專利名稱：Tubacin的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及Tubacin的新用途。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s Disease, AD),又稱老年性癡呆,是一種中樞神經系統原發性退行性變性疾病，主要臨床相為癡呆綜合癥。該病發生徐緩，病程呈進行性，其發病率隨年齡的增長而升高。據西方國家統計，AD在65歲以上老年人中的患病率為5%_8%，大約每增加10歲患病率就增加一倍(75歲以上為10%，85歲以上為25%)。我國關于AD的流行病學研究結果顯示，AD在我國老年人中的發病率和西方國家及日本、韓國的統計數據很接近，大概為5. 9%左右。根據2008年的人口統計數據，我國65歲以上的老年人比例已達到了
8.3%,而且還在繼續增加(數據來源于國家統計局《中國人口現狀》http://www. gov. cn/test/2005-07/26/content_17363. htm)。根據這個比例推算，目前我國AD患者可能已經超過了 500萬人。由于我國人口逐漸進入老齡化，老年病防治就成為了迫切需要解決的問題。在西方國家，AD已是繼心血管疾病、腫瘤、中風之后第四位死亡原因，也是花費最多的疾病。由于AD患者后期生活不能自理，常有嚴重認知功能障礙和精神神經癥狀，給家庭及社會帶來嚴重負擔，由此帶來的社會問題、經濟問題、家庭問題以及公共衛生問題越來越嚴重。因此，AD已經成為了各國政府、公眾以及科研人員關注的焦點。AD患者的主要病理性特征⑴大腦皮層出現彌漫性萎縮，以顳葉、頂葉和前額葉最為明顯，大量神經元空泡化丟失，突觸減少(健康人的大腦見圖1A1，AD患者的大腦見圖1A2) ； (2)海馬和大腦皮層等細胞外出現淀粉樣蛋白沉淀(Amyloid plaque, A β ),又稱老年斑(Senile plaques, SPs)(見圖IBl和圖1B2) ； (3)細胞內出現由成對的螺旋狀纖維構成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)(見圖ICl和圖1C2)。NFTs主要由過度磷酸化Tau形成的成對的螺旋狀纖維(paired helicalfilaments, PHFs)構成。Tau蛋白是一種微管結合蛋白，主要在中樞和周圍神經系統表達，在神經元的軸突中富集。早在上世紀八十年代，就有研究發現過度磷酸化的、不可溶的纖維化Tau是神經纖維纏結NFTs的主要成分，是AD的典型病理特征之一。Tau蛋白從結構上可以被分成四個結構域N端突出結構域(projection domain),脯氨酸富集區(proline-richregion),微管結合區(MT binding domain, MBD)和C端區域。在成人大腦中，N端和MBD結構域通過mRNA可變剪接可以產生6種Tau異構體。Tau異構體就是根據N端外顯子(稱為N)和微管結合重復(稱為R)的數目來命名的。Tau的主要功能是通過MBD結構域結合并穩定微管，對于軸突的正常運輸和神經元的正常生長發育都起著重要作用。Tau的微管結合區域還可以結合并抑制組蛋白去乙酰化酶-6 (HDAC6)的酶活。此外，Tau蛋白可以通過N端突出結構域和C端來結合微管外側，并調控微管之間的空隙。Tau的N端還能與細胞膜相互作用。Tau的脯氨酸富集結構域可以結合含有SH3結構域的蛋白，如酪氨酸激酶Fyn，從而介導Αβ誘導的神經毒性。Tau蛋白還有很多其他的結合對象，包括信號分子，細胞骨架組分和脂類，提示Tau是一個多功能蛋白。在生理和病理情況下，Tau蛋白都會發生一系列復雜的翻譯后修飾。例如，在胎兒發育和冬眠過程中Tau都會被正常的磷酸化。而在AD中，Tau的很多絲氨酸/蘇氨酸位點都會被過度磷酸化。黑腹果蜆(Drosophila melanogaster)是生物學研究領域常用的一種模式生物，具有如下優勢包括(I)生命周期短，生長迅速，繁殖能力強，為高通量篩選提供了充足的材料；(2)簡單、明確與高度保守的遺傳背景；已知的與人類智力障礙相關的280個基因中超過三分之二在果蠅中發現了同源基因，此外還包括一系列與發育和癌癥有關的基因；(3)豐富強大的遺傳操作工具，包括多種誘變技術和公共資源庫，如美國的Bloomington StockCenter,日本的Drosophila Genetic Resource Center,奧地利的 Vienna Drosophila RNAiCenter等；(4)果蠅簡單的神經系統適于研究基礎科學問題和復雜行為；果蠅幼蟲的神經肌肉接頭(Neuromuscular junction, NMJ),感覺神經元都比較簡單,適于單細胞水平研究突觸結構和功能；果蠅大腦神經元在病理狀態下，也會發生退行性病變，可以模擬相關神經退行性疾病表型；另外，果蠅大腦也可以控制復雜行為，包括求偶、恐懼、好斗、抉擇等。 在果蠅的研究中經常會用到實現基因組織特異性表達的GAL4/UAS系統。該表達體系來源于酵母，其中Gal4蛋白是一個轉錄激活因子，可以特異性識別UAS(upstreamactivating sequence)序列并激活其下游基因的表達。如果Gal4蛋白的表達受到一個組織特異性或者條件特異性的啟動子(promoter)的調控，那么UAS下游基因的表達也將呈現出同該啟動子一樣的組織特異性或者條件特異性。為了方便實驗操作與品系保存，在果蠅中通常利用轉座子轉基因技術使GAL4/UAS系統以一種二元化體系存在，即構建兩個轉基因果蠅品系，其中一個表達Gal4基因，另外一個在基因組中含有插入的UAS序列，并且該UAS序列后往往跟隨一個特異性的目的基因，如人類疾病相關蛋白。當需要表達這個目的基因時，只需要將這兩種品系的果蠅進行一次雜交，就可以在子代果蠅中大量表達由Gal4調控的UAS下游基因。配合目前可以獲得的數千種組織和條件特異性Gal4品系以及其它多種分子工具，使得在果蠅中研究基因的組織特異性功能具有其它模式生物所無法比擬的優勢。這一點在利用果蠅模型進行人類神經退行性疾病研究領域得到了充分的展現。多種人類退行性疾病和一個或多個毒性蛋白有著緊密的聯系，如AD中的Αβ和Tau，帕金森綜合癥(Parkinson，s disease)中的 a-synuclein,亨廷頓舞蹈癥(Huntington，sdisease)中的Huntingtin,克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD,又稱瘋牛病)中的阮蛋白(prion)等等。利用GAL4/UAS系統在果蠅腦組織特異性表達這些蛋白質能夠在一定程度上重現與病人類似的表型，從而為研究疾病的發病機制和尋找治療方法提供了有效的研究對象。基于Tau和A β蛋白的相關轉基因果蠅模型都能表現出年齡依賴的神經退行性病變和壽命縮短的現象，很好的模擬了 AD的病理特征。其中Tauopathy相關模型最早是由Dr. Mel Feany實驗室構建的，后來被很多實驗室使用。神經特異性表達野生型Tau和突變體Tau (含有人類疾病中的自發點突變)都能造成神經元的凋亡以及壽命縮短。在果蠅大腦神經元胞體也有過度磷酸化Tau的聚集，但是沒有檢測到不溶性的神經纖維纏結(PHFs)。據推測，可能是因為果蠅中沒有神經纖維絲(neurofilament)，所以不能形成纏結，同時也說明了 PHFs并不是造成神經退行性病變的必要因素。
另外，利用果蠅AD模型可以大規模的進行藥物篩選。已知的可以抑制AD果蠅模型中的病理特征的藥物包括GSK-3 0抑制劑lithium，微管穩定藥物Epothilone D，載脂蛋白 E 類似物(Blard et al. , 2007;Brunden et al. , 2010;Mudher et al. , 2004; Shulmanand Feany, 2003)等。以上的研究充分說明，利用果蠅來研究人類疾病，特別是AD具有很大的潛力。
發明內容
本發明的目的是提供Tubacin的新用途。本發明提供了 Tubacin在制備產品中應用；所述產品的用途為如下(I)至(5)中的至少一種(I)抑制微管破壞；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神經肌肉接頭(NMJ)形態異常；(4)抑制神經肌肉接頭(NMJ)微管骨架異常；(5)治療阿爾茨海默病。所述(I)中的所述“抑制微管破壞”具體可為“抑制Tau蛋白過表達誘導的微管破 壞”。所述(I)中的所述“抑制微管破壞”具體可體現為促使微管密度增加和/或促進微管斷頭數目降低。所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”具體可為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭形態異常”。所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”具體可體現為促使衛星突觸扣結數目減少和/或神經肌肉接頭總長度增加。所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”具體可為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭微管骨架異常”。所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”具體可體現為微管結合蛋白Futsch可以到達神經肌肉接頭的末端和/或增加神經肌肉接頭中的微管乙酰化水平。本發明還保護一種產品，它的活性成分為Tubacin ;所述產品的用途為如下(I)至
(5)中的至少一種(I)抑制微管破壞；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神經肌肉接頭(NMJ)形態異常；(4)抑制神經肌肉接頭(NMJ)微管骨架異常；(5)治療阿爾茨海默病。所述(I)中的所述“抑制微管破壞”具體可為“抑制Tau蛋白過表達誘導的微管破壞”。所述(I)中的所述“抑制微管破壞”具體可體現為促使微管密度增加和/或促進微管斷頭數目降低。所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”具體可為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭形態異常”。所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”具體可體現為促使衛星突觸扣結數目減少和/或神經肌肉接頭總長度增加。所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”具體可為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭微管骨架異常”。所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”具體可體現為微管結合蛋白Futsch可以到達神經肌肉接頭的末端和/或增加神經肌肉接頭中的微管乙酰化水平。所述Tau蛋白為如下(a)或(b)或(C):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列第337位氨基酸殘基由V突變為M得到的蛋白質；(c)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的的由序列I衍生的蛋白質。本發明對于阿爾茨海默病發病機制分析具有深遠意義，對于阿爾茨海默病的藥物研發和阿爾茨海默病的治療具有重大價值。
圖I為AD患者的主要病理性特征。圖2為實施例I中免疫細胞染色的結果。 圖3為實施例I中werstern blot分析的結果。圖4為實施例2中免疫細胞染色的結果。圖5為實施例3中免疫細胞染色的結果。圖6為實施例3中werstern blot分析的結果。圖7為pUAST質粒的結構示意圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。人類0N4R野生型Tau蛋白，簡稱tauWT蛋白，如序列表的序列I所示,編碼tauWT蛋白的基因(tauWT基因)如序列表的序列2所不。人類0N4R野生型Tau蛋白的V337M突變體，簡稱tauV337M蛋白，是將tauWT蛋白第337位氨基酸殘基由V突變為M得到的。編碼tauV337M蛋白的基因(tauV337M基因)是將tauWT基因第1009至1011位核苷酸由GTG突變為ATG得到的。 UAS-tauV337M果蠅(即基因型為UAS_tauV337M/+的果蠅)在pUAST質粒中UAS序列下游的多克隆位點插入tauV337M基因，得到的重組質粒；將重組質粒導入W1118黒腹果蠅(Drosophila melanogaster),得到 UAS_tauV337M 果妮；參考文獻Curtis ff. Wittmannetal. ；Tauopathy in Drosophila:Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles ；Science 293，711(2001);DOI:10. 1126/science. 1062382。UAS_tauWT果蠅(即基因型為UAS_wt tau/+的果蠅)在pUAST質粒(結構示意圖見圖7)中UAS序列下游的多克隆位點插入tauWT基因，得到的重組質粒；將重組質粒導入W1118黒腹果蜆(Drosophila melanogaster),得到UAS_tauWT果蜆；參考文獻Curtis ff. Wittmann et al. ；Tauopathy in Drosophila:NeurodegenerationWithout Neurotbrillary Tangles ； Sc i ence 293, 71 1 (2001) ; DO I : 10. 1126/science. 1062382。C57-GAL4果蠅(即基因型為BG57-GAL4/+的果蠅)參考文獻Budnik etal. , Regulation of Synapse Structure and Function by the Drosophila TumorSuppressorGene dlg;Neuron, Vol. 17, 1996。elav_GAL4 果妮，在保種中心的名稱為 “P {GawB} elav[C155] ” 美國 Bloomington果妮保種中心，stock number:458。w1118 黒腹果妮(Drosophila melanogaster):美國 Bloomington 果妮保種中心，stocknumber:5905。pUAST 質粒(結構不意圖見圖 7) Drosophila genomics resource center,https://dgrc. cgb. indiana. edu/product/View product=1000, stock number :1000oanti-a -tubulin mAb B-5_l_2 :Sigma,貨號為 T6074。 anti-ace-tubulinmAb6-llB-l :Sigma，貨號為T7451。山羊抗小鼠二抗Invitrogen，貨號為A-10667。兔抗小鼠 HRP 標記 IgG 抗體Invitrogen，貨號為 61-6420。Futsch 抗體DSHB，貨號為 22C10。 總體積IOOOml的果蠅培養基的制備方法如下各個成分的組成見表I。表I各個成分的組成
權利要求
1.Tubacin在制備產品中應用；所述產品的用途為如下(I)至(5)中的至少一種(1)抑制微管破壞；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神經肌肉接頭形態異常；(4)抑制神經肌肉接頭微管骨架異常；(5)治療阿爾茨海默病。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破壞”為“抑制Tau蛋白過表達誘導的微管破壞”。
3.如權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破壞”體現為促使微管密度增加和/或促進微管斷頭數目降低。
4.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭形態異常”。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”體現為促使衛星突觸扣結數目減少和/或神經肌肉接頭總長度增加。
6.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭微管骨架異常”。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”體現為微管結合蛋白Futsch可以到達神經肌肉接頭的末端和/或增加神經肌肉接頭中的微管乙酰化水平。
8.一種產品，它的活性成分為Tubacin ;所述產品的用途為如下(I)至(5)中的至少一種(I)抑制微管破壞；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神經肌肉接頭形態異常；(4)抑制神經肌肉接頭微管骨架異常；(5)治療阿爾茨海默病。
9.如權利要求8所述的產品，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破壞”為“抑制Tau蛋白過表達誘導的微管破壞”;所述(3)中的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭形態異常”;所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”為“抑制Tau蛋白過表達導致的神經肌肉接頭微管骨架異常”。
10.如權利要求8所述的產品，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破壞”體現為促使微管密度增加和/或促進微管斷頭數目降低；所述(3沖的所述“抑制神經肌肉接頭形態異常”體現為促使衛星突觸扣結數目減少和/或神經肌肉接頭總長度增加；所述(4)中的所述“抑制神經肌肉接頭微管骨架異常”體現為微管結合蛋白Futsch可以到達神經肌肉接頭的末端和/或增加神經肌肉接頭中的微管乙酰化水平。
全文摘要
本發明公開了Tubacin的新用途。本發明提供了Tubacin在制備產品中應用；所述產品的用途為如下(1)至(5)中的至少一種(1)抑制微管破壞；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神經肌肉接頭(NMJ)形態異常；(4)抑制神經肌肉接頭(NMJ)微管骨架異常；(5)治療阿爾茨海默病。本發明對于阿爾茨海默病發病機制分析具有深遠意義，對于阿爾茨海默病的藥物研發和阿爾茨海默病的治療具有重大價值。
文檔編號A61P25/28GK102940629SQ201210477190
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者熊英, 趙愷, 吳家曦, 張永清 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所