專利名稱：一種三股螺旋銀耳多糖及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及多糖領域，具體涉及一種三股螺旋銀耳多糖及其制備方法和應用。
背景技術：
銀耳(Tremella fuciformis Berk)，又名白木耳、雪耳，其內含有碳水化合物、蛋白質、維生素和多種氨基酸等，是滋補強壯、扶正固本的良藥。銀耳子實體由數片至10余片薄而多皺褶的瓣片組成，呈菊花形、牡丹花形或繡球形，直徑3-15cm，白色或類黃色，表面光滑，有光澤，基蒂黃褐色；角質，硬而脆；浸泡水中膨脹，有膠質，氣微，味淡，新鮮時軟，干后收縮；多生于櫟及其他闊葉樹腐本上。據國內外的藥理作用研究，銀耳多糖具有可以調節動物的腸道有益菌群從而增強免疫力的作用；通過調節體液免疫、細胞免疫和細胞因子增強免疫系統的調節能力；直接或間接的對腫瘤細胞具有殺傷作用，是潛在的抗腫瘤藥物； 能清除自由基延緩衰老的作用；調節血糖血脂水平，緩解由于高血糖血脂引起的一系列疾病；此外銀耳多糖還有抗凝血血栓、抗潰瘍、促進蛋白質合成、抗病毒、促進神經細胞生長及改善記憶力等多方面的活性。現有的銀耳多糖的制備方法多采用酸堿或微波提取，可以增加多糖的提取率。現有的銀耳多糖的制備方法如中國專利ZL200810M0804. 3中公開了一種銀耳提取物及其制備方法，是用去離子水浸泡銀耳后，調節PH值至8. 5-9. 0之間，于85-95°C恒溫反應，過濾濃縮后，得到銀耳提取物。中國專利申請CN20041007^65.5中公開了幾種均一體銀耳(孢子)多糖及其提取方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物，提取方法包括將銀耳孢子發酵物經水煮、醇沉或不同濃度的NaOH水溶液梯度提取，經柱層析分離、純化得到含量在90%以上堿提銀耳多糖ATF-A、ATF-B, ATF-C, ATF-D，水提銀耳多糖WTF-A、 WTF-B。中國專利ZL02144648. 2中公開了銀耳多糖，其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物，其制備方法包括將銀耳孢子、銀耳子實體加水攪拌均勻制成水溶液，離心后取上清液經活性炭過柱兩次，用水洗至無色，過濾后水浴加熱，冷卻至室溫后冷藏，將樹脂、鞣質等雜質除去；離心后取上清液，醇沉至濃度為60%，緩慢加入，充分攪拌后離心；取上清液醇沉至濃度為80%，充分攪拌再離心，收集沉淀物配液后G4漏斗過濾，分裝滅菌，凍干制成成品。中國專利申請CN20041007^64. 0中公開了具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物及其制備方法和含它們的制劑。中國專利ZL 200710014978. 3中公開了一種銀耳多糖的酶法逆向提取工藝，將銀耳浸于水中，調節PH至7. 3-7. 6，將膨脹后的銀耳移入酶解液中進行酶解，酶解溫度為35-38°C，pH7. 5-8. 5，時間1_2H，從酶解液中移出酶解后的銀耳，置于堿性溶液中，浸泡后，升溫至90-98°C，持續0. 5-1. 0H,攪動，除去液面浮出的泡沫殘渣，將絮狀固形物移出，置于酸性溶液中，浸泡20-40分鐘，移出絮狀固形物，置于弱堿溶液中，浸泡10-20分鐘，再移入清水，取出，浙干，脫水，低溫干燥，得銀耳多糖。中國專利ZL 200510023427. 4中公開了銀耳雜多糖及其提取物、制備方法和用途，銀耳雜多糖，其結構以 α-(1-3)甘露糖為主鏈，主要由重量百分比為70-93%的中性總糖、6-28%的葡萄糖醛酸、 0. 1-3%的結合蛋白組成；該銀耳雜多糖的平均分子量為85-160萬道爾頓，其中分子量大于6000道爾頓的占90% (重量)以上。中國專利ZL200910059901. 7中公開了一種以銀耳次、殘品及耳腳為原料制備銀耳多糖的方法，將銀耳次、殘品及耳腳3 30重量份加水浸泡 20 30MIN，浙干，置于溫度-20 -10°C冷凍6 10H，然后粉碎至粒徑1 3匪；將上述粉碎后的銀耳粒料與水按固液比1 40 80混合均勻，經功率700W，溫度90 100°C微波處理15 25MIN，按總固液比1 80定容；再將上述微波處理后的原料放入三角瓶中， 在溫度60 80°C水浴中振蕩1 2H，經3000 5000RPM離心10 20MIN，取上層清液在真空度0. 08 0. 09MPA、溫度55 65°C濃縮至20 30%體積，在溫度10 20°C，攪拌加入2 3倍體積的冷藏無水乙醇沉淀粗多糖，靜止沉淀后過濾，獲得糖泥在真空度0. 08 0. 09MPA、溫度55 65°C干燥6 10小時，獲得粗多糖產品。上述報道大多是關于多糖粗提取的方法，部分專利或專利申請對單一組分結構進行分析是關于銀耳多糖的一級結構的探討，并沒有涉及到活性或高級結構的鑒定。
發明內容
本發明提供了一種三股螺旋銀耳多糖。—種三股螺旋銀耳多糖，具有三股螺旋結構，各股螺旋結構以1 — 6連接的α -甘露糖為主鏈，以與主鏈1 — 2連接的β -巖藻糖為側鏈，以與主鏈1 — 4連接的α -葡萄糖醛酸為側鏈，以與主鏈1 — 2連接的α -木糖為側鏈；包括重量百分含量為81. 9% 的總糖和重量百分含量為6. 8%的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的總糖的組成為甘露糖、木糖和巖藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和巖藻糖的物質的量之比為 5.78 0.7 1. 10 1 ；所述的三股螺旋銀耳多糖25°C的特性粘度為1392.8ml/g。所述的三股螺旋銀耳多糖的側鏈有多種不同的變化組合，如可具有如結構式I所示的結構單元
權利要求
1.一種三股螺旋銀耳多糖，具有三股螺旋結構，各股螺旋結構以1 — 6連接的α-甘露糖為主鏈，以與主鏈1 — 2連接的β -巖藻糖為側鏈，以與主鏈1 — 4連接的α -葡萄糖醛酸為側鏈，以與主鏈1 — 2連接的α -木糖為側鏈；包括重量百分含量為81. 9% 的總糖和重量百分含量為6. 8%的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的總糖的組成為甘露糖、木糖和巖藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和巖藻糖的物質的量之比為 5.78 0.7 1. 10 1 ；所述的三股螺旋銀耳多糖25°C的特性粘度為1392.8ml/g。
2.一種三股螺旋銀耳多糖的制備方法，包括步驟(1)水提將銀耳子實體粉碎得到銀耳子實體粉末，加入蒸餾水，每克銀耳子實體粉末加入50mL-60mL蒸餾水，90°C -100°C浸提4小時-6小時后離心，取上清液；離心所得沉淀可按所述水提方法重復1-2次，合并上清液得到銀耳多糖水提液；(2)醇沉向步驟(1)中的銀耳多糖水提液中加入4倍-5倍銀耳多糖水提液體積的乙醇水溶液，攪拌混勻，于2°C _5°C沉淀過夜，離心，取離心所得沉淀得到一次銀耳粗多糖；所述的乙醇水溶液的體積百分濃度為90% -96% ；(3)去蛋白將步驟(2)所得的一次銀耳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，滅酶并離心除去變性蛋白和酶，離心所得上清液再用有機溶劑離心除去下層有機相和中間的蛋白層，重復用有機溶劑離心的步驟直至無白色沉淀產生，得到提取液；(4)透析步驟C3)所得的提取液用孔徑為8000Da-14000Da的透析袋在自來水中透析 40h-50h,再用去離子水透析40h-50h，收集透析后的提取液，真空冷凍干燥得二次銀耳粗多糖；(5)純化將步驟(4)得到的二次銀耳粗多糖用去離子水溶解得到二次銀耳粗多糖水溶液，經二乙氨基乙基纖維素52離子交換層析柱層析，收集的洗脫液用苯酚-硫酸法檢測多糖，收集第一洗脫峰的洗脫液經凝膠過濾層析，凝膠過濾層析所收集的洗脫液用苯酚-硫酸法檢測多糖峰，收集含多糖的洗脫液，經濃縮、透析和凍干得到白色疏松絮狀三股螺旋銀耳多糖。
3.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，離心的速度為 3000rpm-4000rpm，時間為 15min_30min。
4.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，每克銀耳子實體粉末加入50mL蒸餾水，96°C浸提4小時，離心的速度為4000rpm，離心的時間為 20min。
5.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，( 醇沉向步驟(1)中的銀耳多糖水提液中加入4倍銀耳多糖水提液體積的乙醇水溶液，攪拌混勻，于 4°C沉淀過夜，再于4000rpm離心20min，取離心所得沉淀得到一次銀耳粗多糖；所述的乙醇水溶液的體積百分濃度為95%。
6.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶；所述的有機溶劑為氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的體積比為5 1。
7.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的二次銀耳粗多糖水溶液的濃度為5mg/mL 30mg/mL，流速為lml/min。
8.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述的二乙氨基乙基纖維素52離子交換層析柱層析的條件為采用梯度洗脫，洗脫液為 0. lmol/L-0. 6mol/L 的 NaCl 水溶液，流速 lml/min。
9.根據權利要求2所述的三股螺旋銀耳多糖的制備方法，其特征在于，步驟(5)中， 所述的凝膠過濾層析的條件為流速0. 5ml/min，洗脫液為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液和 0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸鹽緩沖液與NaCl水溶液的體積比為2-3 1。
10.一種權利要求1所述的三股螺旋銀耳多糖在制備抗氧化劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種三股螺旋銀耳多糖及其制備方法和應用，制備方法步驟包括水提醇沉提取銀耳多糖組分，經酶-Sevage結合法去蛋白、透析、陰離子交換層析和凝膠過濾層析純化，真空冷凍干燥分離純化組分即為銀耳多糖。利用本發明制備銀耳多糖，不影響其天然結構和活性，該方法對設備要求較低、成本低，利于工業生產上大規模的推廣、開發和使用。本發明對純化后多糖進行組分分析、結構鑒定及抗氧化活性研究，發現本發明銀耳多糖有較強的清除羥自由的活性，是潛在的抗氧化物質。
文檔編號A61P39/06GK102336840SQ20111031494
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月17日 優先權日2011年10月17日
發明者李衛旗, 賀亮, 韋朝陽, 馬素云 申請人:浙江大學