用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用與流程

本發明涉及免疫學和生物學領域，涉及一種用于預防羊弓形蟲感染的亞單位滅活疫苗和制備方法及其應用，主要涉及一種用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用。

背景技術：

弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種世界性分布的人獸共患寄生蟲病。弓形蟲病已成為我國亟待解決的重要公共衛生問題之一，其原因主要體現在以下幾點：一、人類弓形蟲感染率極高，一般為20%～50%，最高達94%，全球約有1/3的人感染弓形蟲，我國人群弓形蟲感染率為5%～20%。孕婦感染弓形蟲可影響胎兒的發育，嚴重者致畸甚至死亡，同時造成孕婦流產或早產；對于免疫抑制或免疫缺陷的病人，弓形蟲更是一個主要的機會性致病因素。據報道，孕婦感染弓形蟲后有30%～46%的機率將其傳播給胎兒，引起胎兒先天性感染，造成流產、死胎或先天性弓形蟲病；有6%～10%的艾滋病患者并發弓形蟲病，而且艾滋病病人所患腦炎中有50%是由弓形蟲感染所引起的。孕產婦和腫瘤患者弓形蟲抗體陽性率高達10%～60%。二、貓、犬、豬、羊、牛、兔等家畜感染弓形蟲非常普遍，其感染率高達10%～50%，豬、牛、羊的流產率達到 30-40.7%；豬感染弓形蟲還可引起“無名高熱”，病死率達60%，因此弓形蟲病是造成家畜流產的重要因素之一，影響畜牧業生產。三、犬貓作為伴侶動物更是掀起一陣"犬貓寵物熱"，犬作為弓形蟲的重要中間宿主，貓作為唯一終末宿主，與人接觸親密，成為人類弓形蟲病的主要傳染源。四、弓形蟲可以感染所有的有核細胞，(豬牛羊雞鴨鵝等)動物感染率平均為15.4%，感染后弓形蟲以緩殖子形式遍布全身各個組織。這就造成弓形蟲很容易經肉、乳、蛋類大量流入食品市場，成為人類的傳染源，嚴重威脅著動物性食品的公共衛生安全。

然而，迄今為止國內外仍然沒有理想的商品化防治弓形蟲病的疫苗和藥物，弓形蟲感染后可引起宿主保護性免疫應答，因此研制安全、有效的疫苗應是弓形蟲病良好的預防措施。弓形蟲疫苗的研制從60年代開始經歷了全蟲疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和核酸（或DNA）疫苗等幾個階段。全蟲疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗，但滅活疫苗對小鼠缺乏免疫保護性，因此無實際應用價值；弓形蟲速殖子經紫外線、放射線及化學試劑等處理后毒力減弱，能誘導較強的免疫應答，如Ts-4、T-263和S48，但減毒活疫苗存在減毒不充分和毒力返祖等危險，因此弱毒疫苗不能廣泛使用；亞單位疫苗是從蟲體裂解物或排泄-分泌抗原中提取特定組分作為疫苗，具有較好的免疫原性，但純化費時、費力，并且價格昂貴；基因工程疫苗是將弓形蟲抗原基因在高效表達載體中表達，從而得到大量純化的單一抗原。綜合以上論述可以發現，基因工程疫苗是弓形蟲疫苗發展的希望，具有潛在的開發應用價值。

技術實現要素：

針對目前問題，本發明提供一種用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用，利用基因工程技術，克隆出弓形蟲HMG1基因，并將HMG1基因基因轉入工程菌進行表達，經誘導后重組抗原獲得高效表達，并對重組抗原的特異性和免疫原性進行生理性研究，表現良好的免疫原性。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：

本發明第一個目的是提供一種核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列為序號（1）或（2）或3中任意一種所述核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列；

（2）與（1）中所示的核苷酸序列互補的核苷酸序列；

（3）與上述（1）或（2）所述核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列。

本發明第二個目的是提供一種載體，其特征在于，所述載體包括序號（1）或（2）或（3）所述任意一種核苷酸序列；所述載體為pET28a表達載體。

本發明第三個目的是提供一種可溶性融合蛋白，其特征在于，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列由權利要求2所述的載體編碼。

較佳地，所述一種可溶性融合蛋白包括弓形蟲VEG株 HMG1蛋白，以及組氨酸純化標簽；其中編碼所述弓形蟲（VEG株）HMG1蛋白的DNA序列選自SEQ ID NO.1；所述的純化標簽的氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

優選，可溶性融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

本發明第三個目的是提供一種宿主細胞，其特征在于，含有權利要求2所述的載體，或已用權利要求1所述的核苷酸序列轉化或轉染。

本發明第四個目的是提供一種制備可溶性融合蛋白的方法，其特征在于，包括通過宿主細胞表達可溶性融合蛋白，并進行分離。

本發明第五個目的是提供一種疫苗，其特征在于，所述疫苗包括權利要求1中序號（1）或（2）或（3）所述任意一種的核苷酸序列，以及醫學上可接受的載體。

優選，所述疫苗是將弓形蟲抗原雙酶切后連接到pET28a表達載體，轉化入BL21(DE3)工程菌，誘導其高效表達，純化后得到的蛋白為可溶性融合蛋白，再添加206佐劑，制備而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，適合于工業化生產。

亞單位滅活疫苗適用于對2-3歲齡成年綿羊或懷孕1個月內的綿羊進行免疫注射。

本發明的優點在于：選用了弓形蟲有效地抗原基因進行亞單位滅活疫苗的研制，根據該抗原基因具有與哺乳動物抗原非常相似的“TNF-α信號多肽區”，因此該抗原制備的亞單位滅活疫苗具有較強的細胞免疫和體液免疫效果，能夠誘導機體的先天性免疫應答，分泌各種細胞炎性因子，從而有效的預防弓形蟲病。

附圖說明

圖1.弓形蟲HMG1基因ORF擴增結果。

附圖中：M, DL10000 marker; HMG1，目的基因片段。

圖2.弓形蟲HMG1 基因重組表達蛋白的可溶性分析SDS-PAGE結果。

附圖中：M, 蛋白marker; S+, 菌體經可溶性裂解也裂解后可溶性成分；

S－，菌體經可溶性裂解也裂解后剩余的不可溶性成分。

圖3.弓形蟲HMG1 基因重組表達蛋白純化SDS-PAGE結果。

附圖中：M, 蛋白marker; r, 重組HMG1蛋白。

圖4.弓形蟲HMG1重組蛋白刺激小鼠RAW264.7細胞產生TNF-α水平。

圖5.弓形蟲HMG1重組蛋白刺激小鼠樹突狀細胞產生IL-12水平。

圖6.弓形蟲HMG1重組蛋白疫苗對小鼠抗弓形蟲感染的保護作用。

圖7.弓形蟲HMG1重組蛋白疫苗對綿羊抗弓形蟲感染導致流產的保護作用。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1：弓形蟲重組蛋白原核表達載體的構建

參照弓形蟲HMG1基因序列開放型閱讀框和原核表達載體pET28a物理圖譜設計引物并引入酶切位點。

上游：GGAATTCGCACCGAAGAAGGTGACAAAGAAG

下游：CCCTCGAGTTTCTTCTTGTTGTAGAGAGAG

用RNA提取試劑盒提取弓形蟲滋養體總RNA， RT-PCR試劑盒擴增HMG1基因（通用RT參數為：37℃ 60min; 65℃ 20min; 4℃ 5min。 PCR參數為： 95℃ 3min；94℃ 1min；59.5℃ 40s，72℃ 1min，30個循環后于72℃延伸10min），將PCR純化產物克隆至pGEM-T vector system 經酶切和測序鑒定陽性克隆菌，陽性質粒經EcoRI和XhoI進行雙酶切后純化的目的片段連接到原核表達載體pET28a，將連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞后篩選重組質粒，用EcoRI和XhoI進行雙酶切反應鑒定，獲得原核表達質粒pET28a-HMG1。將pET28a-HMG1轉化入BL21(DE3)工程菌，挑取單個菌落接種到3ml LB 液體培養基中( 含100μg/ml 卡那霉素) 中,37℃，200rpm 振蕩培養過夜，按1：100 轉接種到10ml 含相同濃度抗生素LB液體培養基中，37℃，200rpm 振蕩培養4h，加入終濃度為1mM 的 IPTG，37℃，200rpm誘導4h，最后通12%SDS-PAGE檢測表達情況，其結果見附圖1。

實施例2：表達蛋白的純化

（1）表達蛋白的提取及可溶性驗證

以選取的轉化了重組質粒pET-28a(+)-HMG1的E.coli BL21(DE3)單菌落為出發菌種接種于8 mL LB液體培養基中，37℃過夜振蕩培養。次日將種子液轉接到400mL LB液體培養基中37℃擴繁，監測菌液OD600至0.6～0.7時，在最適條件下誘導表達。離心收集菌體，菌體用10mL可溶性蛋白裂解液懸浮，加入100μL 0.1M PMSF，反復凍融3次（-80℃,1h / 37℃,10min）后，經超聲處理，或加入100μL DNase和100μL 100× DNase Buffer 及100μLRNase，37℃水浴15min，離心取上清即為可溶性蛋白（具有活性的蛋白）。沉淀用10mL不可溶性蛋白純化裂解液A懸浮，室溫振搖1h，離心取上清即為非可溶性蛋白（變性蛋白）。將上述兩種蛋白分別進行SDS-PAGE檢測以驗證目的蛋白的可溶性，若目的蛋白主要位于可溶性蛋白上清，說明為可溶性表達；若目的蛋白大部分位于非可溶性蛋白性蛋白上清液中，則說明為包涵體形式表達，其結果見附圖2。

（2）融合表達蛋白的純化

向蛋白所在的10mL裂解上清液中加入2mL 50% Ni-NTA 混懸液，在旋轉搖床上以轉速200rpm緩慢震蕩1-2h ；將全部懸液倒入帶底蓋和帽的柱子中（QIAGEN），打開底蓋，用柱帽輕壓一下柱子，移去柱帽，使液體靠重力緩慢滴下，收集流出的混懸液，以備SDS-PAGE檢測是否還有未被綁定的蛋白。用裂解液清洗灌有Ni-NTA的柱子，每次1mL，用NANODROP 1000 spectrophotometer檢測蛋白在OD280時的濃度，反復沖洗至檢測不到蛋白；換洗液后以同樣的方法洗Ni-NTA柱，并用NANODROP檢測蛋白濃度；當檢測不到蛋白時，用蛋白溶解液溶解蛋白，每次0.5mL上柱，每次流出的溶液收集到新的1.5mL離心管中，此時得到即為純化后的表達蛋白，溶解至用NANODROP檢測不到，通過SDS-PAGE檢測蛋白純度，BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，其結果見附圖3。

實施例3：表達產物對小鼠巨噬細胞免疫原性檢測

將RAW264.7細胞以0.5x106/mL 接種到24孔培養板上，每孔1mL，5% CO2，37℃培養24h。吸出上清后將制備好的弓形蟲重組HMG1蛋白溶于RAW264.7細胞培養液中，并按1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的濃度，按1mL/孔添加至細胞培養板中，試驗中用等體積的空白質粒純化蛋白NR 作為陰性對照。將細胞培養板置于5% CO2，37℃培養箱中培養48h，收集上清液，通過ELISA實驗檢測TNF-a水平。結果表明TNF-a的產生程度不同，并且TNF-a的量隨蛋白濃度的增高而增加，范圍從180pg-520pg不等，結果見附圖4；從結果中說明該重組蛋白可以刺激RAW264.7細胞產生TNF-a。

實施例4:表達產物對小鼠樹突狀細胞免疫原性檢測

分離小鼠樹突狀細胞，調整細胞濃度為0.5x106個/mL，接種至48孔組織細胞培養板中，每孔接種0.5mL。將處理的重組蛋白分別以每孔1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的濃度添加至細胞培養板中。將細胞培養板置于5% CO2，37℃培養箱中培養24h，收集培養上清液，通過ELISA實驗檢測上清液中IL-12水平。結果表明各組產生IL-12含量不同，且呈現蛋白濃度依賴性其結果見附圖5，結果說明該重組蛋白可以刺激小鼠樹突狀免疫細胞產生大量的IL-12。

實施例5: 弓形蟲重組亞單位疫苗在實驗小鼠應用研究

將100只6～8周齡左右，18～22g的雌SPF級BALB/c小鼠分成4組，每組25只，其中第一組HMG1實驗組(佐劑為弗氏佐劑，30 μg/只，皮下注射)，第二組為陽性對照組（30 μg/只弓形蟲GRA1重組蛋白，配以弗氏佐劑，皮下注射），第三組為陰性對照組（相等體積量的空白表達載體純化蛋白，配以弗氏佐劑，皮下注射），第四組為空白對照組（相等體積量的PBS，皮下注射）。各組注射三次，間隔兩周。第三次免疫注射一周后腹腔注射純化的弓形蟲滋養體103個/只，每天觀察記錄小鼠狀況。

免疫保護性試驗結果顯示實驗組免疫保護率明顯優于陰性對照組和空白對照組，且優于陽性對照組（見圖6）。

實施例6:弓形蟲重組亞單位疫苗在哺乳動物應用研究

將30只懷孕1個月的綿羊（2~3歲齡），分成2組，第一組20只，為 HMG1實驗組(佐劑為206佐劑，200 μg/只，肌肉注射)，第二組10只，為陰性對照組（相等體積量的空白表達載體純化蛋白，配以206佐劑，肌肉注射），各組注射三次，間隔三周。第10周靜脈注射純化的弓形蟲滋養體104個/只，每天觀察記錄綿羊流產保護狀況，其結果見附圖7。結果表明實驗組的流產保護狀況明顯高于陰性對照組。

綜合上述實驗結果，本發明提供的一種弓形蟲亞單位滅活疫苗，對弓形蟲免疫保護率較高，可以用來作為弓形蟲病的預防和治療性候選疫苗。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 艾堪生物科技（天津）有限公司

<120> 用于預防羊弓形蟲感染的核苷酸序列、載體、蛋白、疫苗和制備方法及其應用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaccga agaaggtgac aaagaaggga acagagggga agaagaagcg cgcaaagaag 60

gaccccaacg ctcccaagaa gcctctttcg tcttacatgt ttttcgcaaa ggacaagcgg 120

gccgaaatcc tcaagaaaca gcctagtctc aagtccgaca tcggcaaggt ggggaagatg 180

atcggcgagg aatgggcaaa gctaagctca tcgcagaaaa tgacttacca aaagaaagct 240

gagcaagaga aaatcagata tcaacgtgaa atgtctctct acaacaagaa gaaatga 297

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Val Thr Lys Lys Gly Thr Glu Gly Lys Lys Lys

1 5 10 15

Arg Ala Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Lys Pro Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Phe Phe Ala Lys Asp Lys Arg Ala Glu Ile Leu Lys Lys Gln Pro

35 40 45

Ser Leu Lys Ser Asp Ile Gly Lys Val Gly Lys Met Ile Gly Glu Glu

50 55 60

Trp Ala Lys Leu Ser Ser Ser Gln Lys Met Thr Tyr Gln Lys Lys Ala

65 70 75 80

Glu Gln Glu Lys Ile Arg Tyr Gln Arg Glu Met Ser Leu Tyr Asn Lys

85 90 95

Lys Lys

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 標簽蛋白

<400> 3

His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His

1 5 10 15

Ile Ser。