專利名稱：基于病毒顆粒的鼻內流感疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及，例如，用于滅活流感疫苗的組合物以及給藥方式，其中，單次鼻內或吸入給藥獲得了與臨床保護正相關的全身性免疫應答。
背景技術：
通過鼻內或口咽途徑及使用滅活流感抗原針對流感進行免疫的多種設想已作為皮下或肌肉內免疫的非注射(無針頭needle-less)替代途徑被研究。已在動物模型中產生了支持非注射手段的實驗數據。得到動物數據支持的、使用滅活流感抗原(例如化學方式滅活的完整病毒粒子，或者被進一步加工的病毒組分，例如被切開的病毒，或者經純化的表面抗原血細胞凝集素(HA)和/或神經氨酸酶(NA))經鼻內途徑進行免疫的思路包括使用佐劑或免疫刺激劑(immune stimulator)與滅活流感抗原組合,或者需要多次免疫。佐劑是能增強與其混合的抗原的免疫原性的任何物質。在人類中，通過鼻內途徑抵抗流感的成功疫苗接種僅報道過(a)活的(冷適應性的株)流感疫苗(FluMist ,MedImmune Vaccines Inc)(參考文獻1、2、3)，(b)病毒顆粒型流感疫苗，其佐有大腸桿菌(E. coli)的熱不穩定毒素(NasalFlu, Berna Biotech Ltd)(參考文獻4)或(C)使用高劑量抗原并且重復疫苗接種(參考文獻5、10、11)。雖然活疫苗能誘導滿意的免疫應答，但其能變成活病毒的特定性質帶來了額外的安全顧慮，而且由于需要在上呼吸道附近的病毒復制，因此有可能會誘導出副作用。此外，所需的貯藏條件也限制了這些產品的商業化。使用大腸桿菌HLT作為佐劑的鼻內流感疫苗與面癱(Bell’ s Palsy)之間的強烈相關性導致佐有HLT的病毒顆粒疫苗從市場撤出(參考文獻6)。流感疫苗在給定人群中的療效可通過下述方法來評估評定與接種后產生的抗流感抗體的數量相關的免疫原性參數。這些免疫原性參數通常被稱為CHMP標準，其用于對滅活流感疫苗進行每年重新許可認證(參考文獻7)。至今為止，通過使用滅活疫苗的一次單次鼻內施予，不加佐劑(其是疫苗中的附加成分，其不來自將用疫苗來預防的感染性試劑， 并且是為了增強對抗原的免疫應答的目的被加入到疫苗制劑中)，就符合這些免疫學要求或者CHMP標準(參考文獻7)的、對人類抵抗流感的成功免疫尚未有記載。因此，人們認識到，在本領域中仍有對下述滅活流感疫苗組合物的需求，所述組合物能在單次鼻內給藥之后誘導滿意的全身性免疫反應，并且不含佐劑，且通過所述單次給藥能符合CHMP標準(參考文獻7) ο所述“CHMP標準”按照下文所述被定義。在CHMP(Committee for Medicinal Products for Human Use)的 Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines中，定義了下述血清學參數，以評定滅活流感疫苗的免疫原性-血清保護率，其中血清保護被定義為紅血球凝聚抑制(Haemagglutination Inhibition, HI)效價> 40,
-血清轉化率，其中血清轉化被定義為接種前HI效價<10，接種后HI效價> 40， 或者，接種前HI效價> 10以及HI效價至少4倍的增加，-平均倍數增加值，這是對受試者內增加的幾何平均值(即，接種后HI效價/接種前HI效價)。針對流感疫苗免疫原性的CHMP要求是對于疫苗中三種病毒株中的每種而言，符合下述標準中的至少一項本發明還適用于兒童，從他們顯示出，他們以與成年人相當的方式作出免疫應答 (參考文獻8)。本發明還適用于老年受試者。老年人為超過60歲的。發明描述本發明涉及I.包含流感病毒顆粒的組合物，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向所述重構病毒顆粒加入脂類，其中所述病毒顆粒包含所述流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述組合物作為鼻內或吸入給藥制劑來設計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內或吸入給藥能誘導抵抗所述流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應答和/或局部免疫應答。2.如項目I所述的組合物，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量低于或等于30 μ g。3.如項目I或2中任意一項所述的組合物，其中所述制劑的單次鼻內或吸入給藥還能誘導細胞毒性淋巴細胞應答。4.如項目I至3中任意一項所述的組合物，其中所述免疫應答符合針對流感疫苗的CHMP標準。5.如項目4所述的組合物，其中所述免疫應答提供下述中的一種或多種對成年人而言> 70%和/或對老年人而言> 60%的血清保護率，針對成年人> 40%和/或針對老年人> 30%的血清轉化率，以及針對成年人> 2. 5和/或針對老年人> 2. O的平均倍數增加。6.如項目2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于25 μ go7.如項目2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于20 μ go8.如項目2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于15 μ go9.如項目2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于10 μ go10.如項目2至5中任意一項所述的組合物，其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于5 μ g。11.如項目I至10中任意一項所述的組合物，其中，所述組合物是包含用于鼻內或吸入給藥的藥物載體的疫苗制劑。12.包含所述病毒的重構包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內或吸入給藥的組合物的用途，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向所述重構病毒顆粒加入脂類，其中所述病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，所述組合物特征在于所述組合物向人類的單次鼻內或吸入給藥足以誘導抵抗所述流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應答和/或局部免疫應答。13.如項目12所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ g。14.如項目12或13中任意一項所述的用途，其中所述制劑的單次鼻內或吸入給藥還誘導細胞毒性淋巴細胞應答。15.如項目12至14中任意一項所述的用途，其中所述免疫應答符合針對流感疫苗的CHMP標準。16.如項目15所述的用途，其中所述免疫應答提供下述中的一種或多種對成年人而言> 70%和/或對老年人而言> 60%的血清保護率，針對成年人> 40%和/或針對老年人> 30%的血清轉化率，以及針對成年人> 2. 5和/或針對老年人> 2. O的平均倍數增加。17.如項目13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于25 μ go18.如項目13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于20 μ go19.如項目13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于15 μ go20.如項目13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于10 μ go21.如項目13至16中任意一項所述的用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于5 μ g。22.如項目12至21中任意一項所述的用途，其中制備的組合物是疫苗制劑。23.包含流感病毒顆粒的組合物的疫苗制劑，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，該疫苗特征在于針對向人類的單次鼻內或吸入給藥來設計所述疫苗，并且其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ go24.如項目23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于25 μ g。25.如項目23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于20 μ g。26.如項目23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于15 μ g。27.如項目23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于10 μ g。28.如項目23所述的疫苗制劑，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的劑量低于或等于5 μ g。29.如項目23至28中任意一項所述的疫苗制劑，其中所述制劑的單次鼻內或吸入給藥能在所述人類中誘導免疫應答，所述免疫應答包括抵抗流感抗原血細胞凝集素和/ 或神經氨酸酶或其衍生物的全身性免疫應答，抵抗流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的局部免疫應答，以及細胞毒性淋巴細胞介導的免疫應答中的一項或多項。30.如項目29所述的疫苗制劑，其中所述免疫應答符合針對流感疫苗的CHMP標準。31.如項目30所述的疫苗制劑，其中，所述免疫應答提供下述中的一種或多種對成年人而言> 70 %和/或對老年人而言> 60 %的血清保護率，針對成年人> 40 %和/或針對老年人> 30%的血清轉化率，以及針對成年人> 2. 5和/或針對老年人> 2. O的平均倍數增加。32.用于鼻內或吸入給藥的裝置，所述裝置包含根據項目23至31中任意一項所述的疫苗制劑。33.如項目32所述的裝置，其中，所述裝置包含一定量的用于單次鼻內或吸入給藥的疫苗制劑。34.如項目32或33述的裝置，其中，所述裝置是一次性的。令人吃驚地，與臨床前嚙齒類數據和關于人類臨床經歷的文獻相反，我們發現，對于18-60歲年齡組而言，用包含重構流感病毒包膜的滅活流感疫苗進行單次鼻內接種后， 人類的免疫應答符合針對流感疫苗療效的全部三個CHMP標準。一次單次鼻內施予是為符合針對滅活流感疫苗免疫原性的上述CHMP標準，通過一個或兩個鼻孔進行疫苗制劑的接種，而無需重復施予疫苗制劑。一次單次疫苗施予(通過鼻、吸入、口服、皮下或肌內途徑) 通常是下述接種安排，其不包括在本領域作為初次(priming)和強化(boosting)而已知的、以數天或數周的時間間隔對疫苗的多次施予。被設計為鼻內或吸入給藥制劑的制劑包含一種或多種活性組分和賦形劑的混合物，是按照允許鼻內或吸入給藥的方式制備的。本發明提供了一種方法，用于誘導符合CHMP標準的全身性免疫應答(循環的免疫球蛋白或產生抗體的B細胞)，有利地，所述方法用對病毒顆粒流感疫苗的單次鼻內或吸入給藥來進行。本發明還提供了一種方法，用于誘導局部或粘膜免疫應答，所述應答包括粘膜膜表面上作為IgA已知的分泌免疫球蛋白的增加，有利地，所述方法用對病毒顆粒流感疫苗的單次鼻內或吸入給藥來進行。鼻內施予之后對特異性IgG和IgA應答的誘導涉及鼻腔中淋巴組織的活性(參考文獻12)。此類組織作為鼻相關淋巴組織(NALT)已知，其還被顯示為用于細胞免疫應答的粘膜誘導位點(參考文獻13)。因為已知病毒顆粒具有誘導細胞內免疫應答的可能性(參考文獻14、15)，因此本發明還提供了誘導特異性細胞毒性淋巴細胞(CTL) 的方法。病毒顆粒(virosome)是含有病毒糖蛋白的脂質雙層。通常通過用去垢劑從帶包膜病毒提取膜蛋白和脂類，接著通過除去所述去垢劑來重構特征性雙層來生產病毒顆粒。 本發明還提供了流感病毒顆粒的組合物，其包含重構的流感病毒包膜(具體而言，不再加脂類，并且不加免疫刺激劑(通常稱為佐劑)的免疫調節劑而重構)，用于通過氣溶膠進行接種，所述氣溶膠通過一個或兩個鼻孔施予鼻咽或口咽的粘膜，以獲得抵抗流感的全身性和局部免疫性。通過吸入進行的單次施予也是可行的。單次口服粘膜施予也是可行的。可從滅活病毒來制備重構流感病毒顆粒，可以用不可透析的去垢劑對滅活病毒加以溶解，通過吸附到疏水珠粒上來除去所述去垢劑。制備物可包含一種或多種流感抗原的經過純化的懸浮液，所述流感抗原選自血細胞凝集素(HA)、神經氨酸酶(NA)、血細胞凝集素的衍生物和神經氨酸酶的衍生物。可以在病毒脂類(含有低水平的內毒素和卵清蛋白) 構成的膜中，對病毒膜蛋白血細胞凝集素和神經氨酸酶進行重構(見參考文獻9)。血清凝集素和/或神經氨酸酶的衍生物是具有經修飾的氨基酸序列和/或結構的血細胞凝集素和 /或神經氨酸酶分子。氨基酸可例如被刪除、替換或添加到序列中。此外，糖基化方式可被改變。衍生物保留有導入宿主時誘導免疫應答的能力。可在例如含有胚胎的雞蛋中，或在附著的細胞或懸浮液中的細胞的細胞培養物中培養用于制備重構病毒顆粒的流感病毒。病毒例如可以是野生型的或重配的 (reassortant)或經過遺傳修飾的株。病毒類型可例如是任何流感A或B亞型，包括流行性的株。本發明還提供疫苗。術語疫苗應被理解為具有免疫活性的藥物制備物。在某些實施方式中，疫苗可包含病原性微生物的無害變體或衍生物，例如，刺激免疫系統產生針對真實病原體的抵抗。在某些實施方式中，當疫苗施予宿主時例如能誘導適應性免疫。疫苗可含有病原體或病原體組分的已死亡或削弱形式，例如病原體的抗原性組分。疫苗制備物可還含有藥物載體，所述藥物載體可針對疫苗將被施予的特定模式加以設計，例如針對鼻內或吸入給藥設計的藥物載體。流感疫苗可包含一種或多種未變性流感抗原，其一種或多種能誘導流感特異的免疫應答。本發明提供了含流感病毒顆粒的組合物，所述流感病毒顆粒包含所述病毒的重構包膜，其中所述組合物被設計為鼻內或吸入給藥制劑。本發明還提供了其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的所述組合物。本發明還提供了其中病毒包膜完全從病毒粒子獲得的所述組合物。本發明還提供了其中沒有脂類從外源向重構病毒顆粒加入的所述組合物。本發明還提供了其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/ 或免疫刺激劑的所述組合物。本發明還提供了其中對受試者的單次鼻內或吸入給藥能誘導全身性免疫應答的所述組合物。本發明還提供了其中對受試者的單次鼻內或吸入給藥還能誘導局部免疫應答的所述組合物。本發明還提供了對受試者的單次鼻內或吸入給藥還能誘導細胞毒性淋巴細胞應答的所述組合物。本發明還提供了其中在人類中顯示誘導全身性免疫應答和/或局部免疫應答和/或細胞毒性淋巴細胞應答的能力的所述組合物。本發明還
7提供了其中免疫應答包含針對流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的免疫應答的所述組合物。在一種優選的實施方式中，本發明還提供了其中免疫應答符合用于流感疫苗的CHMP標準的所述組合物。本發明還提供了其中免疫應答提供下述中的一種或多種的所述組合物對成年人而言> 70%和/或對老年人而言> 60%的血清保護率，針對成年人> 40%和/或針對老年人> 30%的血清轉化率，以及針對成年人> 2. 5和/或針對老年人> 2. O的平均倍數增加。在一種特別優選的實施方式中，本發明還提供了其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ g的所述組合物。最后， 本發明還提供了其中組合物是包含用于鼻內或吸入給藥的藥物載體的疫苗制劑的所述組合物。本發明還提供了包含所述病毒的重構包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內或吸入給藥的組合物的用途。本發明還提供了這樣的所述用途其中，流感病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物。本發明還提供了這樣的所述用途其中病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得。本發明還提供了這樣的所述用途其中沒有脂類從外源加入到重構病毒顆粒。本發明還提供了這樣的所述用途其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑。本發明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內或吸入給藥足以誘導全身性免疫應答。本發明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內或吸入給藥還誘導局部免疫應答。本發明還提供了這樣的所述用途其中向受試者的單次鼻內或吸入給藥還誘導細胞毒性淋巴細胞應答。本發明還提供了這樣的所述用途其中接受給藥的受試者是人類。本發明還提供了這樣的所述用途誘導的免疫應答包含針對流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物的免疫應答。在一種優選的實施方式中，本發明還提供了這樣的所述用途，其中組合物誘導符合針對流感疫苗的CHMP標準的免疫應答。本發明還提供了這樣的所述用途，其中免疫應答提供下述中的一種或多種 對成年人而言> 70%和/或對老年人而言> 60%的血清保護率，針對成年人> 40%和/或針對老年人> 30%的血清轉化率，以及針對成年人> 2. 5和/或針對老年人> 2. O的平均倍數增加。在一種特別優選的實施方式中，本發明還提供了這樣的所述用途，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的施予劑量等于或低于30 μ g。最后，本發明還提供了其中制備的組合物是疫苗制劑的所述用途。因此，在一種實施方式中，本發明提供了包含所述病毒的重構包膜的流感病毒顆粒的組合物，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，以及其中所述組合物作為鼻內或吸入給藥制劑來設計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內或吸入給藥能誘導抵抗所述流感抗原的全身性免疫應答和/或局部免疫應答，所述全身性應答能符合用于流感疫苗的CHMP標準，以及其中，每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ go根據另一種實施方式，本發明提供了包含所述病毒的重構包膜的流感病毒顆粒用于制備用于鼻內或吸入給藥的組合物的用途，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，所述流感病毒顆粒用于制備用于鼻內或吸入給藥的組合物的用途的特征在于，所述組合物向人類的單次鼻內或吸入給藥足以誘導抵抗所述流感抗原的全身性免疫應答和/或局部免疫應答，所述應答能符合針對流感疫苗的CHMP標準，以及其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ g0根據另一種實施方式，本發明提供了一種包含流感病毒顆粒的組合物的疫苗制劑，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構包膜，其中，所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得，其中沒有從外源向重構病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫剌激劑， 其中疫苗特征在于針對向人類的單次鼻內或吸入給藥來設計疫苗，并且，其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30 μ g。有利地，所述制劑的所述單次鼻內或吸入給藥能在所述人類中誘導全身性和/或局部免疫應答。根據本發明還提供了包含一定量的用于單次鼻內或吸入給藥的所述疫苗制劑的裝置。每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素的根據本發明的應用劑量還可以低于或等于 25 μ g、20 μ g、15 μ g、10 μ g 或 5 μ g。引用的文獻(I)Maassab HF. Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25°C, Nature 213,612-14(1967)(2)Maassab HF. Bryant MLThe development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999 Oct-Dec ；9 (4) :237-44(3)Keitel W, Piedra PA. Live cold-adapted, reassortant in influenza vaccines(USA). In Textbook of Influenza. Nicholson KG，Webster RG，Hay AJ (Ed)， Blackwel Science Oxford，UK，373-390(1998)(4)Gluck U， Gebbers JO, Gluck R， Phase I evaluation of intranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult volunteers. J Virol. 1999 Sep ；73(9) :7780-6(5) Samdal HH, Bakke H，Of tung F，Holst J，Haugen IL, Korsvold GE， Kristoffersen AC，Krogh G，Nord K，Rappuoli R，Berstad AKH，Haneberg B，Anon-Living Nasal Influenza Vaccine Can Induce Major Humoral and Cellular Immune Responses in Humans without the Need for Adjuvants. Human Vaccines I : 2,85-90 ；March/April 2005(6) Mutsch M，Zhou W, Rhodes P，Bopp M，Chen RT, Linder T，Spyr C，Steffen R. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell^ s palsy in Switzerland. N Engl J Med,2004 Feb 26 ；350 (9) :896-903(7)Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for Influenza Vaccines. EMEA/CpMP/BWP/214/96(8) Daubeney, P.，Taylor, C. J.，McGaw, J.，Brown, Brown, E. M.，Ghosal，S.， Keeton，B. R.，Palache，B.，Kerstens，R. Immunogenicity and tolerability of a trivalent influenza subunit vaccine (InfluvacR) in high-risk children aged 6 months to 4 years. BJCP 1997 March,51(2) :87-90
(9) Stegmann, T.，Morselt, H. W. M.，Booy, F. P.，Van Breemen, J. F. L，Scherphof， G. , Wilschut, J. Functional reconstitution of influenza viris envelopes. EMBO Journal 1987,6(9) :2651-2659(10) Treanor J，Nolan C，0，Brien D，Burt D，Lowell G，Linden J，Fries L Intranasal administration of a proteosome-influenza vaccine is well-tolerated and induces serum and nasal secretion influenza antibodies in healthy human subjects. Vaccine 2006 ；24 (3) :254-62(11)Read R. C. ,Naylor S. C. Potter C. W. ,Bond J. , Jabbal-Gill I. ,Fisher A.， Ilium L. , Jennings R. Effective nasal influenza vaccine delivery using chitosan. Vaccine 2005 ；23(35) :4367-74(12)Kuper CF,Koornstra PJ, Hameleers DM,Biewenga J，Spit BJ,Duijvestein AM，van Breda Vriesman PJ, Sminia T.The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 199213 :219-24(13) Zuercher AW, Coffin SE，Thurnheer MC, Fundova P，Cebra JJ.Nasal-associated lymphoid tissue is mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses. J. Immunol. 2002 168 1796-803(14)Huckriede A， Bungener L, Stegmann T， Daemen T， Medema J， Palache AM， Wilschut J. The virosome concept for influenza vaccines. Vaccine 2005 23 (Suppl I) S26-38(15) Gliick R，Burri KG, Metcalfe I，Adjuvant and antigen delivery properties of virosomes. Curr. Drug Deliv. 20052 :395-400
實施例實施例I在8周齡的BALB/C小鼠中的LPP病毒顆粒疫苗；次優HA劑量水平上，對多種HA/LPP比例的鼻內比較流感血清陰性雌性Balb/c小鼠組成的組(每組10只)通過鼻內施予獲得LPP (脂肽)_病毒顆粒疫苗，其HA/LPP比例為I I. 5,1 O. 7,1 0.4,1 O (即沒有LPP)，并且每份劑量具有2 μ g的HA。此外，10只雌性小鼠的對照組接受O μ g HA/劑量(載體的鼻內施予)。制備含有LPP的病毒顆粒的四種制備物。簡言之，通過離心對30-40%蔗糖溶液中的滅活流感病毒進行沉淀。重新懸浮病毒，溶解于含有去垢劑八聚乙二醇單十二烷基醚 (Octaethylene glycol monododecyl ether) (OEG)的緩沖液中。隨后，通過超離心除去病毒核殼體。將含有OEG的上清液分為4等分體積，加入不同量的含OEG緩沖液中的脂肽 P3CSK4 (P3CSK4 N-棕櫚酰-S- [2，3-雙(棕櫚酰氧)-(2RS) _丙基]_ [R] _半胱氨酰_ [S]-絲氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酰-[S]-賴氨酸)。用含OEG的緩沖液調節體積。通過吸附到疏水樹脂上除去0EG。這導致了含LPP的病毒顆粒的形成，一種在它們膜中含有HA和NA以及(可選地)在它們膜中含有LPP的重構的病毒小泡。OEG去除之后，將病毒顆粒經孔徑為0. 22 μ m的PVDF膜過濾。
起始原料為20mg的HA，其來自甲型流感/Wyoming/3/2003X_147 (類A/ Fujian/411/200 (H3N2)株)，含有2521. U.內毒素/IOOyg HA0溶解后，按照表I所概述的制備4批。表I病毒顆粒的制備
權利要求
1.用于向人類的單次鼻內或吸入給藥以及能誘導抵抗流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶的全身和/或局部免疫應答的組合物，所述組合物包含由所述病毒的重構包膜形成的流感病毒顆粒，其中 所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得， 沒有從外源向所述重構病毒顆粒加入脂類， 所述病毒顆粒包含流感血細胞凝集素和/或神經氨酸酶， 每單次鼻內或吸入給藥的每種病毒株的血細胞凝集素的劑量為5 μ g至30 μ g，其特征在于沒有向組合物中加入附加的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述制劑的單次鼻內或吸入給藥還能誘導細胞毒性淋巴細胞應答。
2.根據權利要求I的組合物，其中所述免疫應答符合針對流感疫苗的CHMP標準。
3.根據權利要求I或2的組合物，其中所述免疫應答提供了下述中一種或多種對于成年人> 70%和/或對于老年人> 60%的血清保護率，對于成年人> 40%和/或對于老年人> 30%的血清轉化率，和對于成年人> 2. 5和/或對于老年人> 2. O的平均倍數增加。
4.由所述病毒的重構包膜形成的流感病毒顆粒在制備用于向人類的單次鼻內或吸入給藥并且能誘導抵抗流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶的全身和/或局部免疫應答的組合物的用途，所述組合物包含由所述病毒的重構包膜形成的流感病毒顆粒，其中 所述病毒包膜完全從流感病毒粒子獲得， 沒有從外源向所述重構病毒顆粒加入脂類， 所述病毒顆粒包含流感血細胞凝集素和/或神經氨酸酶， 每單次鼻內或吸入給藥的每種病毒株的血細胞凝集素的劑量為5 μ g至30 μ g，其特征在于沒有向組合物中加入附加的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述制劑的單次鼻內或吸入給藥還能誘導細胞毒性淋巴細胞應答。
5.根據權利要求4的用途，其中所述免疫應答符合針對流感疫苗的CHMP標準。
6.根據權利要求4或5的用途，其中所述免疫應答提供了下述中一種或多種對于成年人> 70%和/或對于老年人> 60%的血清保護率，對于成年人> 40%和/或對于老年人 > 30%的血清轉化率，和對于成年人> 2. 5和/或對于老年人> 2. O的平均倍數增加。
7.根據權利要求4至6中任意一項的用途，其中所述制備的組合物是疫苗制劑。
8.包含根據權利要求I至3中任意一項的組合物的疫苗制劑。
9.用于鼻內或吸入給藥的包含根據權利要求8的所述疫苗制劑以及用于所述疫苗霧化的機制的裝置。
10.根據權利要求9的裝置，其中所述裝置包含一定量用于單次鼻內或吸入給藥的疫苗制劑。
11.根據權利要求9或10的裝置，其中所述裝置是一次性的。
全文摘要
本發明提供了流感病毒顆粒的組合物，所述病毒顆粒包含所述病毒的重構包膜，其中所述病毒包膜完全從流感病毒粒獲得，其中沒有從外源向重構病毒顆粒加入脂類，其中病毒顆粒包含流感抗原血細胞凝集素和/或神經氨酸酶或其衍生物，其中沒有向所述組合物加入單獨的佐劑和/或免疫刺激劑，并且其中所述組合物作為鼻內或吸入給藥制劑來設計，所述組合物特征在于所述制劑向人類的單次鼻內或吸入給藥足以誘導抵抗所述流感抗原的全身性免疫應答和/或局部免疫應答和/或細胞毒性淋巴細胞應答，所述全身性應答能符合針對流感疫苗的CHMP標準，并且其中每種病毒株每次鼻內或吸入給藥的血細胞凝集素劑量等于或低于30μg。本發明還提供了重構的流感病毒顆粒用于制備所述組合物的用途，以及由此制備的疫苗制劑。
文檔編號A61P31/16GK102580077SQ20121004953
公開日2012年7月18日 申請日期2007年3月21日 優先權日2006年3月22日
發明者A·J·克斯坦, D·H·范蕾內科萊希思, J·J·P·瑙塔, L·杰勒茲, P·J·舍恩 申請人:索爾瓦生物學有限公司