專利名稱：一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法及其制品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種疫苗的制備方法及其制品，更具體地說涉及一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活苗的方法及其制品，屬于生物技術領域。
背景技術：
鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic 0varitis，DH0)是一種新近流行的、急性、高度接觸性鴨傳染病，其病原為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus, DHOV)，在病毒分類上屬于黃病毒科的成員。該病毒感染不同日齡鴨，產蛋鴨主要表現采食量急劇下降，產蛋率急劇下降，部分鴨出現癱瘓現象。剖解病變主要表現為卵巢出血，卵泡變形、變性，卵巢、卵黃、睪丸、輸卵管和輸精管萎縮，肝臟表面有粟粒狀結節。商品肉鴨表現為死淘率增加。新近科學研究情況在病毒分類地位的研究中，曹貞貞、張存等人通過對鴨出血性卵巢炎病毒與黃病毒屬恩塔亞病毒群(Ntay a virus group，NTAV群)和乙型腦炎病毒群 (Japanese encepHalitis virus group，JEV群)中選NSl序列已知的病毒進行序列同源性分析和進化分析，發現該病毒與黃病毒科黃病毒屬的巴格扎病毒的遺傳距離位于病毒分類學種的水平。蘇敬良、萬春和、施少華等人的研究也表明分離獲得的引起種(蛋)鴨產蛋驟降新病毒的核苷酸序列第9 777位與坦布蘇病毒(TMUV)的同源性最高，為88. 7% ；遺傳進化分析表明WR株病毒與坦布蘇病毒、圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、以色列火雞腦膜炎病毒 (ITV)、恩塔亞病毒(NTAV)具有相似的祖先。在診斷方面，曹貞貞、萬春和、蘇敬良、滕巧泱等人報道可以采用臨床癥狀、大體及組織病理變化、PCR擴增和病毒分離等方法確診該病。該病的流行情況2010年4月，自中國浙江首先發現以產蛋鴨產蛋量急劇下降為主要特征的疾病以來，先后在江蘇、山東、河北、北京等省市發生類似的疾病。鴨出血性卵巢炎已經成為近期危害中國養鴨業的主要疫病之一。各種蛋鴨、櫻桃谷種鴨和臺灣白改種鴨均有發生，但主要見于開產蛋鴨。受染鴨群幾乎100%發病，死亡率為5% 30%不等，蛋鴨產蛋率由80%以上下降至109Γ30%甚至10%以下，嚴重者停產，雖然產蛋率可逐漸恢復，但從發病至恢復正常，約需廣2月；種鴨發病后種蛋的受精率和孵化率降低；商品肉鴨感染后死淘率明顯增加。因此，該病給養鴨業帶來巨大的經濟損失，這使得養鴨業一度陷入絕境。疾病的防控目前，鴨出血性卵巢炎發生后，養殖戶通常采用的控制措施是藥物防治，大劑量使用各種抗菌素和抗病毒藥，但往往無濟于事，在部分鴨場甚至出現藥物中毒的現象進一步增加了疫病的嚴重性。專家推薦的防治該病有效措施是注射疫苗，但目前尚未找到較好的疫苗株、大規模和高效價培養病毒的細胞系，疫苗評價模型尚未建立，制約著目前疫苗的開發。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術之缺陷提供一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法及其產品。本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，所述細胞系選自倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系。上述方法，它包括如下步驟
(1)選育毒株將鴨出血性卵巢炎病毒鴨胚適應株在細胞系中連續傳代培養3次，取傳代適應毒株利用蝕斑純化技術對其連續純化培養三次，選取在倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系中培養效價高、免疫原性好的毒株作為候選病毒株；
(2)建立毒種種子批將步驟(1)所得候選株病毒接種至細胞系中，傳代培養至第15 代，取第5 15代作為毒種種子批；
(3)制備細胞毒液棄去形成良好單層細胞的細胞生長液，接種步驟(2)所得毒種種子批，吸附0. 5 Ih后，加入細胞維持液，繼續培養，48 120h后細胞病變(CPE)達到80%以上時收獲細胞毒液，該細胞毒液病毒含量彡IO6 5 TCID5tZlml ；
(4)滅活病毒取步驟(3)所得細胞毒液凍融兩次后，加入細胞毒液總量(V/V)0.1 0. 2%的滅活劑，在37°C下振蕩滅活16 Mh ；
(5)洗滌與濃縮細胞毒液將步驟(4)所得滅活好的細胞毒液濃縮至原來體積的1/2， 然后用等量PH值為7. 0 7. 2的PBS溶液洗滌，再進行濃縮，如此反復2 3遍，隨后進行最后一次濃縮，將細胞毒液濃縮為原來體積的1/5 1/10，細胞毒液蛋白含量應不大于 400ug/ml ；
(6)乳化向步驟(5)所得濃縮好的細胞毒液加入(V/V)4% 8%吐溫80，攪拌均勻為水相，按照油相與水相的體積比1. 5 3 :1進行乳化，乳化后即得成品。上述方法，所述蝕斑純化技術為0. 1%中性紅蝕斑純化技術。 上述方法，所述細胞生長液的組成為體積百分含量90% 92% DMEM液、8% 10% 新生牛血清，pH值調整為7. 2 7. 4。上述方法，所述接種的劑量為細胞生長液體積的0. 3% 1. 0%。上述方法，所述細胞維持液的組成為體積百分含量95% 98% DMEM液、2% 5% 新生牛血清，pH值調整為7. 2 7. 4。上述方法，所述滅活劑為質量濃度37%的甲醛溶液。上述方法，所述濃縮中其使用截留分子量50kd的密里博超濾膜包進行超濾濃縮。上述方法，所述油相的制備方法為在白油中按(V/V)4% 8%加入司班80，按(W/ V) 1% 洲加入硬脂酸鋁，滅菌后即得油相。一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，它采用由上述所述的方法制備而成。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
(1)鴨出血性卵巢炎病毒用本發明篩選的倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系進行培養，病毒適應性好、效價高；
⑵經蝕斑克隆純化篩選出的候選病毒株效價高、免疫原性好；
(3)細胞毒液先滅活后濃縮，減少了強毒的擴散幾率，具有更好的安全性；
(4)細胞毒液滅活后用PBS去除殘留的甲醛和雜蛋白，使疫苗的副作用降低，減小對鴨尤其是產蛋鴨生產性能的影響，提高了疫苗的安全性；(5)用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗批間質量差異小，具有生產工藝簡單穩定、 易操作、產量大、成本低、外源病毒污染幾率小等特點，具備工業化大生產的可行性和可放大性，具有很好的經濟效益和應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的描述。實施例1病毒適應性細胞系的篩選
根據病毒特性選擇牛胚腎細胞系(MDBK)、倉鼠腎細胞系(BHK21)、豬腎細胞系(PK15)、 非洲綠猴腎細胞系(Vero)4種細胞系分別進行鴨出血性卵巢炎病毒HB株的傳代培養，篩選鴨出血性卵巢炎病毒適應性細胞系。4種細胞均購自中國獸醫藥品監察所。鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCC V201122，2011年7月1日保藏于中國典型培養物保藏中心。所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ；該病毒對外界環境的抵抗力較強，在4°C中存放幾周，在_20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；該病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在37°C條件下， 用0. 福爾馬林熏蒸他便可把它滅活；該病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細胞，可以凝集 1%鴿紅血球；所述病毒可在9 13日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養。1實驗方法
用鴨出血性卵巢炎病毒HB株鴨胚適應株分別接種上述4種細胞系，連續傳代6次后觀察細胞病變，用免疫熒光法(IFA)檢測病毒細胞培養物是否有鴨出血性卵巢炎病毒，出現細胞病變的細胞系對其病毒培養物進行效價檢測。2實驗結果
鴨出血性卵巢炎病毒HB株不能在牛胚腎細胞系(MDBK)、豬腎細胞系(PK15)中增殖，可以在倉鼠腎細胞系(BHK21)、非洲綠猴腎細胞系(Vero)中增殖并產生細胞病變(結果見表 1)。表1應用不同細胞系傳代培養結果
權利要求
1.一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，所述細胞系選自倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步驟(1)選育毒株將鴨出血性卵巢炎病毒鴨胚適應株在細胞系中連續傳代培養3次，取傳代適應毒株利用蝕斑純化技術對其連續純化培養三次，選取在倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系中培養效價高、免疫原性好的毒株作為候選病毒株；(2)建立毒種種子批將步驟(1)所得候選株病毒接種至細胞系中，傳代培養至第15 代，取第5 15代作為毒種種子批；(3)制備細胞毒液棄去形成良好單層細胞的細胞生長液，接種步驟(2)所得毒種種子批，吸附0. 5 Ih后，加入細胞維持液，繼續培養，48 120h后細胞病變CPE達到80%以上時收獲細胞毒液，該細胞毒液病毒含量彡IO6 5 TCID5tZlml ；(4)滅活病毒取步驟(3)所得細胞毒液凍融兩次后，加入細胞毒液總量(V/V)0. 1 0. 2%的滅活劑，在37°C下振蕩滅活16 Mh ；(5)洗滌與濃縮細胞毒液將步驟(4)所得滅活好的細胞毒液濃縮至原來體積的1/2， 然后用等量PH值為7. 0 7. 2的PBS溶液洗滌，再進行濃縮，如此反復2 3遍，隨后進行最后一次濃縮，將細胞毒液濃縮為原來體積的1/5 1/10，細胞毒液蛋白含量應不大于 400ug/ml ；(6)乳化向步驟(5)所得濃縮好的細胞毒液加入(V/V)4% 8%吐溫80，攪拌均勻為水相，按照油相與水相的體積比1. 5 3 :1進行乳化，乳化后即得成品。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述蝕斑純化技術為0.1%中性紅蝕斑純化技術。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述細胞生長液的組成為體積百分含量 90% 92%的DMEM液、8% 10%新生牛血清，pH值調整為7. 2 7. 4。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述接種的劑量為細胞生長液體積的 0. 3% 1. 0%。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述細胞維持液的組成為體積百分含量 95% 98% DMEM液、2% 5%新生牛血清，pH值調整為7. 2 7. 4。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述滅活劑為質量濃度37%的甲醛溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述濃縮中其使用截留分子量50kd的密里博超濾膜包進行超濾濃縮。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述油相的制備方法為在白油中按(V/ V) 4% 8%加入司班80，按(W/V) 1% m加入硬脂酸鋁，滅菌后即得油相。
10.一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗制品，其特征在于，它采用如權利要求1 9任一權利要求所述的方法制備而成。
全文摘要
一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法及其制品，屬于生物技術領域。本發明所述方法中的細胞系選自倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系，并經過(1)選育毒株、(2)建立毒種種子批、(3)制備細胞毒液、(4)滅活病毒、(5)洗滌與濃縮細胞毒液、(6)乳化等步驟完成疫苗的制備。本發明方法具有生產工藝簡單穩定、易操作、安全性高等特點，制備的鴨出血性卵巢炎滅活疫苗質量高、產量大、成本低、批間差異小、安全性好、免疫效力高。
文檔編號A61P31/14GK102488893SQ20111044736
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者何平有, 劉月煥, 劉濤, 徐倩倩, 楊保收, 林健, 毛雅元, 韓春華 申請人:瑞普(保定)生物藥業有限公司