癌癥治療中的靶向脂質體的制作方法
【專利摘要】本發明提供了藥物組合物，其包含用于靶向遞送治療劑和診斷劑以治療過度增殖性疾病(hyperproliferative?disease)的運載體。此運載體的靶向組分是與貨物組分(carg0component)(其可以是治療劑或診斷劑)偶聯或者與包含治療劑或診斷劑的納米顆粒組合物偶聯的胱氨酸分子。本發明也提供了通過靶向過度增殖性疾病細胞以遞送治療劑或診斷劑從而來治療過度增殖性病癥的方法。
【專利說明】癌癥治療中的靶向脂質體
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年9月8日提交的美國申請序列號61 / 532，430的優先權，其全部公開通過參考并入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于治療劑和診斷劑靶向遞送的組合物和方法，包括靶向細胞內遞送治療劑和診斷劑，以及涉及過度增殖性疾病的治療。
【背景技術】
[0004]用化學療法藥物治療過度增殖性病癥的有效性(如惡性和良性腫瘤)受到一些重大障礙的限制，其包括:i)藥物對于正常和腫瘤組織的非特異性毒性；ii)向靶細胞遞送藥物的無效率；以及iii)藥物不合適的釋放。因此，許多化學療法藥物被表征為具有低治療指數，從而需要相對高的藥物劑量，繼而導致許多副作用。正因如此，開發另外的用于遞送化學療法藥物至靶細胞的靶向遞送系統會解決許多化學療法不需要的方面。本發明通過下述方式滿足了這樣的需要，其通過將藥物靶向至異常表達高水平的對胱氨酸/谷氨酸轉化特異性的K。—系統異二聚體氨基酸轉運蛋白的細胞質膜組分。
[0005]X；系統將L-胱氨酸輸入到細胞的細胞內區室，所述細胞內區室需要L-胱氨酸來合成谷胱甘肽(L- Y -谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，本文稱作“GSH”)，其為在含氧量低的環境下(例如存在于腫瘤環境中的細胞)對細胞存活來說非常重要的抗氧化劑。XcT系統輸入的結構由SLC7A11 (賦予轉運蛋白胱氨酸特異性的催化亞基)和SCL3A2(調節亞基)構成。SLC7A11和SCL3A2也在【技術領域】中分別以xCT和4F2hc / CD98所知。
[0006]由于腫瘤細胞和其他異常快速分裂或分化的細胞需要更大量的GSH來應對更高水平的氧化脅迫，相比正常情況下的正`常細胞，這種細胞更高地表達XcT系統組分來引入胱氨酸。正因如此，本發明通過下述方式利用了過度增殖細胞X。-系統組分的表達增加，所述方式即提供包含胱氨酸的藥物和診斷遞送運載體從而將遞送運載體介導至靶細胞的XC-系統組分。
【發明內容】
[0007]本發明提供了用于靶向遞送治療劑和診斷劑以治療過度增殖性疾病的藥物組合物。在多個實施方案中，本發明提供了用于靶向遞送治療劑或診斷劑的運載體(vehicle)，或包含靶向組分和貨物(cargo)組分二者的運載體。所述靶向組分是胱氨酸分子，其偶聯到可以是治療劑或診斷劑或者這二者的貨物組分，或者偶聯到包含治療劑和或診斷劑或者這二者的納米顆粒組合物。在多個實施方案中，所述納米顆粒組合物是脂質體包裹(Iiposome-encapsulated)的治療劑或診斷劑。
[0008]本發明還提供了治療過度增殖性病癥的方法，其通過靶向過度增殖性疾病細胞從而細胞內遞送治療劑或診斷劑或者這二者來實現。在多個實施方案中，本發明的方法施用有效量的本發明運載體來實現治療劑或診斷劑的細胞內遞送，所述運載體包含與貨物偶聯的胱氨酸分子用以細胞內遞送，其中所述貨物是治療劑成分或者是包含治療劑或診斷劑或這二者的組合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1描繪了綴合了胱氨酸的脂質體所包裹的柔紅霉素(DNR)的結構。該圖描繪了胱氨酸分子的Natta投影(Natta projection)。
[0010]圖2描繪了納米顆粒(例如，癌組織中的脂質體)的滲透性和保持力(retention)增強。(I)描繪了在健康組織中不能滲透入血管內皮的納米顆粒。(2)描繪了正常內皮。(3)和(4)描述了納米顆粒從腫瘤組織中血管的外滲。
[0011]圖3描繪了 XcT胱氨酸/谷氨酸轉運系統的功能性示意圖。(I)代表轉運蛋白的SLC3A2亞基，(2)代表通過轉運蛋白的胱氨酸的細胞輸入，(3)代表轉運蛋白的SLC7A11亞基，以及(4)代表通過轉運蛋白的谷氨酸輸出。
[0012]圖4顯示了對于A549細胞的DNR標準曲線(吸光度相對DNR濃度)。
[0013]圖5A顯示了 A549細胞對⑴游離DNR ；⑵脂質體DNR ；以及(3)胱氨酸脂質體DNR任一形式的10 μ m和5 μ m的DNR的相對細胞攝取的柱狀圖，其基于如流式細胞術分析所測定的熒光強度。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式DNR制劑的平均熒光強度(MFI)。細胞DNR攝取以相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.Ε.Μ(平均標準誤)(* * *胱氨酸-脂質體DNR相對游離DNR于5 μ M和10 μ M濃度ρ〈0.001，η=3 ；+++胱氨酸-脂質體DNR相對脂質體DNR于5 μ M和1(^]?濃度口〈0.001)。
[0014]圖5Β顯示了 Α549細胞對DNR攝取的圖(histogram)，A549細胞經下述處理:(I)胱氨酸-脂質體DNR ；⑵非胱氨酸-脂質體DNR ； (3)游離DNR ;或⑷無。所有的DNR制劑都包含10 μ m DNR (n=3)。DNR的細胞攝取與熒光強度相關聯。
[0015]圖5C顯示了 A549細胞對DNR攝取的圖，A549細胞經下述處理:(1)胱氨酸-脂質體DNR ；⑵游離DNR ； (3)非胱氨酸-脂質體DNR ;或⑷無。所有的DNR制劑都包含5 μ mDNR(n=3)。DNR的細胞攝取與熒光強度相關聯。
[0016]圖6A展示了 A549細胞與(1)10μΜ DNR ； (2) 10 μ M DNR等量的胱氨酸脂質體DNR ;(3) 10 μ M DNR等量的脂質體DNR ;或者(4)在谷氨酸存在下的10 μ M DNR等量的胱氨酸脂質體DNR在37°C孵育6個小時的熒光顯微圖像。
[0017]圖6B展示了 A549細胞與(1)5μΜ DNR ; (2) 5 μ MDNR等量的胱氨酸脂質體DNR ;
(3)5 μ M DNR等量的脂質體DNR ;或者(4)在谷氨酸存在下的5 μ M DNR等量的胱氨酸脂質體DNR在37°C孵育6個小時的熒光顯微鏡圖像。
[0018]圖7A顯示了以下柱 狀圖:谷氨酸(5mM)對于經含5 μ m或10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式DNR制劑的平均熒光強度(MFI)。細胞DNR攝取以相對于10 μ m游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.Ε.M(平均標準誤)(*顯示了胱氨酸-脂質體DNR相對脂質體DNR于5 μ M和10 μ M濃度下ρ〈0.05，η=3)。柱(I)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱⑵顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后在谷氨酸存在下的DNR攝取。柱(3)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱(4)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后在谷氨酸存在下的DNR攝取。
[0019]圖7B顯示了以下圖:谷氨酸對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR ; (2)胱氨酸-脂質體DNR和谷氨酸；以及(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0020]圖7C顯示了以下圖:谷氨酸對于經含5 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR ; (2)胱氨酸-脂質體DNR和谷氨酸；以及(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。所有DNR制劑包含5μπι的DNR(η=3)。
[0021]圖8Α顯示了以下圖:低溫對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR ; (2)冷條件(4°C )下的胱氨酸-脂質體DNR;以及(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度。所有DNR 制劑包含 10 μ m 的 DNR (n=3)。
[0022]圖8B顯示了以下圖:低溫對于經含5 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR ; (2)冷條件(4°C )下的胱氨酸-脂質體DNR ;以及(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度。所有DNR制劑包含5μπι的DNR(n=3)。
[0023]圖9A顯示了以下柱狀圖:細胞松弛素(100 μ Μ)對于經含5 μ m或10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體 DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式的DNR制劑的平均熒光強度。細胞DNR攝取以相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.E.M(平均標準誤)。柱(I)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱⑵顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后在細胞松弛素存在下的DNR攝取。柱(3)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5μπι量的DNR后的DNR攝取。柱(4)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后在細胞松弛素存在下的DNR攝取。
[0024]圖9B顯示了以下圖:細胞松弛素對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)無；(2)胱氨酸-脂質體DNR;以及(3)胱氨酸-脂質體DNR和細胞松弛素；其中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0025]圖9C顯示了以下圖:細胞松弛素對于經含5 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)無；(2)胱氨酸-脂質體DNR和細胞松弛素；或(3)胱氨酸-脂質體DNR中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0026]圖1OA顯示了以下柱狀圖:氯丙嗪(100 μ g / ml)對于經含5 μ m或10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式DNR制劑的平均熒光強度。細胞DNR攝取以相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.E.M(平均標準誤)。柱⑴顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱⑵顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后在氯丙嗪存在下的DNR攝取。柱(3)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱⑷顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后在氯丙嗪存在下的DNR攝取。
[0027]圖1OB顯示了以下圖:氯丙嗪對于經含5 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)無；(2)胱氨酸-脂質體DNR;和(3)胱氨酸-脂質體DNR和氯丙嗪；中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0028]圖1OC顯示了以下圖:氯丙嗪對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR和氯丙嗪；(2)胱氨酸-脂質體DNR ;或(3)無；中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0029]圖1lA顯示了以下柱狀圖:阿米洛利(amiloride) (3mM)對于經含5 μ m或10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式的DNR制劑的平均熒光強度。細胞DNR攝取以相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.Ε.M(平均標準誤)(*胱氨酸-脂質體DNR相對胱氨酸-脂質體DNR和阿米洛利于5 μ M和10 μ M濃度下ρ〈0.05，η=3) ο柱(I)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱
(2)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10μ m量的DNR后在阿米洛利存在下的DNR攝取。柱⑶顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5μπι量的DNR后的DNR攝取。柱(4)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后在阿米洛利存在下的DNR攝取。
[0030]圖1lB顯示了以下圖:阿米洛利對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR和阿米洛利；(2)胱氨酸-脂質體DNR ;或(3)無；中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0031]圖1lC顯示了以下圖:阿米洛利對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(`I)無；(2)胱氨酸-脂質體DNR和阿米洛利；和
(3)胱氨酸-脂質體DNR;中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0032]圖12A顯示了以下柱狀圖:制霉菌素(nystatin) (100 μ g / ml)對于經含5 μ m或IOym劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。該圖表示了以流式細胞術數據為基礎的不同形式DNR制劑的平均熒光強度。細胞DNR攝取以相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度來表示。顯示了平均值和S.Ε.M (平均標準誤)(*胱氨酸-脂質體DNR相對胱氨酸-脂質體DNR和制霉菌素以5 μ M濃度為基礎ρ〈0.05，η=3) ο柱(I)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后的DNR攝取。柱
(2)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入10 μ m量的DNR后在制霉菌素存在下的DNR攝取。柱⑶顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5μπι量的DNR后的DNR攝取。柱(4)顯示了以胱氨酸-脂質體DNR形式加入5 μ m量的DNR后在制霉菌素存在下的DNR攝取。
[0033]圖12B顯示了以下圖:制霉菌素對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR; (2)胱氨酸-脂質體DNR和制霉菌素；或(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0034]圖12C顯示了以下圖:制霉菌素對于經含10 μ m劑量DNR的胱氨酸脂質體DNR制劑處理的細胞攝取DNR的影響。顯示了用(I)胱氨酸-脂質體DNR ; (2)胱氨酸-脂質體DNR和制霉菌素；或(3)無中任一處理的A549細胞的細胞計數相對于熒光強度(n=3)。
[0035]圖13A顯示了以下線形圖:針對游離DNR和胱氨酸-脂質體DNR的A549細胞生長抑制曲線。(I)胱氨酸-脂質體DNR，⑵脂質體DNR，和(3)游離DNR的IC5tlDNR濃度分別為 4.435 μ Μ、10.25 μ M 以及 15.25 μ Μ。
[0036]圖13Β顯示了以下柱狀圖:用含有相當于5μΜ或ΙΟμΜ DNR之DNR劑量的(I)游離DNR，(2)脂質體DNR，或(3)胱氨酸-脂質體DNR制劑處理后存活的Α549細胞的百分t匕。(+++p〈0.001基于胱氨酸-脂質體DNR的5 μ M和10 μ M的DNR制劑相對游離DNR的5 μ M和10 μ MDNR制劑，+p〈0.01基于脂質體DNR的5 μ M和10 μ M DNR制劑相對游離DNR的5 μ M和10 μ M DNR制劑，* * p〈0.01基于胱氨酸脂質體DNR的10 μ MDNR制劑相對脂質體DNR的10 μ M DNR制劑，以及* * * p〈0.001基于胱氨酸脂質體DNR的5 μ M DNR制劑相對脂質體DNR的5 μ M DNR制劑。)顯示了平均值和S.Ε.Μ(平均標準誤)。(η=3)。
[0037]圖14Α顯示了以下線形圖:谷氨酸對由胱氨酸-脂質體DNR介導的Α549細胞生長抑制的作用。IC5tlDNR的濃度對于(I)胱氨酸-脂質體DNR，和(2)胱氨酸-脂質體DNR分別為 4.435 μ Μ、以及 7.947 μ Μ。
[0038]圖14Β顯示了以下柱狀圖:在含有相當于ΙΟμΜ或5μ M DNR的DNR劑量的胱氨酸-脂質體DNR制劑和(2)胱氨酸-脂質體DNR制劑處理后存活的Α549細胞的百分比。(* * *基于胱氨酸-脂質體DNR的5 μ M DNR制劑相對胱氨酸-脂質體DNR的5 μ M DNR制劑加谷氨酸，Ρ<0.001。)顯示了平均值和S.Ε.Μ(平均標準誤)(η=3)。
[0039]圖15顯示了以下柱狀圖:以脂質體DNR的形式加入的DNR的量與處理72小時后細胞存活(cell viability)的相關性。柱(I)表示0.0001 μ M脂質體DNR，柱(2)表示2.5 μ M脂質體DNR，柱(3)表示5 μ M脂質體DNR，柱⑷表示ΙΟμΜ脂質體DNR，柱(5)表示15“]?脂質體0殿。
[0040]圖16顯示了將DNR遞送到咽囊期(pharyngula-Stage)斑馬魚胚胎胃中使之攝取胱氨酸脂質體DNR(A)相對于斑馬于胚胎使之攝取脂質體DNR(B)的熒光圖像，。圖16A中的箭頭指向留在斑馬魚胃內的DNR。
[0041]圖17A顯示了下列DNR制劑在Pan02細胞體內腫瘤模型中隨時間對腫瘤體積的作用:(I)PEG化的胱氨酸脂質體DNR ； (2)胱氨酸脂質體DNR ； (3)脂質體DNR ； (4)游離DNR ；以及(5)鹽水。
[0042]圖17B顯示了下列線性圖:圖17A的DNR制劑作用的更多細節。(I)胱氨酸脂質體DNR ；⑵PEG化的胱氨酸脂質體DNR ； (3)游離DNR ；以及(4)脂質體DNR。
[0043]圖17C顯示了圖17A的基于脂質體的DNR制劑的抗腫瘤作用。⑴脂質體DNR; (2)胱氨酸脂質體DNR ；以及(3)加入PEG化的胱氨酸脂質體DNR。
[0044]圖17D顯示了(I)鹽水；⑵游離DNR ； (3)脂質體DNR ；⑷胱氨酸脂質體DNR ；以及(5) PEG化的胱氨酸脂質體DNR對體重的作用。
[0045]附表說明
[0046]表1展示了游離DNR、脂質體DNR、胱氨酸脂質體DNR以及谷氨酸存在下胱氨酸脂質體DNR的IC5cXyM DNR)濃度。濃度值來自于圖12A和13A的細胞存活曲線。
【具體實施方式】
[0047]本發明提供了用于靶向遞送治療劑和診斷劑的運載體和方法。更特別地，本發明的運載體包含一個或更多個偶聯至貨物的胱氨酸分子，所述貨物包括治療劑或診斷劑或這二者，從而形成“本發明的運載體”。本發明的運載體可遞送到表達胱氨酸特異的X。-系統異二聚體氨基酸轉運蛋白之組分的靶細胞，所述轉運蛋白由SLC7A11和SLC3A2亞基的異源二聚體形成，此后稱之為“轉運蛋白”。通常，在異常氧化脅迫條件下細胞更高地表達轉運蛋白，例如對于過度增殖細胞來說經常存在的條件，因此，其對于基于胱氨酸和轉運蛋白特異性相互作用的本發明運載體來說是有效的疾病細胞靶標。貨物可以是治療劑或診斷劑或者是包含治療劑、診斷劑或其組合的組合物。
[0048]在多個實施方案中，本發明的運載體把治療劑或診斷劑遞送到細胞內區室中。不希望受任何特定理論的限制，來自于本發明運載體的治療劑或診斷劑的細胞攝取可通過本發明運載體的一個或更多個胱氨酸與轉運蛋白的相互作用實現。在多個實施方案中，本發明運載體的胱氨酸與轉運蛋白的相互作用啟動一系列的細胞事件，其引起靶細胞內吞本發明的運載體或運載體的多種組分，如治療劑或診斷劑。在本發明的某些實施方案中，由本發明運載體的胱氨酸與轉運蛋白之間相互作用發動的內吞事件是能量依賴性胞飲事件。
[0049]胱氨酸組分
[0050]如本文所使用的，胱氨酸理解為由共價連接的形成二硫鍵的兩個半胱氨酸殘基氧化形成的二聚氨基酸。在本發明的多個實施方案中，胱氨酸是L-胱氨酸。可以通過使用本領域內已知的方法將胱氨酸連接到貨物上，包括對貨物進行修飾以包含與胱氨酸有反應型的官能團，(例如，可氧化脂質體貨物分子，以及通過進行還原胺化反應(reductiveamination reaction)將胱氨酸連接到脂質體表面)。通過化學鍵直接將胱氨酸連接到本發明運載體的貨物組分的方法可見于Hermanson, G, “BioconjugateTechniques, ” lsted.Academic Press (1996)和 Hermanson, G “Bioconj jugate Techniques,，，2nd ed.ElsevierInc.(2008)，其全部并入本文。
[0051]在本發明多個其他實施方案中，胱氨酸也可間接地通過連接基團連接到貨物上，比如但不限于聚乙二醇(PEG)，二酸接頭如琥珀酸、丁二酸等；二醛如戊二醛、羥基酸(hydroxy acid),其中羥基酸的羥基集團與胱氨酸的羧酸形成酯，以及接頭的羧酸與PEG羥基形成酯，以及氨基酸接頭，如e-氨基`己酸，其中接頭的氨基與胱氨酸的羧酸形成酰胺(amide)而接頭的羧酸與PEG羥基形成酯。此外，胱氨酸的氨基可用于與接頭形成共價鍵，如PEG或任何其他接頭分子。除了將胱氨酸連接到本發明運載體的貨物組分上，PEG分子還允許綴合來避免本發明的運載體被治療接受者的免疫系統清除。更具體地說，可通過將PEG整合入運載體中來逃過單核巨噬細胞系統。本發明不特別地限制PEG的分子量，但是連接到本發明的運載體的PEG分子通常的分子量從約400到約10，OOODalton0然而，本發明可以適應大到100，OOODalton或更大的PEG分子。
[0052]貨物組分
[0053]如上所述，本發明運載體的貨物也可以是包含治療劑的組合物。例如，作為本發明貨物的組合物可以是包含治療劑的納米顆粒，其是具有下述原料的組合物，比如但不限于:脂質(如脂質體)；環糊精(cyclodextrin);生物相容性聚合物(如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)，以及在FDAGRAS列表清單上指明的聚合物，其通過參考并入，乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA));或生物材料(如白蛋白)。
[0054]關于脂質成分，本發明并不特別限制提供的脂質成分的選擇。然而，脂質的實例選自但不限于膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、硬脂酰胺、陽離子脂質(cationic lipid)、組織來源的磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、乳糖神經酰胺(Iactosylceramide)、半乳糖腦苷脂、神經節苷脂、具有含鄰位羥基(vicinal hydroxyl)的易氧化高錳酸鹽成分的脂質、以及糖脂。根據施用途徑，本發明的脂質體也可包含可藥用穩定劑和/或抗氧化劑。穩定劑的非限制性例子包括糖類，如甘油、甘露醇、山梨醇、乳糖和蔗糖。當甾醇(如膽固醇)用于膜的額外脂質成分時，這類甾醇也作為穩定劑。
[0055]除了穩定劑，根據施用途徑，本發明的脂質體貨物組合物還可包含可藥用添加劑。這類添加劑的例子包括水、生理鹽水、可藥用有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、干酪素、明膠、瓊脂、二酰甘油(diglycerin)、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石臘、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、PBS、體內可降解的聚合物、無血清培養基(serum-free medium)、可藥用表面活性劑以及其任意組合。
[0056]術語“裝載”，如本文所理解的，主要用來指定下述狀態，即在該狀態下治療劑被包裹在脂質體的封閉空間中。然而，其也包括以下狀態:即一部分的治療劑局限于膜中的狀態或者治療劑連接到膜外表面的狀態。裝載于即包裹于脂質體中的治療劑的需要量根據藥物類型的不同有所變化。
[0057]在多個實施方案中，本發明運載體的貨物是脂質體包裹的治療劑，其中可通過連接親水性大分子來修飾脂質體的表面。這樣的修飾可以通過連接PEG的衍生物(如磷脂衍生物或膽固醇衍生物)的反應來完成。例如，可以將PEG衍生物或PEG衍生物水溶液添加到脂質體分散系(liposome dispersion)來產生僅在脂質體外表面上具有PEG鏈的脂質體。作為替代地，可通過下述方式來產生經修飾的脂質體，所述方式即通過本領域內通常使用的方法產生具有反應性官能團的含膜組成脂質(membrane-constituting lipid)(例如磷脂)的脂質體，其后將具有一個活化末端的PEG添加到脂質體的外部溶液(exteriorsolution)從而使得此PEG與具有官能團的膜組成脂質(例如磷脂)相結合。在上述過程中，多種技術可用來產生具有所需尺寸的脂質體(“Liposome Technology LiposomePreparation and Related Techniques，，2nd edition, edited by G.Gregoriadis, V01.1-1II, CRC Press)，其通過引用并入本文。
[0058]關于包含貨物的本發明運載體，所述貨物包括包裹治療劑的組合物，此類納米顆粒基于治療劑分子通過產生低能化學鍵將自身與一個或更多個環糊精分子相結合的能力，因此，所述化學鍵是非共價的例如形成包合配合物(inclusion complex)。該配合物的存在源于a)游離狀態的治療劑和環糊精與b)包合配合物之間平衡的形成。這通過其穩定常數來定量地表征。
[0059]本發明沒有特別限定能包含在本發明的運載體的貨物中的聚合物成分的選擇。然而，本發明提供了至少一種或更多種聚合物，其選自但不限于聚陽離子聚合物、聚陰離子聚合物或非離子聚合物。聚陽離子或聚陰離子聚合物有至少一個分別帶有正電或負電的位點(site)。適于本發明運載體之貨物組分的非限制性聚合物組包括但不限于環狀寡糖(cyclicaloligosaccharide),特別地,來自環糊精,其可以是中性或帶電的,天然的(環糊精α、β、Υ、δ和ε)、分枝的或聚合的，或者甚至經化學修飾的，例如，通過用基團(如烷基、芳基、芳基烷基、糖苷基團)替代一個或多個羥丙基，或通過與醇、脂肪酸進行醚化、酯化作用。
[0060]本發明的含環糊精聚合物可以是線狀、分枝或接枝的(grafted)。當本文所用時，術語“線狀含環糊精聚合物”是指包含(α、β、Y、δ和ε )環糊精分子的聚合物，或其插入聚合物鏈的衍生物。
[0061]關于包含有包括白蛋白的貨物組分的本發明運載體，本發明通常提供人血清白蛋白(HSA)。HSA是高度可溶的球狀蛋白質，Mr為65k，由585個氨基酸組成。HSA是血漿里最豐富的蛋白質，且占人血漿膠體滲透壓的70-80%。HSA的氨基酸序列含有總計17個二硫橋、I個游離巰基(Cys34)以及單個色氨酸(Trp214)。人血清白蛋白(HSA)有許多疏水結合位點(對于HAS內源性配體脂肪酸來說總計8個)且結合多種藥物，特別是中性和帶負電荷的疏水化合物(Goodman et al., ThePharmaco1gical BasisOf Therapeutics,Twelfth ed, McGraw-Hill NewYork(2011))。在 HSA 的 IIA 和 IIIA 亞結構域中已提出兩個高親和力結合位點，其是非常長的疏水袋(hydrophobic pocket),靠近表面有帶電荷的賴氨酸和精氨酸殘基，其用作極性配體特征的連接點(參見，如Fehskeet al., Biochem.PharmcOl.,30,687-92 (1981), Vorum, Dan.Med.Bull.,46,379-99 (1999), Kragh-Hansen,Dan.Med Bull.，1441，131-40(1990)，Curryet al.，Nat.Struct.BiOl.,5,827-35(1998),Sugio et al., Protein.Eng.,12,439-46 (1999), He et al., Nature,358,209-15 (1992),和 Carter et al.,Adv.Protein.Chem.,45,153-203(1994))。紫杉醇(Abraxane?)和異丙酚已顯示出與 HSA 結合(參見，如 Paal et al.,Eur.J.Biochem.，268 (7)，2187-91 (2001)，PurcelI et al., Biochim.Biophys.Acta,1478 (I),61-8 (2000), Altmayer et al.，Arzneimittelforschung,45,1053-6(1995), and Garrido etal., Rev.Esp.AnestestiOl.Reanim.，41,308-12 (1994))。此外，多烯紫杉醇已顯示出與人血清白蛋白結合(參加，如Urien et al., Invest.New Drugs, 14 (2), 147-51 (1996))。不希望受任何具體理論的限制，認為在組合物中包含蛋白質(例如白蛋白)以形成本發明運載體的貨物組分可導致減少與施用治療劑相關的副作用，其至少部分是由于人血清白蛋白與組合物中存在的任何游離藥物結合。
[0062]治療劑
[0063]如上所述，根據本發明的貨物可以是治療劑本身或是包含治療劑的組合物，其中所述治療劑可通過將其連接到至少一個胱氨酸而引入細胞。所述治療劑可以是單個治療劑或可以是不同治療劑的組合。如在一個實施方案中了解的，治療劑(即藥物)包括但不限于小有機分子、無機分子、治療性肽和蛋白質、抗體、放射性同位素、用于基因治療的siRNA和核酸、在細胞內區室中為功能性的毒物，以及其可用來治療、診斷、抑制或防止疾病(即影響人體的異常情況，包括過度增殖性疾病如癌癥和非惡性腫瘤)進展。因此，在多個實施方案中，本發明的運載體包含化學治療劑。
[0064]本發明提供的治療劑類別的例子包括但不限于⑴激酶抑制劑，例如伊馬替尼(Glivec?)、ZD-1839 / 吉非替尼(Iressa?)、Bay43-9006 (索拉非尼、Nexavar?)、SUl 11248 /舒尼替尼(Sutent?)或0S1-774 /埃羅替尼(Tarceva?)、達沙替尼(Sprycel?)、拉帕替尼(Ty kerb?)或者參見下文，瓦他拉尼、凡德他尼(Zactima?)或帕唑帕尼；(ii)蛋白酶體抑制劑，如PS-341 /硼替佐米(Velcade?) ；(iii)熱休克蛋白90抑制劑，如17-烯丙氨基格爾德霉素(17-AAG) ；(iv)血管靶向劑(VTAs)，如考布他汀A4磷酸酯或AVE8062 / AC7700以及抗血管新生藥物，像VEGF抗體、如貝伐單抗(Avastin?)，或者KDR絡氨酸激酶抑制素如PTK787 / ZK222584 (瓦他拉尼)或凡德他尼(Zactima?)或帕唑帕尼；(V)單克隆抗體如曲妥珠單抗(Herceptin?)或利妥昔單抗(MabThera/Rituxan?)或阿侖單抗(Campath?)或托西莫單抗(Bexxar?)或C225 /西妥昔單抗(Erbitux?)或阿瓦斯丁(參見上文)或帕尼單抗以及單克隆抗體的突變體和綴合物，例如吉妥珠單抗奧唑米星(Gemtuzumab ozogamicin) (My1targ?)或替伊莫單抗(Ibritumomabtiuxetan) (Zevalin?)和抗體片段；(vi)基于寡核苷酸的治療劑，如G-3139 /奧利美生(Genasense?) ; (vii) Toll 樣受體(Toll-like receptor) / TLR9 激動劑如 Promune?，TLR7激動劑如咪喹莫特(Aldara?)或艾沙托立賓及其類似物，或TLR7 / 8激動劑如瑞喹莫德和作為TLR7 / 8激動劑的免疫剌激活性的RNA; (viii)蛋白酶抑制劑；(ix)激素治療劑，如抗雌激素(如他莫西酚或雷普洛芬)、抗雄激素(如氟他米特或康士德)、LHRH類似物(如亮丙瑞林、戈舍瑞林或曲普瑞林)以及芳香酶抑制劑。
[0065]本發明提供的特別的治療劑的例子包括但不限于5FU、放線菌素D、阿巴瑞克(Abarelix)、阿昔單抗(Abciximab)、阿克拉霉素(Aclarubicin)、阿達帕林(Adapalene)、阿侖單抗(Alemtuzumab)、六甲蜜胺(Altretamine)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、氨普利糖(Amiprilose)、氨柔比星(Amrubicin)、阿那曲唑(Anastrozole)、安西他濱(Ancitabine)、青蒿素(Artemisinin)、咪唑硫票呤(Azathioprine)、巴利昔單抗(Basiliximab)、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝伐單抗(Bevacizumab)、托西莫單抗(Bexxar)、比卡魯胺(Bicalutamide)、爭光霉素(Bleomycin)、硼替佐米(Bortezomib)、溴服苷(Broxuridine)、白消安(Busulfan)、阿侖單抗(Campath)、希羅達(Capecitabine)、卡鉬(Carboplatin)、卡波醌(Carboquone)、卡莫司汀(Carmustine)、西曲瑞克(Cetrorelix)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、雙氯乙基甲胺(Chlormet hine)、順鉬(Cisplatin)、克拉屈濱(Cladribine)、氯米芬(Clomifane)、環憐酉先胺(Cyclophosphamide)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、達利珠單抗(Daclizumab)、更生霉素(Dactinomycin)、達沙替尼(Dasatinib)、柔紅霉素(Daunorubicin)、地西他濱(Decitabine)、地洛瑞林(Deslorelin)、右丙亞胺(Dexrazoxane)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、柔紅霉素(Doxorubicin)、屈洛昔芬(Droloxifene)、屈他雄酮(Drostanolone)、依地福新(Edelfosine)、依洛尼塞(Eflornithine)、乙啼替氟(Emitefur)、表柔比星(Epirubicin)、環硫雄醇(EpitiostanOl)、依鉬(Eptaplatin)、愛必妥(Erbitux)、埃羅替尼(Erlotinib)、雌氮芥(Estramustine)、依托泊苷(Etoposide)、依西美坦(Exemestane)、法倔唑(Fadrozole)、非那雄胺(Finasteride)、氟尿苷(Floxuridine)、氟胞啼卩定(Flucytosine)、氟達拉濱(Fludarabine)、氟尿啼P定(Fluorouracil)、氟他米特(Flutamide)、福美司坦(Formestane)、勝甲酸(Foscarnet)、憐雌酌.(FosfestrOl)、福莫司汀(Fotemustine)、氟維司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、Genasense、吉西他濱(Gemcitabine)、格列衛(Glivec)、戈舍瑞林(Goserelin)、胍立莫司(Gusperimus)、赫賽汀(Herceptin)、伊達比星(Idarubicin)、碘苷(Idoxuridine)、異環憐酸胺(Ifosfamide)、伊馬替尼(Imatinib)、英丙舒凡(Improsulfan)、英夫利昔(Infiiximab)、伊立替康(Irinotecan)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、蘭瑞肽(Lanreotide)、拉帕替尼(Lapatinib)、來曲唑(Letrozole)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、洛鉬(Lobaplatin)、環己亞硝服(Lomustine)、Luprolide、美法侖(Melphalan)、疏_ 呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、美妥替哌(Meturedepa)、米鉬(Miboplatin)、米非司酮(Mifepristone)、米替福新(Miltefosine)、米立司亭(Mirimostim)、米托胍腙(Mitoguazone)、二溴衛矛醇(MitolactOl)、絲裂霉素(Mitomycin)、米托蒽酉昆(Mitoxantrone)、咪唑立賓(Mizoribine)、莫特沙芬(Motexafin)、吉妥單抗(Mylotarg)、那托司亭(Nartograstim)、Nebazumab、奈達鉬(Nedaplatin)、尼魯米特(Nilutamide)、尼莫司汀(Nimustine)、奧曲月太(Octreotide)、奧美昔芬(Ormeloxifene)、奧沙利鉬(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、帕利珠單抗(Palivizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、帕土匹龍(Patupilone)、帕唑帕尼(Pazopanib)、培門冬酶(Pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(Pegfilgrastim)、培美曲塞(Pemetrexed)、噴曲妝(Pentetreotide)、噴司他丁 (Pentostatin)、培磷酰胺(Perfosfamide)、嗪消安(Piposulfan)、吡柔比星(Pirarubicin)、普卡霉素(Plicamycin)、波尼莫司汀(Prednimustine)、甲節餅(Procarbazine)、丙帕錯(Propagermanium)、丙螺氯胺(ProspidiumChloride)、雷洛昔芬(Raloxifen)、雷替曲塞(Raltitrexed)、雷莫司汀(Ranimustine)、豹娃酶(Ranpirnase)、拉布立酶(Rasburicase)、雷佐生(Razoxane)、利妥昔單抗(Rituximab)、利福平(Rifampicin)、利曲舒凡(Ritrosulfan)、羅莫妝(Romurtide)、魯伯斯塔(Ruboxistaurin)、沙格司亭(Sargramostim)、塞特鉬(Satraplatin)、雷帕霉素(Sirolimus)、索布佐生(Sobuzoxane)、索拉非尼(Sorafenib)、螺莫司汀(Spiromustine)、鏈脲霉素(Streptozocin)、舒尼替尼(Sunitinib)、三苯氧胺(Tamoxifen)、他索爾明(Tasonermin)、喃氟唳(Tegafur)、替莫泊芬(Temoporfin)、替莫唑胺(Temozolomide)、替莫泊苷(Teniposide)、睪內酯(Testolactone)、塞替派(Thiotepa)、胸腺法新(Thymalfasin)、硫米票呤(Tiamiprine)、拓撲替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、Trail、曲妥單抗(Trastuzumab)、蘇消安(Treosulfan)、三亞胺醌(Triaziquone)、三甲曲沙(Trimetrexate)、曲普瑞林(Triptorelin)、曲憐胺(Trofosfamide)、烏瑞替派(Uredepa)、戊柔比星(Valrubicin)、瓦他拉尼(Vatalanib)、凡德他尼(Vandetanib)、維替泊芬(Verteporfin)、長春花堿(Vinblastine)、長春新堿(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)、伏氯唑(V orozole)和澤娃靈(Zevalin)。
[0066]用于向患者施用以治療或預防疾病的包含治療劑的本發明運載體的量會隨藥物種類而變化，且會包含其治療有效量。用來治療多種病癥的治療劑劑量在本領域內是公知的。就這點的說明，例如，Goodman&Gilman ' s The Pharmacological BasisOfTherapeutics，2011，Twelfth Edition, McGraw-Hill, New York。
[0067]診斷劑
[0068]如上文所述，本發明的運載體也可包含一種或更多種不同的診斷劑，即診斷標記物。在多個實施方案中，本發明的運載體包含一種或更多種診斷劑與一種或更多種治療劑的組合。
[0069]在多個實施方案中，本發明的運載體包含熒光物質，例如，本發明的熒光物質可選自但不限于異硫氰酸酯熒光素(FITC)、羅丹明、FAM、發光物質如魯米諾、螢光素、光澤精或熒光藥物化合物(如蒽環類藥物，如柔紅霉素)或其任意組合。[0070]在多個實施方案中，本發明的運載體包含電子致密物質(electron densesubstance)。例如,本發明的電子致密物質可選自但不限于鐵蛋白、膠體金或膠體超順磁性珠。
[0071]在多個實施方案中，本發明的運載體包含報告分子。例如，本發明的報告分子可選自但不限于允許在低濃度下直接或間接檢測化合物的取代基。合適的報告分子部分包括但不限于⑴酶，其產生可檢測信號，例如通過顯色、熒光或發光，比如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；(2)發色團，如熒光、發光或染料化合物；
(3)具有可通過電子顯微鏡或者通過其電學特征檢測(例如電導、電流分析、伏安法或阻抗測量)的電子密度的基團；和⑷可使用光學方法(如衍射、表面等離子體共振或接觸角變化)或者物理方法(如原子力光譜或隧道效應)檢測的基團。其他合適的報告分子部分包括但不限于，生物素、洋地黃毒苷(digoxigenin)、肽、蛋白質、抗體、糖蛋白和糖類。作為本發明診斷劑的特異性結合部分的例子包括抗原結合結構域、生長因子、配體或寡核苷酸。
[0072]在多個實施方案中，本發明的運載體包含放射性物質。例如，本發明的放射性物質可選自但不限于3H、14C、32p、33p、35S、1231、125I和131L治療方法
[0073]如上文所述，根據本發明的治療方法施用治療有效量的運載體，如上文所描述，從而以治療疾病為目的細胞內遞送治療劑至個體。在多個實施方案中，本發明的方法治療過度增殖性病癥。如本文所理解的，“過度增殖性病癥”指以細胞的異常或病理性增殖為特征的病癥，例如包括但不限于腫瘤、癌癥、瘤性組織和其他惡化前的和非腫瘤的或非惡性的過度增殖性病癥。可通過本發明治療的腫瘤、癌癥和瘤性組織的例子包括但不限于惡性病癥，如乳腺癌、骨肉瘤、血管肉瘤、纖維肉瘤和其他肉瘤；白血病；淋巴瘤；竇瘤；卵巢、尿道、膀胱、前列腺和其他泌尿生殖系統癌癥；結腸、食道和胃癌以及其他胃腸癌癥；肺癌；骨髓癌；胰腺癌；肝癌；腎癌；內分泌相關癌癥；皮膚癌；以及腦或中樞和周圍神經系統(CNS)惡性或良性的腫瘤，包括神經膠質瘤和成神經細胞瘤。
[0074]惡化前的和非瘤性或非惡`性的過度增殖性病癥的例子包括但不限于骨髓增生病癥；子宮頸原位癌；家族性腸息肉病如加德納綜合征；口腔粘膜白斑病；組織細胞增生癥；瘢痕瘤；血管瘤；過度增殖性動脈狹窄、炎性關節炎；表皮角化病和包括關節炎在內的鱗屑狀出疹。也包括病毒引起的過度增殖性疾病，如疣和EBV誘導的疾病(即傳染性單核細胞增多癥)、疤痕形成等。本文公開的治療方法可用于已知或懷疑攜帶有本文所定義的過度增生性病癥或具有發展成本文所定義的過度增生性病癥的風險的任何對象。
[0075]在本文中使用時，過度增生性病癥的“治療”指的是殺死、抑制或減緩過度增殖細胞團或群的生長或尺寸增加或者腫瘤或癌生長減少過度增殖細胞的數量，或者防止散布到其他解剖學部位，以及降低過度增殖性生長大小或過度增殖細胞數量的方法。“治療”也包括通過遞送診斷劑至靶細胞以允許用本領域已知的檢測方法來鑒定靶細胞的過度增殖性病癥的診斷。如本文所使用的，“治療”不一定意在暗示治愈或完全消除過度增生性生長。如本文所使用的，治療劑的治療有效量是指這樣的量，其有效地導致殺死過度增殖細胞、減緩過度增殖細胞的生長速率、降低過度增殖細胞團的大小、或減少過度增殖細胞的數量以及其組合。
[0076]本發明的治療方法還包括聯合治療，其包括以下實施方案:其中本發明的兩種或更多種運載體分別包含不同治療劑或治療劑組合，且共施用患者。在另一些實施方案中，本發明的運載體或本發明運載體的組合可以與另一種治療聯合施用。除了與任何藥物(包括上文所提供的藥物和藥物類別)共施用之外，本發明的運載體也可以與其他類型的治療聯合施用，如輔助治療和新輔助治療(如，在主要治療(primary therapy)之后進行的治療來增加長期無病生存的機會)、生物治療(如，免疫療法、生物療法或生物反應調節物療法)、骨髓移植和外周血干細胞移植、癌癥疫苗治療、冷凍手術、基因治療、激素治療、激光療法(如，高強度光來治療癌癥)、光動力療法、放射治療、預防性乳房切除手術、放射治療、或其他本領域技術人員已知的靶向癌癥療法。
[0077]術語“治療”還包括通過將診斷標記物運進細胞內部區室來診斷疾病的組合物和方法。更特別的說，可以通過連接到本領域的技術人員認為對于通過本發明的方法檢測和診斷的特定疾病來說是合適的可檢測標記物部分(例如熒光標簽、電子致密物、報告部分、特異性或非特異性結合部分、放射性或其他本領域已知的可檢測部分)對本發明的運載體進行可檢測標記。為診斷目的而施用的本發明運載體的量應包含用于既定目的的有效量診斷標簽。此量可根據經驗來確定，且在領域內也是公知的。
[0078]診斷方法
[0079]在多個實施方案中，用診斷標記物標記本發明運載體的胱氨酸組分，而在另一些實施方案中，用診斷標記物標記所述運載體的貨物組分。在另一些實施方案中，用相同或不同的診斷標記物標記所述運載體的胱氨酸和貨物組分。
[0080]可應用本發明診斷方法的組織的例子包括但不限于:癌細胞，其包括中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、肝癌、肺、頭頸癌、淋巴癌、白血病、多發性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、腎腫瘤、肉瘤、結腸和其他胃腸癌、轉移(metastases)和黑素瘤。更詳細的說，本發明可應用于肉瘤和癌，例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’ s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞癌、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wi lms' tumor)、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮細胞癌、神經膠質瘤、星細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室鼓膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽覺神經瘤、少突膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、眼癌；白血病,如急性淋巴細胞性白血病和急性骨髓細胞性白血病(原粒細胞、早幼粒細胞、骨髓單核細胞、單核細胞和紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓性(粒細胞性)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；以及真性紅細胞增多癥、淋巴瘤(霍奇金氏疾病和非霍奇金氏疾病)、多發性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血病以及重鏈病。
[0081]可用于實施本發明的檢測方法包括但不限于磁共振、超導量子干涉器件(squid)、光學成像、正電子放射斷層成像技術、平面閃爍掃描或單光子發射計算機化斷層成像(SPECT)。其他可替代的檢測方法包括gamma計數、閃爍計數、掃描射線成像(scanningradiogram)、密度計量、熒光照相以及電子顯微鏡成像。這些檢測方法可在施用本發明的肽復合物之后的診斷或成像中或在診斷或成像后的一段有效時間間隔后使用。這樣的有效時間間隔在本領域內是公知的，或者能夠通過使用例如本文所公開的方法的常規實驗所確定。[0082]制劑
[0083]如上文所描述，根據需要，本發明的運載體可配制成藥物劑量形式并施用于需要治療的對象，例如哺乳動物，如人患者，其為適于所選施用途徑的多種形式，例如，經口、經胃腸、經粘膜、經皮膚、胃腸外、靜脈內、肌內、皮下、皮內、關節內、鞘內以及通過輸注(infusion)或注射的腹膜內，包括用本領域技術人員可利用的泵進行的連續輸注或間歇輸注或者直接注射進過度增殖性組織或細胞。
[0084]所述藥物組合物可以包封在硬殼或軟殼明膠膠囊中，可以被壓成片劑，或者可直接與患者的食物合并。對于經口治療施用，本發明的運載體可與一種或更多種賦形劑組合，并且以可攝取片劑、含片、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、薄片(wafer)等形式使用。本發明的運載體可以與細惰性粉末載體組合并被對象吸入或吹入。
[0085]片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可包含以下:粘合劑例如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑例如磷酸氫鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；和甜味劑例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜，或調味劑如胡椒薄荷、冬青油、或櫻桃調味劑可以添加。當單位劑型是膠囊時，除上述類型的材料之外，它可包含液態載體(carrier)，例如植物油或聚乙二醇。多種其它材料可以以包衣形式存在或者以其他方式修飾固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可用明膠、蠟、蟲膠或糖等進行包衣。糖漿劑或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果攘作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調味劑如櫻桃或橙子香料。當然，用于制備任何單位劑型的任何材料應該是可藥用的，并且在所用的量上是基本上無毒的。此外，本發明的運載體可加入到持續釋放制劑和裝置中。
[0086]本發明運載體的溶液可在水中制備，可選地與無毒的表面活性劑混合。分散體也可在甘油、液態聚乙二醇、乙酸甘油酯和其混合物以及在油中制備。在儲存和使用的常規條件下，這些制劑可含有防腐劑來防止微生物的生長。
[0087]適合于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散體或無菌粉末，其包含適于臨時制備無菌注射或輸注溶液或分散體的的本發明運載體。不論什么情況，最終的劑型應為無菌的、流動的且在制造和儲存環境下穩定的。液態載體可以是溶劑或液態分散介質，包括如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯和其合適的混合物。適當的流動性可通過下述方式維持，例如:i)如果本發明運載體的貨物包含脂質體，則為脂質體的形成；(ii)在分散體或通過使用表面活性劑的情況下，通過維持所需的微粒尺寸。可通過多種抗菌劑和抗真菌劑發生(例如，對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酹、山梨酸、硫柳萊(thimerosal)等)來防止微生物的作用。在許多情況下，包含等滲劑(例如，糖類、緩沖液或氯化鈉)是優選的。可通過在組合物中使用延遲吸收的物質(例如單硬脂酸鋁和明膠)來產生可注射組合物的延長吸收。
[0088]根據需要，通過將合適溶劑中所需量的本發明運載體與上面列舉的其他成分合并然后過濾滅菌來制備無菌注射溶液。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末來說，優選制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其生成活性成分的粉末加之前無菌過濾溶液中存在的任何其他所需成分的粉末。
[0089]對于表面(topical)施用來說，本發明的運載體可以以純的形式應用。然而，將它們以與皮膚可接受的載體(carrier)(其可以是固體或液體)相組合之制劑的形式施用于皮膚通常是理想的。有用的固體載體包括細顆粒固體，如云母、黏土、微晶纖維素、硅石、氧化鋁等。其他固體載體包括無毒的聚合納米顆粒或微粒。有用的液體載體包括水、醇或乙二醇或水/醇/乙二醇混合物，其中本發明的運載體可以以有效水平溶解或分散，可選地借助于無毒表面活性劑。可加入例如芳香劑和額外抗微生物劑的助劑以優化給定應用的性質。所得的液體組合物可從吸收墊(absorbent pad)應用，用以浸滲繃帶和其他敷料,或者使用泵式或氣溶膠噴霧器噴在受影響區域。
[0090]為了直接施用于使用者的皮膚，還可將增稠劑例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物質與液態載體一起使用以形成可涂布的糊劑、凝膠、膏、皂等。可用來向皮膚遞送本發明運載體的有用皮膚病學組合物的實例是本領域已知的；例如，見 Jacquet et al.(美國專利號 4，608，392)、Geria (美國專利號 4，992，478) Smithetal.(美國專利號 4，559，157)和 Wortzman(美國專利號 4，820，508)。
[0091]可以通過比較本發明運載體的體外活性和在動物模型中的體內活性來確定它們的有用劑量。將小鼠和其它動物中的有效劑量外推至人的方法是本領域已知的；例如，見美國專利號4，938，949。治療需要的本發明運載體的量隨所選的特定治療劑、組合物(如果有組合物的話，其包含治療劑)、施用途徑、治療病況的性質及患者年齡和狀況而變化，并且最終會由住院醫師(attendant physician)或臨床醫師決定。
[0092]治療有效量可通過本領域技術人員已知的常規過程根據經驗來確定。參見，如，The Pharmacological BasisOf Therapeutics， Goodman and Gilman， eds.， MacmillanPublishing C0.,New York。例如,最初可在細胞培養測定或合適的動物模型中估計有效劑量。動物模型也可用來確定合適的濃度范圍和施用途徑。然后這類信息可用來確定在人中的有用劑量和施用途徑。也可通過可比較的治療劑的劑量類推的方法來選擇治療劑量。
[0093]特定的施用模式和給藥方案會由主治醫師考慮病例的細節(如對象、疾病、有關的疾病狀態以及治療是否是預防性的)來選擇。治療可以涉及數天至數月或者甚至幾年時間段內每日或每日多次(mult1-daily)化合物的劑量。
[0094]實施例`
[0095]實施例1.裝載柔紅酶素(DNR)的脂質體的制備
[0096]通過薄膜水化法由二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)和膽固醇12: I: 5比例總重20mg的脂質混合物制備脂質體。脂質混合物溶解于5至8ml的氯仿中，然后于室溫真空條件在圓底燒瓶中旋轉蒸發來產生薄脂質膜。向產生的脂質膜添加2至3ml的緩沖溶液，其為20mM的硼酸鈉和0.15M的NaCl，pH為8.4。使經緩沖的溶液與脂質膜一起放置15分鐘。然后將經緩沖的溶液-脂質膜混合物渦旋混合，通過超聲勻衆2分鐘,然后用迷你擠出器通過具有IOOnm Whatman?柱孔濾膜(GE Healthcare)的聚碳酸酯膜擠出10次。在擠出工序進行完后，脂質體溶液在_80°C冷凍并凍干。然后凍干的空脂質體在_20°C儲存直至使用。
[0097]通過以下方式用DNR裝載空脂質體:將11.56mg已經溶解于500 μ I無菌PBS中的柔紅霉素鹽酸鹽添加至凍干的脂質體粉末，在37°C孵育DNR-脂質體混合物I小時，然后將無菌PBS中的混合物稀釋到總體積為2ml，以及在37°C額外孵育I個小時。在脂質體-DNR混合物中的最終DNR濃度為10mM。通過用移液器抽吸來混合脂質懸液從而分散脂質體，隨后以13，OOOrpm離心40分鐘來移除未包裹的DNR。在離心步驟后，上清液被移除然后向沉淀中加入2ml的無菌PBS，通過移液器抽吸對沉淀進行重懸浮。
[0098]通過使用Nicomp ?380 微粒粒徑檢測儀(Particle Sizing Systems, SantaBarbara, CA)測量DNR-脂質體顆粒的尺寸。為了制備用于尺寸測量的脂質體，將Img的脂質體DNR在ImlPBS中進行超聲處理大約1_2分鐘，然后用PBS稀釋至體積為2ml。然后，根據廠家說明通過Nicomp?微粒粒徑檢測儀測量PBS懸浮的脂質體。
[0099]通過直接測量脂質體中的DNR來評估在特定脂質體DNR制劑中的DNR量，測量通過在455nm波長使用UV-VIS分光光度計(UVShinandzu)以及將吸光度與吸光度相對DNR濃度的標準曲線來進行，其顯示在圖4中。基于DNR-脂質體制劑中存在的DNR量，然后根據下式計算包裹效率:包裹效率(％)=Ft / FiX 100，其中Ft是在氯仿:甲醇:水(2:1: 0.05)組成的有機溶劑混合物中溶解后脂質體中DNR的濃度，而Fi是在包裹前DNR在介質中的初始濃度。通常，脂質體DNR的包裹效率為20%至25%。
[0100]實施例2.胱氨酸脂質體DNR的制備
[0101]如在實施例1中所描述，通過擠出步驟制備了空脂質體。在擠出脂質體后，將4ml的0.6M高碘酸鈉溶液添加到脂質體懸液中，于黑暗中將混合物放置使之反應30分鐘。這個步驟氧化了脂質體表面的糖脂部分。在高碘酸鈉反應步驟后，將高碘酸鈉-脂質體混合物裝入透析管(M.W14，000KD，Spectrum labs)中，在4°C相對于水透析12小時以此來移除任何未反應的高碘酸鈉。通過如下所述進行的還原胺化反應將胱氨酸分子綴合到t高碘酸鹽氧化的脂質體表面。首先，將60mg的胱氨酸溶解在如實施例1描述的經緩沖溶液中(20mM硼酸鈉和0.1SM NaCl，pH為8.4)至IOmg / ml濃度。將透析后的脂質體懸液和胱氨酸溶液混合并放置使之反應以形成希夫堿(Schiff-base)。然后，將每ml混合物10 μ I的2Μ氰基硼氫化硼(cyanoboronhydride)溶液被加入到脂質體懸液_胱氨酸溶液混合物中，總混合物放置在室溫下過夜反 應，接下來使用14，000KD M.w透析管在4°C再一次針對水透析12小時來除掉未綴合的胱氨酸。透析后的脂質體懸液在_80°C冷凍并在冷凍干燥機中凍干。凍干的空胱氨酸綴合脂質體在_20°C儲存并在使用前重構。如實施例1中針對脂質體的DNR裝載所述地，進行胱氨酸-脂質體的DNR裝載步驟以及顆粒粒徑和DNR裝載效率分析。通常，胱氨酸脂質體DNR的包裹效率為15%至20%。
[0102]實施例3.添加游離DNR、脂質體DNR或胱氨酸脂質體DNR后DNR的細胞攝取
[0103]使用熒光激活細胞分選術(FACS)和熒光顯微鏡法檢測經游離DNR、脂質體DNR或胱氨酸脂質體DNR處理的A549人肺癌細胞系細胞中的熒光化合物DNR。A549細胞高度表達XcT轉運蛋白，因此，非常適合胱氨酸介導的攝取研究(Gatti&Zunino, 2005)。A549細胞在補加有10%熱滅活的FBS和I %抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI1640培養基中于37°C 5%二氧化碳的潮濕氣氛下在25cm2組織培養瓶中進行培養。根據標準的組織培養程序以單層形式培養A549細胞并每周進行兩次傳代直到細胞用于實驗。
[0104]對于DNR攝取實驗，如上文所述，對在25cm2組織培養瓶中培養的A549細胞進行胰蛋白酶消化、洗滌并通過將懸浮在2ml RPMI1640培養基的3 X 105個細胞放置在每個孔中重新接種入6孔組織培養板，所述培養基補加有10%熱滅活的FBS和1%抗生素。在上文描述的培養環境下使細胞休息24小時后，用下面的方式處理細胞。通過向培養基加入下面的DNR制劑對一式三份的孔進行處理:I)含10 μ M DNR的胱氨酸脂質體DNR ;2)含5 μ MDNR的胱氨酸脂質體DNR ；3)含10 μ M DNR的脂質體DNR ;4)含5 μ M DNR的胱氨酸脂質體DNR ;5) 10 μ M的游離DNR ;以及6) 5 μ M的游離DNR。將細胞與DNR制劑一起在37°C 5%二氧化碳的潮濕氣氛下孵育5小時。然后用FACS和熒光顯微鏡法來確定細胞的DNR攝取。
[0105]FACS分析。在用游離DNR、脂質體DNR或胱氨酸脂質體DNR處理A549細胞結束后，孔內的培養基被抽出以及用無菌PBS溶液洗滌。為了使細胞脫離瓶，將100 μ I至200 μ I的胰蛋白酶(0.25%w / v)添加至細胞，將細胞在胰蛋白酶溶液中孵育大約I至3分鐘，其后將Iml的生長培養基添加到每個孔中來停止胰蛋白酶反應。將每個孔中的所得細胞懸液以2000rpm在4°C離心3分鐘。抽出上清液，然后將細胞沉淀在500 μ I的無菌冰冷的PBS溶液中重懸浮。然后，將細胞懸液轉移至無菌聚苯乙烯管中。通過檢測FL3通道的熒光信號來量化DNR的細胞攝取。也確定了平均熒光強度值。未接收DNR或脂質體的Α549細胞用作陰性對照。圖5Α顯示了不同形式DNR制劑的平均熒光強度(MFI)。細胞DNR攝取表示為相對于10 μ M游離DNR的不同形式DNR制劑的平均熒光強度。顯示了平均值和S.Ε.Μ(平均標準誤差)(* * * p〈0.001為胱氨酸-脂質體DNR相對游離DNR于5 μ M和10 μ M濃度下，n=3 ；+++p<0.001為胱氨酸-脂質體DNR相對脂質體于5 μ M和10 μ M濃度下)。與用來計算圖5Α所示MFI的熒光強度相關聯的細胞計數的數量分別在圖5Β和圖5C中對于10 μ M和5μΜ DNR的量以圖(histogram)的形式報告。用兩因素ANNOVA和單因素ANOVA來確定統計比較，并分別使用Bonferonni事后檢驗和Tukey事后檢驗進行配對分析。使用GraphpadPrism ?5 (GraphPadSoftware, Inc.，San Diego, CA)進行全部計算。P 值小于 0.05 白勺差異被認為是統計學上顯著的。
[0106]熒光顯微鏡法。在用游離DNR、脂質體DNR或胱氨酸脂質體DNR處理A549細胞結束時，在A549細胞中通過熒光顯微鏡分析觀察細胞內DNR。用熒光顯微鏡在亮光或加了綠色濾鏡的熒光下觀察細胞。對于熒光成像，獲取了用天然熒光藥物DNR染色的細胞圖像。通過使用 NikonEclipse?Ti 系列倒置顯微鏡(Nikon Instruments, Inc.Melville, NY)分析DNR 的突光，以及通過使用 NIS Elements? 軟件(Nikon Instruments, Inc.Melville, NY)獲取圖像。
[0107]與上述FACS的結果、分析相一致的，相比于用游離DNR或脂質體DNR處理的細胞，用胱氨酸脂質體DNR處理的細胞中熒光顯微圖像顯示相對高的熒光。而且，與游離DNR的熒光相比，脂質體DNR的熒光未顯示任何差異。熒光顯微和流式細胞儀數據也一致，其顯示與脂質體DNR和游離DNR相比胱氨酸脂質體DNR的細胞攝取增強。對于分別用游離DNRjg質體DNR或胱氨酸脂質體DNR形式的10 μ M和5 μ M DNR處理的細胞的熒光顯微圖像，參見圖6Α和圖6Β。
[0108]實施例4.用谷氨酸預處理細胞抑制胱氨酸介導的從胱氨酸脂質體DNR之DNR細胞攝取
[0109]為了證明XcT轉運蛋白在從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取中所起的潛在作用，在引入胱氨酸脂質體DNR前用谷氨酸(其是通過K。—轉運蛋白攝取胱氨酸的特異性抑制劑)預處理Α549細胞。為了進行這些攝取抑制研究，將Α549細胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10 μ m或5 μ m量DNR的胱氨酸脂質體DNR進行處理，如上文實施例3所述，區別僅在于在引入DNR制劑前用5mM濃度的谷氨酸(Sigma-Aldrich)預處理30分鐘。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。FACS分析的結果顯示用5mM谷氨酸預處理在分別用10 μ M和5 μ M胱氨酸脂質體DNR形式的DNR處理的細胞中減少了大約1.3至2.1倍的DNR細胞攝取。參見圖7A，其顯示了谷氨酸未處理和處理的10 μ M和5 μ M胱氨酸脂質體DNR的DNR熒光的MFI，其中細胞DNR攝取表示為相對于以用10 μ M游離DNR處理的Α549細胞為基礎的熒光強度。在這些谷氨酸處理研究中，細胞計數相對于熒光強度之間的關系針對用含10 μ M和5 μ M DNR的胱氨酸脂質體DNR處理的Α549細胞在圖7Β和7C中分別顯示。
[0110]實施例5.低溫對胱氨酸脂質體DNR之DNR細胞攝取的影響。
[0111]檢測了低溫對從胱氨酸脂質體DNR之DNR細胞攝取的影響，以確定胱氨酸脂質體DNR的攝取是否是能量依賴性內吞過程。為了進行這些溫度研究，將Α549細胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10 μ M或5 μ M量DNR的胱氨酸脂質體DNR進行處理，如上文實施例3所述，區別僅在于對于受到低溫的細胞，在4°C進行與裝載了 DNR的胱氨酸脂質體制劑一起的5小時孵育。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。如圖8A和8B中用10 μ M和5 μ M裝載了 DNR的胱氨酸脂質體制劑處理的Α549細胞分別所示的，與在37°C條件下相比，在4°C條件下DNR的攝入減少了。因此，這些數據提出從胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取是能量依賴性過程。
[0112]實施例6.抑制胞膜窖介導型內吞對從胱氨酸脂質體DNR之DNR細胞攝取的影響。
[0113]考慮到實例5描述的低溫研究提出從胱氨酸脂質體DNR中攝取DNR涉及內吞，接下來進行下述DNR攝取研究:檢驗內吞作用特定機制的某些抑制物抑制從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取之能力的研究。這些研究首先嘗試確定從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取機制是否包含胞膜窖(caveolae)介導的內吞作用。更特別地，細胞松弛素(cytochalastin)D (胞膜窖介導的內吞作用的特異性攝取抑制物)用于在與胱氨酸脂質體DNR —起進行細胞培養前處理A549細胞。為了進行這些攝取抑制研究，將A549細胞一式三份地放在6孔板的孔中，并用包含10 μ M或5 μ M量DNR的胱氨酸脂質體DNR進行處理，如上文實施例3所述，區別僅在于在引入DNR制劑前用100 μ M濃度的細胞松弛素D (Sigma-Aldrich)對細胞預處理30分鐘。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。
[0114]FACS分析的結果顯示用100 μ M的細胞松弛素D進行預處理并未顯著地減少經10 μ M或5 μ M的胱氨酸脂質體DNR處理細胞的DNR細胞攝取。參見圖9Α，其顯示了在細胞松弛素D未處理和處理的已接受10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR的Α549細胞中的DNR熒光MFI。更特別地，單因素方差分析(ANOVA)顯示DNR的相對平均熒光強度顯示處理的顯著性差異(F3，8=588.73 ；Ρ<0.001)。進一步用Tukey事后檢驗分析圖9Α中的數據，顯示對于兩種濃度(10 μ M和5 μ Μ)，相比于未處理的胱氨酸脂質體DNR，經細胞松弛素處理的胱氨酸脂質體DNR的相對平均熒光強度沒有顯著性差異。相比于經細胞松弛素D預處理的細胞對從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取，從單獨施用的胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取也沒有任何差異，無論是加入ΙΟμΜ還是5μΜ量的DNR。參見圖9Β和9C。
[0115]實施例7.抑制網格蛋白介導的內吞作用對從胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取的影響。
[0116]接著實施例6中關于鑒定從裝載了 DNR的胱氨酸脂質體的DNR細胞攝取中所涉及內吞機制的討論，氯丙嗪(網格蛋白介導的內吞作用的特異性抑制物)用于下述DNR攝取研究中以確定從胱氨酸脂質體DNR之DNR攝取機制是否包括網格蛋白介導的內吞作用。通過將Α549細胞一式三份地放在6孔板的孔中進行這些研究，并用包含10 μ M或5 μ M量DNR的胱氨酸脂質體DNR處理，如上文實施例3所述，區別僅在于在引入DNR制劑前用100 μ g /ml濃度的氯丙嗪(Sigma-Aldrich)將細胞預處理30分鐘。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。
[0117]FACS分析的結果顯示用10 μ g的氯丙嗪進行預處理僅引起經ΙΟμΜ的胱氨酸脂質體DNR處理的細胞中DNR細胞攝取的輕微減少，并且在經5 μ M的胱氨酸脂質體DNR處理的細胞中DNR攝取未顯著減少。參見圖10Α，其顯示了在細胞松弛素D未處理和處理的已接受10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR的Α549細胞中的DNR熒光MFI。單因素方差分析顯示DNR的相對平均熒光強度顯示處理的顯著性差異(F3，8=85.74 ；P<0.001)。用Tukey事后檢驗對圖1OA中數據的進一步分析顯示與ΙΟμΜ的胱氨酸脂質體DNR相比，氯丙嗪處理的10 μ M胱氨酸脂質體DNR的相對平均熒光強度有輕微顯著增加(Ρ〈0.05)。相比于經氯丙嗪預處理的細胞對從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取，從單獨施用的胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取沒有任何差異，無論是添加10 μ M還是5 μ M量的DNR。參見圖1OB和10C。
[0118]實施例8.抑制大胞飲對胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取的影響。
[0119]接著實施例6中關于鑒定從裝載了 DNR的胱氨酸脂質體的DNR細胞攝取中所涉及內吞機制的討論，阿米洛利(大胞飲的特異性抑制物)用于下述DNR攝取研究以確定從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取機制是否包括大胞飲。通過將Α549細胞一式三份地放在6孔板的孔中進行這些研究，并用包含10 μ M或5 μ M量DNR的胱氨酸脂質體DNR處理，如上文實施例3所述，區別僅在于細胞在引入DNR制劑前用3mM濃度的阿米洛利(Sigma-Aldrich)預處理30分鐘。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。
[0120]FACS分析的結果顯示用3mM的阿米洛利進行預處理引起經10 μ M或5 μ M的胱氨酸脂質體DNR處理的細胞的DNR細胞攝取顯著減少。參見圖11Α，其顯示了在細胞松弛素D未處理和處理的已接受10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR的Α549細胞中的DNR熒光MFI。單因素方差分析顯示DNR的相對平均熒光強度表現出處理之間的顯著性差異(F3，8=98.53 ；P<0.001) O用Tukey事后檢驗對圖1lA中數據的進一步分析顯示經10 μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞在還經阿米洛利 預處理時相比于僅接受胱氨酸脂質體DNR時相對平均熒光強度顯著減少(Ρ〈0.05)。經5μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞在還經阿米洛利預處理時相比于僅接受胱氨酸脂質體DNR時相對平均熒光強度也顯著減少。圖1lb和IlC以圖形式顯示了，相比于僅僅經胱氨酸脂質體DNR處理的細胞，經阿米洛利預處理的分別經10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞的DNR細胞攝取減少(所用數據來自η=3中最好的)。
[0121]實施例9.去除細胞膜膽固醇對從胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取的影響。
[0122]接著實施例6中關于鑒定從裝載了 DNR的胱氨酸脂質體的DNR細胞攝取中所涉及內吞機制的討論，制霉菌素(nystatin)(抑制膽固醇依賴性細胞攝取的藥物)用于下述DNR攝取研究中以確定從胱氨酸脂質體DNR的DNR攝取機制是否涉及細胞膜膽固醇。通過將A549細胞一式三份地放在6孔板的孔中進行這些研究，并用包含10 μ M或5 μ M量DNR的胱氨酸脂質體DNR處理，如上文實施例3所述，區別僅在于細胞在引入DNR制劑前用100 μ g /ml濃度的制霉菌素(Sigma-Aldrich)預處理30分鐘。DNR攝取的FACS分析根據實施例3中描述的方案進行。
[0123]FACS分析的結果顯示用IOOyg/ ml的制霉菌素進行預處理未引起經10 μ M DNR,或5 μ M的胱氨酸脂質體DNR處理細胞的DNR細胞攝取的顯著減少。參見圖12Α，其顯示了在制霉菌素未處理和處理的已接受10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR的Α549細胞中的DNR熒光MFI。單因素方差分析顯示DNR的相對平均熒光強度表現出處理之間的顯著性差異(F3，8=271.8 ;Ρ〈0.001)。用Tukey事后檢驗對圖12Α中數據的進一步分析顯示用10 μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞在還經制霉菌素預處理時相比于僅接受胱氨酸脂質體DNR的相對平均熒光強度無顯著性差異。另外，顯示了，相比于僅經10 μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞，經制霉菌素預處理的經10 μ M胱氨酸脂質體DNR處理的細胞的相對平均熒光強度有輕微顯著減少(ρ〈0.05)。圖12Β和12C顯示了，相比于僅僅經胱氨酸脂質體DNR處理的細胞，經制霉菌素預處理的從10 μ M或5 μ M胱氨酸脂質體DNR的DNR細胞攝取輕微減少。
[0124]實施例10.用胱氨酸脂質體DNR處理后的DNR介導細胞毒性
[0125]因為DNR是細胞毒性化合物，所以通過依靠細胞毒性測量以作為DNR攝取的度量從而評估胱氨酸脂質體DNR作為細胞內遞送系統的有效性。胱氨酸脂質體DNR的對照包括游離DNR和不包含胱氨酸的脂質體DNR。如下所示在Α549細胞中測量細胞毒性:向細胞內加入前述DNR制劑，接著經過一段孵育期，之后通過使用MTS測定來測量細胞毒性。簡要地說，MTS檢測是四唑化合物(3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧甲氧基苯基)-2- (4-磺基苯基)-2Η-四唑，內鹽；MTS)和電子耦合試劑吩嗪硫酸甲酯(PMS)的非放射性細胞增殖檢測。MTS被細胞利用代謝活性細胞中存在的還原酶生物還原為甲躦化合物。甲躦化合物的吸光度可在490nm波長下測量，且直接與活細胞數量成比例。使用劑量反應曲線確定ICki來測定毒性。IC5tl是將細胞的光吸收能力降低50%所需的檢測化合物的濃度。
[0126]通過將20% MTS和I % PMS溶液在體積為8ml的RPMI1640培養基中混合來制備MTS試劑。在從孔中去除生長培養基之后，將100 μ I這種所制備的MTS試劑加入到每個孔中，并于37°C 5% CO2的潮濕氣氛下孵育4小時。活細胞將MTS還原成有色的甲躦產物并且其溶解于培養基中。甲躦的量在490nm波長下進行測量。
[0127]通過以下方式產生裝載了 DNR的脂質體制劑的劑量-反應曲線:將懸浮在100 μ IRPMI1640培養基的5Χ IO3個細胞放置在96孔板的每個孔中，并于37°C 5% CO2的潮濕氣氛下孵育24小時。孵育后，如實施例4所描述，細胞用5mM的胱氨酸攝取抑制物谷氨酸預處理30分鐘。谷氨酸添加的對照孔用僅僅50 μ I的RPMI培養基代替。在37°C 5% CO2的潮濕氣氛下孵育半小時。裝載了 DNR的胱氨酸脂質體、游離DNR和脂質體DNR被連續稀釋使得稀釋系列的最終DNR濃度整體為2.5 μ M DNR、5 μ MDNR、10 μ M DNR和15 μ M DNR，其以200 μ I /孔懸浮在3個重復孔中72小時。培養板每邊的第一行未裝有細胞并不在檢測中使用，而是代之以裝入100μ I的PBS來減少任何污染或蒸發。劑量反應曲線使用Prism?軟件(San Diego, CA)來繪制。每個實驗都獨立進行兩次。IC5tl數據在圖13A中進行了報告。圖13B顯示了在用游離DNR、脂質體DNR或胱氨酸脂質體DNR處理72小時后A549細胞的存活。
[0128]表1顯示了對于游離DNR、胱氨酸脂質體DNR和裝載了 DNR的脂質體的IC5tl濃度。游離DNR、脂質體DNR和胱氨酸脂質體DNR的IC5tl濃度分別為15.25 μ MU0.25 μ M
4.44 μ Μ。也可參見圖13Α。脂質體DNR的IC50比游離DNR的IC50低1.5倍，這意味著脂質體DNR比游離DNR更有細胞毒性。胱氨酸脂質體DNR的IC5tl分別比游離DNR的IC5tl和脂質體DNR低3.5倍和2.3倍，這與細胞毒性的增加相關。
[0129]當如實施例4所描述的用5mM谷氨酸預處理A549細胞時，胱氨酸脂質體DNR的IC5tl濃度顯著增加。參見表1和圖14A。圖14B中所示圖顯示在不存在和存在5mM谷氨酸預處理的情況下經10 μ M和5 μ M濃度的游離DNR、脂質體DNR和胱氨酸脂質體DNR處理的細胞的存活。* * * ρ〈.0.001是5 μ M的胱氨酸脂質體DNR相對于5 μ M的胱氨酸脂質體+谷氨酸。
[0130]表1
【權利要求】
1.一種用于靶向遞送治療劑或診斷劑或這二者的運載體，所述運載體包含與貨物偶聯的胱氨酸分子，其中所述貨物是治療劑、診斷劑或這二者或者是包含治療劑、診斷劑或這二者的組合物。
2.權利要求1的運載體，其中所述胱氨酸分子通過化學鍵與所述貨物直接偶聯。
3.權利要求1的運載體，其中所述胱氨酸分子通過連接基團與所述貨物偶聯。
4.權利要求3的運載體，其中所述連接基團是聚乙二醇分子。
5.權利要求1的運載體，其中所述治療劑選自:小有機分子、無機分子、治療性肽和蛋白質、抗體、放射性同位素、用于基因治療的siRNA和核酸、毒物以及抗癌劑。
6.權利要求1的運載體，其中所述診斷劑選自:熒光物質、電子致密物、報告物部分、特異性結合部分和放射性物質。
7.權利要求1或2的運載體，其中所述貨物是包含所述治療劑的組合物，且所述組合物是脂質體。
8.權利要求7的運載體，其中所述治療劑選自:小有機分子、無機分子、治療性肽和蛋白質、抗體、放射性同位素、用于基因治療的siRNA和核酸、毒物以及抗癌劑。
9.用于治療癌癥的方法，其包括以下步驟: 向有此需要的患者施用治 療有效量的運載體以用于細胞內遞送治療劑、診斷劑或這二者，所述運載體包含與貨物偶聯的胱氨酸分子以用于細胞內遞送，其中所述貨物是治療劑、診斷劑或這二者或者是包含治療劑、診斷劑或這二者的組合物。
10.用于改善治療或診斷組合物之細胞內遞送的方法，其包括將胱氨酸分子與貨物偶聯以用于細胞內遞送的步驟，其中所述貨物是治療劑或診斷劑或者是包含治療劑或診斷劑的組合物。
11.藥物制劑，其包含: a)用于治療劑、診斷劑或這二者之細胞內遞送的運載體，所述運載體包含與貨物偶聯的胱氨酸分子以用于細胞內遞送，其中所述貨物是治療劑、診斷劑或這二者或者是包含治療劑、診斷劑或這二者的組合物；和 b)可藥用載體。
【文檔編號】A61K9/127GK103781471SQ201280043744
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2011年9月8日
【發明者】馬里亞·波利坎德里圖·蘭布羅斯, 黃英 申請人:健康科學西部大學