影響； rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP或PBS感染DCs24小時后，培養上清中的IFN- y、IL-2濃度用
8ELISA試劑盒來測定，如圖7所示，rAdv-hTERTC27感染DCs組上清中IFN- γ (328. 6 士 11. 26 pg/ml), IL-2 (8. 18士0. 45 pg/ml)明顯高于 rAdv-EGFP 與 PBS 組，IFN- γ 與 IL-2 濃度分 別為 IFN-Y (234. 50士 10. 56 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (3.06士0· 42 pg/ml, Ρ<0· 05)， IFN-y (251. 63士 13. 0 pg/ml, Ρ<0· 05)，IL-2 (2. 65士0.38 pg/ml, Ρ<0· 05)。這部分實 驗結果證明了 rAdv-hTERTC27可以促進DC細胞分泌細胞因子增加。這也是rAdv_hTERTC27 免疫治療的重要機制之一。 圖7是rAdv-hTERT27-DCs促進T淋巴細胞增殖；刺激指數(Si)用來計算DC 細胞刺激后T淋巴細胞增值程度，如圖8所示rAdv-hTERTC27、rAdv-EGFP、PBS分別感 染DC細胞后刺激T淋巴細胞增值水平分別為0. 91 士0. 09,0. 43士0. 01,0. 45士0. 02 (S/ T=I: 5) ；0. 56士0. 02,0. 37 + 0. 01,0. 37 + 0. 02 (S/T=l 10)、0· 46士0. 01,0. 37士0. 01、 0.37 士 0.02 (S/T=l:20) ;0· 41 士 0. 01、0· 35 士 0. 00、0· 39 士 0. 012 (S/T=l:40),由結果可 見rAdv-hTERTC27感染DC細胞后，在S/T彡1:10時，DC細胞刺激T淋巴細胞增值的能力 明顯強于rAdv-EGFP與PBS組(P<0. 05)，而rAdv-EGFP與PBS之間差異不具有統計學意義 (P>0. 05)。 圖8是rAdv-hTERTC27-DCs促進T淋巴細胞殺傷腫瘤靶細胞的作用；如圖所 示E/T比值分別為5:1、20:1、40:1，結果顯示rAdV-hTERTC27_DCs活化的T淋巴細胞對 H印al-6 細胞的殺傷率在 E:T=5:1、E:T=20 1 和 E:T=40 1 時分別為(16. 16士2. 75)%、 (44. 44 士 3. 11) % 和(65. 21 士 2. 98) % ；rAd-EGFP-DCs 禾口 PBS-DCs 活化的 T 淋巴細胞 在 E:T=5:1、E:T=20 :1 禾口 E:T=40:1 時分別為(17. 79士2. 95) %、(33. 65士3. 16) %、 (40. 54士3. 18)% 和(16. 99士2. 97)%、(30. 57士2. 64)%、(48. 72士3. 45)%。當 E:T 彡 20 1時，rAdv-hTERTC27-DCs活化的T淋巴細胞對!fepal-6腫瘤細胞的殺傷率明顯高于 rAd-EGFP-DC 和 PBD-DC 組(/7<0. 05 )，而 rAd-EGFP-DC 和 PBS-DC 組間差異不具有顯著性 (P>0. 05)。圖9是注射rAdv_hTERTC27后對小鼠肝癌的影響圖，從圖中可以看出，注射了 rAdv-hTERTC27的小鼠，其肝癌已得到很好的抑制。如圖所示，由大體模型可以直觀地看到 rAdv-hTERTC27治療組較rAdv-EGFP和PBS治療組腫瘤體積明顯縮小(P<0. 05)，測量腫瘤 體積分別為(1012士21. 43)mm3, (2567士32. 21)mm3, (2789士29. 12)mm3。而 rAdv_hTERTC27 治療組生存期較rAdv-EGFP和PBS治療組明顯延長(P<0. 05)，分別為68天，34. 5天和31 天。由此可見rAdv-hTERTC27能夠有效地抑制小鼠肝癌的生長，延長了荷瘤小鼠的生存期。 在實驗過程中同時發現，對小鼠而言，rAdv-hTERTC27的注射量為5X107pfu/鼠時，其效果 最好。本發明的抗腫瘤基因制劑rAdv_hTERTC27，轉染效率高，對腫瘤細胞的增值和凋亡 調節更為有效。同時，本發明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉染進入樹突狀細胞 DCs,使DCs激活，分泌IFN- y、IL-2，增加并進一步刺激T淋巴細胞增殖，并促使T淋巴細 胞對相應腫瘤細胞產生特異性的殺傷效應CTL，對腫瘤進行免疫調節。通過以上途徑，本發 明的抗腫瘤基因制劑可應用于多種腫瘤的治療。
權利要求
一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉錄酶C 末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。
2.根據權利要求1所述的一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，其特征在于復制缺 陷型腺病毒為Ad5。
全文摘要
本發明公開了一種基因免疫治療腫瘤的靜脈用制劑，由復制缺陷型腺病毒裝載人端粒酶逆轉錄酶C-末端多肽基因hTERTC27和可接受的藥用輔料組成。本發明的抗腫瘤基因制劑rAdv-hTERTC27，轉染效率高，對腫瘤細胞的增值和凋亡調節更為有效。同時，本發明的抗腫瘤基因制劑，能有效的將目的肽段轉染進入樹突狀細胞DCs，使DCs激活，分泌IFN-γ、IL-2，增加并進一步刺激T淋巴細胞增殖，并促使T淋巴細胞對相應腫瘤細胞產生特異性的殺傷效應CTL，對腫瘤進行免疫調節。
文檔編號A61K48/00GK101940796SQ201010295079
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者何蕾, 孔祥復, 彭英, 黃君健, 龔漢賢 申請人:中山大學孫逸仙紀念醫院