用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法
【專利摘要】本發明公開了用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，包括以下步驟：(1)以磷脂、膽固醇、維生素E為原料制備脂質膜；(2)將脂質膜用乙醚溶解，加載待包裹藥物，得到脂質體；(3)離心除去脂質體外未包裹的藥物；(4)加入鎂鹽，對脂質體進行修飾，得到脈沖電場敏感脂質體。本發明制備工藝簡單，脂質體對水溶性藥物的包封率高、性能穩定；在脈沖電場作用下釋放率高。
【專利說明】用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物制劑領域，特別涉及用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法。
【背景技術】
[0002]脂質體是單層或多層脂質雙分子膜以同心圓的形式包封而成，類似細胞膜的微球體，其主要成分為磷脂和膽固醇。20世紀70年代初用脂質體作為藥物載體包埋淀粉葡萄糖苷酶治療糖原沉積病首次獲得成功。此后，脂質體作為藥物載體具有使藥物靶向網狀內皮系統、延長藥效、降低藥物毒性、提高療效、避免耐受性、改變給藥途徑等優點，因而受到醫藥界的廣泛關注。但脂質體作為藥物載體仍存在對有些疾病的靶向特征不理想等缺點，因而限制了脂質體的臨床應用。近年來人們設計開發了溫度敏感脂質體、PH敏感脂質體、免疫脂質體、磁性脂質體等新型脂質體以提高脂質體的靶向性。
[0003]近二十年來，脈沖電場對細胞膜的電穿孔效應獲得了廣泛深入的研究，其作用機理是當外加電脈沖電場強度達到kV/cm量級，脈沖寬度為納米或者微秒量級時，由于磷脂雙分子層構成的細胞膜內部充滿著電解質和帶電荷的離子，在高壓電場脈沖作用下，細胞膜內各帶電物質在電場作用力下定向移動，并在磷脂雙分子層的兩側聚集，膜兩側電位差變大形成跨膜電壓，但跨膜電壓高于磷脂雙分子層臨界擊穿電壓時，脈沖電場則擊穿細胞的磷脂雙分子層，在細胞膜上形成親水性的小孔，從而細胞膜的通透性增加，有利于細胞吸收各種藥物、基因、蛋白質、其它大分子。同時，利用脈沖電場臨床上應用于腫瘤治療也進行了大量研究，脈沖電場可以引起腫瘤細胞內部出現一系列結構和功能的改變，同時誘導腫瘤細胞凋亡。脈沖電場誘導腫瘤細胞凋亡用于淺表腫瘤(乳腺癌、腋下癌癥、靠近胸壁癌癥等)病變治療，可以實現腫瘤的準確定位和微創治療，且避免了炎癥、潰瘍等。
[0004]鎂屬于人體營養素礦物質元素中的一種。人體中的鎂60-65%存在于骨骼和牙齒中，27%存在于軟組織中，細胞內鎂離子占I %，多以活性形式Mg2+-ATP形式存在。人體的生命活動離不開鎂離子。鎂離子作為酶的激活劑，參與300種以上的酶促反應。鎂離子參與糖酵解、脂肪酸氧化、蛋白質的合成、核酸代謝等，促進骨的形成，在骨骼中僅次于鈣、磷，是骨細胞結構和功能所必需的元素，對促進骨形成和骨再生，維持骨骼和牙齒的強度和密度具有重要作用；調節神經肌肉的興奮性，能抑制鉀、鈣通道。鎂、鈣、鉀離子協同維持神經肌肉的興奮性，鎂也是重要的神經傳導物質，它可以讓肌肉放松下來；維護胃腸道和激素的功能，與含鈣食品一同補充，能促進鈣的吸收。中國營養學會建議，成年男性每天約需鎂350mgo成年女性約為300mg。
[0005]中國發明專利CN201110340040.7公布了一種多西他賽pH敏感脂質體及其制備方法。該專利根據腫瘤附近的PH值比周圍正常組織低的事實，在脂質體的制備過程中加入的物質設計了 PH敏感脂質體。中國發明專利CN200480028904.X公布了一種具有糖鏈的靶向性和腸道吸收控制性脂質體制備方法。中國發明專利CN201210009962.4公布了一種表面修飾有腫瘤歸巢肽CREKA或具有CREKA核心序列的肽段的熱敏脂質體的制備方法，該專利利用相變溫度在人體體溫之上的磷脂制備脂質體，當局部超過磷脂的相變溫度時，月旨質膜由“凝膠態”轉到液晶結構，其磷脂的脂酰鏈紊亂度增加，膜的流動性增大，此時包封的藥物的釋放速率亦增大，從而達到同過控制病變部位的溫度達到定向釋放的效果。中國專CN201210052450.6公布了一種氯化鉀脂質體注射劑。
[0006]近年來新型脂質體的研究已從單一脂質體向多功能脂質體如pH敏感免疫脂質體、熱敏性脂質體、熱敏感長循環脂質體等方向發展。這些新型脂質體在穩定性、靶向性和療效方面都比傳統脂質體有明顯改善。但新型脂質體各自仍存在自身的缺點:
[0007](1)ρΗ敏感免疫脂質體易引起免疫反應；
[0008](2)熱敏性脂質體在病變部位的聚集是被動靶向分布，特異性有限，加熱時間過長可造成正常結締組織損傷；
[0009](3)熱敏感長循環脂質體由于親水性大分子的嵌入，在一定程度上降低了脂質體的熱敏性，在進行電療時，藥物釋放效率低。
[0010]隨著脂質體研究工作的不斷深入，不同理論互相滲透，互相補充，脂質體作為藥物載體所轉運的藥物種類和范圍將不斷擴大，有著廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0011]為了克服現有技術的上述缺點與不足，本發明的目的在于提供一種用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，制備工藝簡單，脂質體對水溶性藥物的包封率高、性能穩定，在脈沖電場作用下釋放率高。
[0012]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0013]用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，包括以下步驟:
[0014](I)將磷脂、膽固醇、維生素E用氯仿和乙醇的混合液進行溶解，并于旋轉蒸發儀減壓蒸干混合溶液形成脂質膜；然后，將脂質膜放入真空干燥箱中干燥，除去殘留氯仿和乙醇；
[0015](2)將步驟⑴處理后的脂質膜用乙醚進行溶解，溶解完全后得到乙醚和磷脂的混合液；向乙醚和磷脂的混合液中加入待包裹藥物的水溶液，水浴超聲處理，使混合液中的有機相和水相充分混合均勻；旋蒸去除乙醚，制得脂質體；將制得的脂質體用等滲葡萄糖溶液重懸，得到脂質體的懸浮液；
[0016](3)將脂質體的懸浮液在液氮或者_78°C的超低溫冰箱中冷凍、在室溫下溶解，混勻；反復凍融多次，然后，離心除去上清液，用等滲葡萄糖溶液重懸下層脂質體沉淀；反復離心多次，除去脂質體外未包裹的藥物，制得普通的脂質體；
[0017](4)將步驟(3)制備的脂質體用等滲葡萄糖溶液重懸，得到脂質體的懸浮液，向脂質體的懸浮液加入鎂鹽，溶解，孵化，即得脈沖電場敏感脂質體；所述鎂鹽的加入量為:每升脂質體的懸浮液加入10?10mg鎂鹽。
[0018]步驟(I)所述磷脂、膽固醇、維生素E的質量比為10:2:1?10:5:1。
[0019]步驟⑴所述氯仿和乙醇的混合液的體積比為9:1。
[0020]步驟⑵所述乙醚和磷脂的混合液與待包裹藥物的水溶液的質量比為3:1。
[0021]所述鎂鹽為粉末狀。
[0022]步驟⑵所述水浴超聲處理，具體為:
[0023]水浴超聲處理時溫度控制在O?10°C，時間為3?5min，超聲功率500?600W。
[0024]步驟(3)所述離心，具體為--離心力為10000?15000g，時間10?15min。重復離心的次數為4?10次。
[0025]步驟⑷所述孵化，具體為:孵化溫度為20?35°C，時間5?25min。
[0026]本發明的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體在脈沖電場作用下促進包裹物質釋放的技術原理如下:
[0027]鎂離子與脂質體相互作用研究表明，鎂離子與磷脂的頭部基團結合，脂質體的磷脂雙分子層的磷脂酰基鏈的有序性增加，雙分子層的流動性降低，從而使脂質體在水溶液中穩定性增加。同時脂質體上因為鎂離子的存在，鎂離子吸附在脂質體上、膜電位差增加，使脈沖電場作用下，細胞膜兩側電介質極化加強，使磷脂分子在脈沖電場作用下更易于極化，在脂質體的磷脂雙分子層兩側產生更高的跨膜電壓，隨著電場強度的增大和處理時間的延長，細胞膜極化加劇，膜兩側的電位差增大，兩側的異性離子之間就會產生相互吸引的庫侖力，此作用力相當于在膜的兩側施加了擠壓力，引起細胞膜厚度減小。當脈沖電場場強達到臨界崩解電壓V。時，細胞膜上形成小孔，使得細胞膜的通透性增加使內容物泄漏。不同離子對脂質體的相互作用研究表明，不同的離子與磷脂頭部基團的結合程度和極化位點也不同，Ca2+傾向于與一個磷脂頭部的C00—和另一個磷脂P04_。而Mg2+傾向于與兩個磷脂C00—或PO4-結合。因為不同離子結合位點的不同從而使其在脈沖電場作用下有不同的泄漏特性。
[0028]與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果:
[0029](I)本發明的脈沖電場敏感脂質體制備工藝簡單，脂質體對水溶性藥物的包封率高、性能穩定；在脈沖電場作用下釋放率高；
[0030](2)本發明的脈沖電場敏感脂質體可用于輔助脈沖電場治療腫瘤，將治療腫瘤的藥物用脈沖電場敏感脂質體進行包裹，制備成注射液；采用靜脈或者直接對病變部位進行注射，本發明的脂質體在血液循環運送過程中穩定高，脂質體內藥物釋放率低，與傳統的化療方法相比能有效降低化療藥物對正常組織的毒害；當藥物運送到病變部位時，在脈沖電場的作用下，使脂質體內部包裹藥物釋放，從而電脈沖輔助化療藥物能定向，高效的作用于腫瘤細胞，減少對非病變部位的損害，提高藥物的作用效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1為本發明的實施例制備得到的脈沖電場敏脂質體的粒徑分布。
[0032]圖2為本發明的實施例制備的包裹水溶性熒光素-羧基熒光素的脈沖電場敏感脂質體與普通脂質體的在脈沖電場作用下的對比圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結合實施例及附圖，對本發明作進一步地詳細說明，但本發明的實施方式不限于此。
[0034]實施例1
[0035]稱取250mg大豆卵磷脂、50mg膽固醇、25mg維生素E與50ml的旋轉蒸發瓶中，并用1ml的氯仿和乙醇的混合液(Vlw -.Vm= 9:1)充分溶解，在溫度為30°C下，旋轉蒸發儀(RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠)中減壓蒸發氯仿和乙醇混合液直至形成均勻的脂質膜。然后，在溫度為25°C下，真空干燥箱(DZF-6050，上海齊欣科學儀器有限公司)抽真空干燥15h，除去殘留的氯仿和乙醇。將脂質膜用9ml的乙醚充分溶解，得到乙醚和磷脂的混合液；乙醚和磷脂的混合液中加入3ml的0.05M的羧基熒光素水溶液。在溫度為5°C下，功率600 W水浴超聲3min，使兩相充分混勻后。在溫度低于10°C的條件下，抽真空旋轉蒸發3h去除乙醚，得到脂質體。將制得的脂質體用等滲葡萄糖溶液7ml重懸得脂質體的懸浮液。脂質體的懸浮液在溫度為_78°C的超低溫冰箱中冷凍10 min，然后在室溫下融解，重復凍融3次。高速冷凍離心機(JW-3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司)12000g離心力下離心15min去掉上層清液。用等滲葡萄糖溶液重懸下層脂質體沉淀，重復離心3次，去除未包裹的羧基突光素。最后，向制得的1ml脂質體葡萄糖懸浮液中加入0.5mg的氯化鎂溶解、混勻。在30°C下保溫lOmin，即制得本實施例的包裹水溶性熒光素-羧基熒光素的脈沖電場敏感脂質體。本實施例制備的脈沖電場敏感脂質體與普通脂質體在脈沖電場作用下的對比。如圖1所示，制得脂質體的平均粒徑為339.3nm，粒徑分布在131.2 - 766.0nm ;普通的脂質體在脈沖場強為2kV/cm、脈寬為4μ s的脈沖電場作用下釋放率為6.32%，本實施例制備的脈沖電場敏感脂質體的釋放率為20.85%，提高了 212.11%。
[0036]實施例2
[0037]稱取150mg蛋黃卵磷脂、75mg膽固醇、15mg維生素E于50ml的旋轉蒸發瓶中，并用10 ml的氯仿和乙醇的混合液(V_:Vm= 9:1)充分溶解，在溫度為35°C下，旋轉蒸發儀(RE-2000B，上海亞榮生化儀器廠)中減壓蒸發氯仿和乙醇混合液直至形成均勻的脂質膜。然后，在溫度為30°C下，真空干燥箱(DZF-6050，上海齊欣科學儀器有限公司)抽真空干燥10h，除去殘留的氯仿和乙醇。將脂質膜用9 ml的乙醚充分溶解得到乙醚和磷脂的混合液；乙醚和磷脂的混合液中加入3ml的0.05M的羧基熒光素水溶液。在溫度為8°C下，功率600W水浴超聲5min，使兩相充分混勻后。在溫度低于10°C的條件下，抽真空旋轉蒸發5h去除乙醚，得到脂質體。將制得的脂質體用等滲葡萄糖溶液7ml重懸得脂質體的懸浮液。在液氮中冷凍lOmin，然后在室溫下融解，重復凍融5次。高速冷凍離心機(JW-3021HR，安徽嘉文儀器裝備有限公司)15000g離心力下離心15min去掉上層清液。用等滲葡萄糖溶液重懸下層脂質體沉淀，重復離心5次，去除未包裹的羧基熒光素。最后，向制得的1ml脂質體葡萄糖懸浮液中加入0.5mg的粉末狀氯化鎂溶解、混勻。在30°C下保溫20min。即制得本實施例的包裹水溶性熒光素-羧基熒光素的脈沖電場敏感脂質體。本實施例制備的脈沖電場敏感脂質體與普通脂質體在脈沖電場作用下的對比。制得脂質體的平均粒徑為318.4nm，粒徑分布在131.2 - 671.8nm，如圖2所示，普通的脂質體在脈沖場強為lkV/cm、脈寬為10 μ s的脈沖電場作用下釋放率為7.85%，脈沖電場脂質體的釋放率為21.00%，提高了 167.51%。
[0038]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受所述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將磷脂、膽固醇、維生素E用氯仿和乙醇的混合液進行溶解，并于旋轉蒸發儀減壓蒸干混合溶液形成脂質膜；然后，將脂質膜放入真空干燥箱中干燥，除去殘留氯仿和乙醇； (2)將步驟(I)處理后的脂質膜用乙醚進行溶解，溶解完全后得到乙醚和磷脂的混合液；向乙醚和磷脂的混合液中加入待包裹藥物的水溶液，水浴超聲處理，使混合液中的有機相和水相充分混合均勻；旋蒸去除乙醚，制得脂質體；將制得的脂質體用等滲葡萄糖溶液重懸，得到脂質體的懸浮液； (3)將脂質體的懸浮液在液氮或者_78°C的超低溫冰箱中冷凍、在室溫下溶解，混勻；反復凍融多次，然后，離心除去上清液，用等滲葡萄糖溶液重懸下層脂質體沉淀；反復離心多次，除去脂質體外未包裹的藥物，制得普通的脂質體； (4)將步驟(3)制備的脂質體用等滲葡萄糖溶液重懸，得到脂質體的懸浮液，向脂質體的懸浮液加入鎂鹽，溶解，孵化，即得脈沖電場敏感脂質體；所述鎂鹽的加入量為:每升脂質體的懸浮液加入10?10mg鎂鹽。
2.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述磷脂、膽固醇、維生素E的質量比為10:2:1?10:5:1。
3.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述氯仿和乙醇的混合液的體積比為9:1。
4.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，步驟⑵所述乙醚和磷脂的混合液與待包裹藥物的水溶液的質量比為3:1。
5.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，其特征在于，所述鎂鹽為粉末狀。
6.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，步驟(2)所述水浴超聲處理，具體為: 水浴超聲處理時溫度控制在O?10°C，時間為3?5min，超聲功率500?600W。
7.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，步驟⑶所述離心，具體為--離心力為10000?15000g，時間10?15min。重復離心的次數為4?10次。
8.根據權利要求1所述的用于靶向釋放藥物載體的脈沖電場敏感脂質體的制備方法，步驟(4)所述孵化，具體為:孵化溫度為20?35°C，時間5?25min。
【文檔編號】A61K9/08GK104173287SQ201410353287
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】曾新安, 劉志偉, 孫大文, 韓忠, 王滿生 申請人:華南理工大學