專利名稱：具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物及其制備方法和含它們的制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然產物及其半合成，具體地說，是具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物及其制備方法，和含有它們的藥物制劑，以及該藥物制劑在用于制備增強免疫、抗腫瘤、抗放射、升高白細胞、抗病毒、抗凝血藥物中的應用。
背景技術：
近20年來，隨著天然藥物化學和藥理學研究的不斷深入及分析手段突飛猛進的發展，多糖的研究引起了國內外學者極大的興趣。藥理實驗表明，銀耳多糖具有增強免疫功能、抗放射和促進骨髓造血機能、升高白細胞、抗腫瘤、降低膽固醇等廣泛的生物活性。
多糖由單糖聚合而成，是聚合度超過10的極性大分子。由于多糖組分中單糖的種類繁多，連接形式千差萬別，多糖的結構極其復雜，由此決定了多糖生物學活性的多樣性。目前，雖尚未完全搞清中藥多糖的構-效關系，但可以認為其活性與分子結構、溶解度、粘度、分子量等密切相關。許多報導表明，多糖分子中取代基對多糖活性影響很大。在牛膝多糖分子中引入一定量的硫酸基團，其生物活性大大提高，并且具有抗病毒的作用。大量研究證明，香菇多糖能增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力，提高機體抗腫瘤功能，而將其硫酸酯化后，其生物活性發生變化，具有抑制愛滋病病毒的作用。
目前，已報道許多經硫酸酯化的多糖如地衣多糖、右旋糖酐、裂褶菌多糖、海藻多糖、木聚糖具有明顯的抑制HIV活性。在這些多糖中SO42-是抗HIV-1所必需的，而且SO42-的含量不足(每個糖單位只有一個SO42-如硫酸軟骨素和N-脫硫肝素)也無活性。但對于銀耳多糖硫酸酯化的研究還未見報導。
發明內容
本發明的目的在于，提供了具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物，簡稱STF。
本發明的另一個目的是提供了均一體銀耳多糖修飾物的制備方法。
本發明的再一個目的是提供了均一體銀耳多糖修飾物的藥物制劑。
本發明的還一個目的在于，提供了以均一體銀耳多糖修飾物為活性成分的藥物制劑，在用于制備增強免疫、抗腫瘤、抗放射、升高白細胞、抗病毒、抗凝血等藥物中的應用。
本發明從銀耳孢子發酵物中，經水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝膠柱層析分離、純化，得到均一體銀耳多糖TF。進一步對TF進行結構修飾，用氯磺酸進行酯化，制備出不同硫含量的銀耳多糖硫酸酯(STF)。本發明的內容目前尚無文獻報道，為一類新的化合物。
本發明的均一體銀耳多糖修飾物由下述方法獲得將銀耳孢子發酵物經水煮醇沉、除蛋白后，用Sephadex凝膠柱層析分離、純化，得到銀耳多糖TF，用酯化試劑進行酯化，制備出如下的銀耳多糖修飾物(化合物I)。
其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同時＝H。
所述均一體銀耳多糖修飾物的制備方法，包括
(1)將銀耳孢子發酵粉加水煮提，冷卻、離心，上清液濃縮后加乙醇沉淀，過濾取沉淀，真空干燥得粗多糖；取粗多糖加水煮提，冷卻、離心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀，過濾取沉淀，真空干燥，得精制多糖；取精制多糖用Sephadex凝膠柱層析分離、純化，得到均一體銀耳多糖TF。
(2)取均一體多糖TF，加入無水甲酰胺，在30-80℃加入酯化試劑，攪拌、室溫放置一天，然后用NaOH中和到PH為6-7，過濾，濾液用蒸餾水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
或為 R1、R2、R限定范圍如前所述；n＞10；所述的酯化試劑為吡啶與氯磺酸的混合物，一般的體積比為0.1∶1-30V/V，較好為0.1∶1-25V/V，最佳為1∶1-10V/V。
所述的酯化試劑的制備如下
酯化試劑將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入吡啶，充分攪拌使之冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸約30-40分鐘滴加完畢，然后再室溫攪拌30分鐘，加熱到50℃，再繼續攪拌30分鐘。
本發明所述的以均一體銀耳多糖修飾物為活性成分的制劑，是指制劑含有治療有效量的銀耳多糖修飾物，及一種或一種以上的藥學上可接受的載體。
其中，所述的均一體銀耳多糖修飾物的治療有效量一般為0.1～500mg；較好為1～200mg；最佳5～100mg。
所述的制劑包括口服制劑、液體制劑或外用制劑。其中，口服制劑為片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、顆粒劑或口服液；液體制劑為凍干粉針、注射液、大、小輸液或靜脈滴注液等注射給藥制劑；外用制劑為霜劑或膏劑。
所述的大、小輸液是指均一體銀耳多糖修飾物的氯化鈉或葡萄糖注射劑。
所述的藥學上可接受的載體，包括制劑中常規的稀釋劑、填充劑(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合劑(淀粉、微晶纖維素)，崩解劑(如羧甲基纖維素、低取代的羥丙基纖維素)，潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鎂)，濕潤劑(如丙二醇、乙醇)，抗氧劑(如焦亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉)，防腐劑(苯甲醇)；穩定劑(EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、乙醇胺、碳酸氫鈉、煙酰胺)等等。
上述輔料可以是常用劑量，以常用的配比與均一體銀耳多糖修飾物混合，當銀耳多糖修飾物的用量確定后，各藥用輔料之間的配比可以根據需要適當調節。
各種藥物制劑的制備具體操作如下(1)、按配置總量計稱取含10-70％銀耳多糖修飾物，加入30-90％的填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑等，充分攪拌混合制成顆粒，在60-70℃干燥2-4小時壓制成片，使每片含銀耳多糖修飾物40-240mg；或將制成的濕顆粒直接在60-70℃干燥2-4小時，然后充填入空膠殼中，使每粒膠囊含銀耳多糖修飾物30-280mg。
(2)、注射液和大、小輸液的制備是取0.01-70％的銀耳多糖修飾物與蒸餾水配液，或加入穩定劑，經G4漏斗過濾后，分裝滅菌，制得。
所述的凍干劑是由0.08-50％銀耳多糖修飾物與藥用輔料(乳糖、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖的一種或幾種的組合)混合，較好的藥用輔料是甘露醇，分裝滅菌，制得。
(3)、按配置總量計稱取含10％-60％均一體銀耳多糖修飾物，加入40％-90％的填充劑、崩解劑、矯味劑等，充分攪拌混合用12-14目篩制成顆粒。在60-70℃干燥2-4小時，使每克顆粒劑含銀耳多糖修飾物100-400mg。
(4)、按配置總量計稱取含10％-60％銀耳多糖修飾物，加入40％-90％的填充劑、抗氧劑等，加熱熔融溫度(40-90℃)，使原料和輔料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含銀耳多糖修飾物4-30mg。
本發明的施藥量可根據用藥途徑、給藥方式、患者年齡、體重、疾病類型和嚴重程度等諸多因素加以調整，日劑量一般為0.1～300mg/kg；較好為0.1～100mg/kg；最佳0.1～60mg/kg。
本發明的均一體多糖修飾物具有如下的理化特性1、Sephades G-200層析柱(2.5×33cm)。取樣品STF，15g溶于最小體積的0.9％Nacl中，加入柱頂。用0.9％Nacl洗脫，流速1.5ml/小時，1ml/管分部收集，測定各管含糖量。結果發現STF為單一洗脫峰。
通過對TF經過硫酸酯化的結構修飾，得到兩個硫酸酯化多糖STF-I吡啶∶氯磺酸(1∶1)和STF-II(吡啶∶氯磺酸1∶3)測定其分子量，經過元素分析，測定了其C、H、S的含量。
本發明進一步公開了以均一體銀耳多糖修飾物為活性成分的藥物制劑，在用于制備治療增強免疫、抗腫瘤、抗放射、升高白細胞、抗病毒、抗凝血等藥物中的應用。
下述的藥理實驗進一步說明了均一體銀耳多糖修飾物的藥理活性，及其治療作用。
一抑制牛免疫缺陷病毒(BIV)實驗材料和方法1.材料細胞及病毒胎牛肺細胞(Fetal Bovine Lung，FBL)，牛免疫缺陷病毒R29毒株(Bovine Immunodeficiency Virus R29 strain，BIVR29)試劑與藥品DMEM培養基、青霉素/鏈霉素(P/S)、Trypsin、Tris、EDTA、胎牛血清(美國GIBCO/BRL公司)。AZT購自Sigma公司。(1)陽性對照藥物AZT溶于二甲基亞砜(DMSO)中，用PBS稀釋到濃度0.1mM(0.026mg/ml)，過濾除菌，儲于-20℃。(2)銀耳多糖硫酸酯用PBS稀釋到0.1mg/ml、0.15mg/ml0.2mg/ml三個濃度，過濾除菌，儲于-20℃。
2.方法細胞培養以DEME培養基(1％P/S，10％胎牛血清)在37℃，5％CO2培養箱中培養FBL細胞，細胞傳代所用消化液含0.02％EIDTA 0.25％胰酶。
病毒培養將BIV(R29)感染的FBL細胞(BIV-R29/FBL)與正常的FBL細胞1∶1混合培養，使BIV大量擴增。
藥物對細胞毒實驗(FBL)以40000/孔的密度將FBL細胞鋪于24孔板，24小時后細胞密度增至50000/孔，加入0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml的藥物，以正常細胞為陰性對照，AZT為陽性對照。正常細胞長滿之后(約72小時)，計數每孔細胞數，確定藥物50％致死濃度(IC50)藥物對BIV感染引起合胞體形成抑制實驗以40000/孔的密度將FBL細胞鋪于24孔板，24小時后以2000/孔的密度加入BIV-R29/FBL(MOI＝1∶25)，同時加入待測藥物(濃度<IC50>，以AZT為陽性對照，等體積PBS為陰性對照，72小時后計數合胞體形成數量。
銀耳多糖硫酸酯STF-I對胎牛肺細胞的細胞毒實驗
細胞毒結果銀耳多糖硫酸酯STF-I，IC50＞0.2mg/mlSTF-I對BIV感染引起的合胞體形成的抑制作用
合胞體數與對照孔相近++++合胞體數比對照孔少75％+++合胞體數比對照孔少50％++合胞體數比對照孔少25％+基本無合胞體出現二.抗腫瘤實驗材料與方法1材料動物選擇放射所自繁殖IRM-2純系小鼠，雌雄兼用。
瘤種放射所動物室從IRM-2純系小鼠自發淋巴瘤(病理結論)傳代培養。
藥物配制STF-I設三個劑量組6mg/kg，12mg/kg，24mg/kg，溶劑為蒸餾水。
2方法接種選擇腫瘤生長旺盛且無潰破，健康情況良好的IRM-2小鼠，脫臼處死，固定于手術板上，用碘酒，新潔爾滅消毒動物皮膚，無菌條件下在超凈臺內剝腫瘤，切開腫瘤成直徑2mm左右的小塊，在動物左側腹股溝處皮下接種。
分組給藥接種后次日將動物隨機分組，設對照組及高、中、低四個組，每天給藥一次，腹腔注射，每次0.5ml，對照組給予蒸餾水0.5ml，連續給藥10天。
療效評價停藥后24小時后處死動物，稱體重，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。
腫瘤抑制率C-T/C×100％式中T為給藥組平均瘤重，C為對照組平均瘤重。
銀耳多糖硫酸酯STF-I抑制淋巴瘤試驗
結果STF-I在濃度24mg/kg時，抑瘤率59.8％(P＜0.01)，但毒性較大，低劑量時抑瘤作用不明顯。
三抗放射、升高白細胞試驗。
1.實驗材料1.1動物純種C57小鼠，體重22-24g.
1.1實驗方法1.2.1分組與給藥動物隨機分為五組(15只/組，雌雄各半)對照組、藥物(STF-II)6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四個劑量組。照射前第3、2、1天連續3次給藥，腹腔注射，0.5ml/只，對照組給與生理鹽水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.1.2致傷條件137Cs-γ射線一次全身照射，劑量分別為7.5Gy，劑量率為89.1404倫/分。
觀察指標(1)白細胞數照射后第9天將小鼠頸部脫椎處死，眼眶取血，白細胞稀釋液稀釋，電子顯微鏡下記數細胞數。
(2)DNA含量，照射后第9天將小鼠頸部脫椎處死，取一側股骨，生理鹽水沖洗骨髓。加入反應液，紫外分光光度計上測定吸光度。
(3)CFU-S(Colong forming unit of spleen)將脾臟放入Bouin氏液內，24小時后，肉眼記數突出脾臟表面的結節數(CFU-S)實驗結果銀耳多糖硫酸酯STF-II對輻射損傷小鼠升高白細胞實驗
經統計學處理，60mg/Kg組，DNA(OD/根)，WBC×109/L，CFU-S各項指標，與對照組相比差異顯著。
四、增強免疫力實驗1.實驗材料1.1動物純種C57小鼠，體重22-24g.
1.2實驗方法
1.2.1分組與給藥動物隨機分為五組(15只/組，雌雄各半)對照組、藥物6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四個劑量組。照射前第3、2、1天連續3次給藥，腹腔注射，0.5ml/只，對照組給與生理鹽水，腹腔注射，0.5ml/只。
1.2.2致傷條件137Cs-γ射線一次全身照射，劑量分別為7.5Gy，劑量率為89.1404倫/分。
觀察指標(1)脾指數取出脾臟，稱重，計算脾指數(2)胸腺指數取出胸腺，稱重，計算脾指數銀耳多糖硫酸酯STF-II對輻射損傷小鼠提高免疫力實驗
經統計學處理，60mg/Kg組，脾指數，胸腺指數兩項指標與對照組相比有顯著性差異。
五、抗凝血作用1.實驗材料1.1動物純種C57小鼠，體重22-24g.
1.2實驗方法1.2.1分組與給藥動物隨機分為3組(10只/組，雌雄各半)對照組、藥物6mg/kg、15mg/kg兩個劑量組。尾靜脈注射，0.5ml/只，對照組給與生理鹽水，10分鐘后按全血毛細玻管法測定凝血時間，結果見表。
銀耳多糖硫酸酯STF-II對小鼠凝血時間的影響
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步的描述，但不作為對本發明的限制。
實施例1銀耳多糖修飾物STF-I、STF-II的合成酯化試劑的配制酯化試劑(1)將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入1mL吡啶，充分攪拌使之冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸1mL約30-40分鐘滴加完畢，此時燒瓶中出現大量淡黃色固體，然后再室溫攪拌30分鐘，加熱到50℃，再攪拌到固體溶解。
酯化試劑(2)將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰鹽浴中，加入1ml吡啶，充分攪拌，使之冷卻。用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸3ml，約30-40分鐘滴加完畢，并于室溫攪拌30分鐘。
多糖的酯化<1>取503mg多糖TF，加6ml無水甲酰胺攪拌，恒溫在50℃加酯化試劑(1)，攪拌半小時，反應結束后，室溫放置一天，然后加10ml水，用2.5M的NaOH中和到PH為6-7，過濾，濾液用蒸餾水透析3天。取透析袋內溶液，減壓，回收溶液至少量，加三倍體積的乙醇，析出沉淀。抽濾取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，最后得產品為804mg，命名為STF-I，硫含量為11.28％。
<2>將201mg多糖TF，懸浮于4ml無水甲酰胺中，攪拌30分鐘，然后逐漸加入酯化試劑(2)于45℃攪拌4小時，反應結束后，室溫放置一天，然后加4ml水，用2.5M的NaOH中和到PH為6-7，過濾，濾液用蒸餾水透析3天。取透析袋內溶液，減壓，回收溶液至少量，加三倍體積的乙醇，析出沉淀。抽濾取沉淀，沉淀用乙醚洗，置真空干燥器中，得產品260mg，定名為STF-II，硫含量為11.77％。
實施例2在無菌條件下取銀耳多糖修飾物STF-I18g，置于容器中，加注射用水1000ml，加碳酸鈉1.8g調節PH至5.5-7.5，加入甘露醇50g、乳糖20g，按注射劑的要求進行高壓消毒滅菌，加入1.5g活性碳，采用微孔濾膜過濾，濾液按每只0.6ml進行分裝，采用冷凍干燥法，制得黃色疏松塊狀物，封口即得。
實施例3無菌條件下取銀耳多糖修飾物STF-I100g，加入到注射用水24000ml中，加入60g硫代硫酸鈉攪拌30分鐘，加入30g活性炭，攪拌吸附30分鐘，除炭、精濾、灌封、滅菌，即得注射液。
或無菌條件下取銀耳多糖修飾物STF-I100g，加入注射用水24000ml中，經G4漏斗過濾后，分裝滅菌，制得注射液。
實施例4銀耳多糖修飾物STF-I1000g，藥用淀粉600g，糊精600g，50％乙醇適量，將上述原料充分攪拌混合制成顆粒，在60-70℃干燥2-4小時，制成1000片，使每片含均一體銀耳多糖修飾物0.3g。
實施例5銀耳多糖修飾物STF-II1000g，藥用淀粉1000g，50％乙醇適量，制粒，整粒，烘干，裝1#膠囊，每粒0.2g在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚的了解，在不脫離下述申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案保護范圍內。且本發明亦不受說明書中所舉實施例的實施方式的限制。
權利要求
1.具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物，由下述方法獲得將銀耳孢子發酵物經水煮、醇沉、除蛋白，用凝膠柱層析分離、純化，得到銀耳多糖TF，用酯化試劑進行酯化，制備出如下的銀耳多糖修飾物； 其中，R1＝H or SO3Na、R2＝H or SO3Na；R＝H or SO3Na；n＞10；R、R1、R2不同時＝H。
2.權利要求1所述均一體銀耳多糖修飾物的制備方法，包括(1)將銀耳孢子發酵物水煮提、冷卻、離心，上清液濃縮后加乙醇沉淀，過濾取沉淀，真空干燥得粗多糖；再加水煮提，冷卻、離心，上清液用sevage法除蛋白，用乙醇沉淀；過濾取沉淀，真空干燥，得精制多糖后凝膠柱層析分離、純化，得到均一體銀耳多糖TF；(2)取銀耳多糖TF，加入無水甲酰胺，在30-80℃加入酯化試劑，攪拌，室溫放置，用NaOH中和至PH6-7，過濾，濾液用蒸餾水透析，乙醇析出沉淀，制得STF。
3.如權利要求2所述的均一體銀耳多糖修飾物的制備方法，其特征在于，所述的酯化試劑為吡啶∶氯磺酸0.1∶1-30V/V。
4.一種以均一體銀耳多糖修飾物為活性成分的制劑，該制劑含有治療有效量的銀耳多糖修飾物，及一種或一種以上的藥學上可接受的載體。
5.如權利要求4所述的制劑，其中，均一體銀耳多糖的治療有效量為0.1-500mg。
6.如權利要求4所述的制劑，其中，均一體銀耳多糖的治療有效量為1-200mg。
7.如權利要求4-6所述的制劑，其中，該制劑包括口服制劑、液體制劑或外用制劑。
8.如權利要求7所述的制劑，其中，口服制劑為片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、顆粒劑或口服液；液體制劑為凍干粉針、注射液、大、小輸液或靜脈滴注液等注射給藥制劑；外用制劑為霜劑或膏劑。
9.均一體銀耳多糖修飾物在用于制備增強免疫、抗腫瘤、抗放射、升高白細胞、抗病毒、抗凝血藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及具有多種生物活性的均一體銀耳多糖修飾物，及其制備方法和含它們的制劑。銀耳多糖修飾物的制備方法取均一體多糖TF，加入無水甲酰胺，在30－80℃加入酯化試劑，攪拌，室溫放置一天，然后用NaOH中和到PH為6－7，過濾，濾液用蒸餾水透析，乙醇析出沉淀，得化合物STF。本發明的均一體銀耳多糖修飾物具有一定的抑制牛免疫缺陷病毒感染引起的合胞體形成的作用；對IRM－2小鼠的淋巴瘤有較好的抑制作用，還具有升高白細胞、抗凝血、提高免疫力等作用。因此，均一體銀耳多糖修飾物作為一個多功能的藥物，具有抗腫瘤、抗病毒，抗凝血等作用。
文檔編號A61K31/715GK1778823SQ20041007286
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者徐文清, 李美佳, 劉培勛, 周則衛, 沈秀, 王月英 申請人:中國醫學科學院放射醫學研究所