一種可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球及其制備方法，該微球包括蛋白或多肽類藥物5～30份，聚乳酸類生物降解材料30～90份，納米生物活性玻璃5～50份。所述緩釋微球采用靜電紡絲技術制備，主要由聚乳酸類生物降解材料（PLGA（聚乳酸-羥基乙酸共聚物）或PLA（聚乳酸）)、生物玻璃和主藥組成。本發明利用可以極大促進蛋白多肽類藥物在制備過程中的活性保持能提高蛋白、多肽類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩定性。
【專利說明】一種可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明是一種可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球及其制備方法主要涉及醫藥領域。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術的高速發展，多肽、蛋白質類藥物不斷涌現。目前已有35種重要治療藥物上市，生物技術與生物制藥企業的發展也日益全球化。生物技術藥物研究的重點是應用DNA重組技術開發可應用于臨床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、細胞生長因子及單克隆抗體等。但這些藥物在胃腸道內穩定性差，易變性，易被消化酶降解，不易吸收，這些局限性影響了它們口服給藥的生物利用度。目前蛋白質類藥物大多采用注射方式給藥，因此如何減少注射次數/提高藥效成為蛋白、多肽類藥物注射給藥面臨的一個主要問題。[0003]目前多肽、蛋白質類藥物常用的劑型是注射用溶液劑或凍干粉針劑，它們在血液中的半衰期一般很短，靜脈注射后很快就被清除或降解，因此需要經常給藥，給病人帶來較多不便。因此，開展多肽、蛋白質類生物大分子藥物緩釋或控釋制劑的研究已成為該類藥物制劑研究的熱點。
[0004]目前生物大分子藥物緩控釋制劑研究涉及最多的是微粒遞釋系統，即采用生物可降解聚合物為囊材包裹多肽、蛋白質藥物制成微球制劑，使其在體內達到緩擇或控程目的。
[0005]聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是一種具有良好的生物相容性及生物降解性的高聚物，已被美國FDA批準為藥用高分子材料。現已有數個多肽類藥物長效注射微球產品批準上市，如曲普瑞林、丙氨瑞林、醋酸戈舍瑞林、奧曲肽此類微球制劑能使藥物延長釋放達I個月，甚至3個月。因此，以生物可降解聚合物為囊材的微囊化技術是開發研制多肽緩、控釋劑型的有效途徑，頗具發展前景。
[0006]采用生物降解型材料，尤其是聚乳酸類材料制成藥物微球可實現藥物的控釋或緩釋。目前國內、外將中藥蛋白藥物制成緩釋微球的研究報道較多，制備工藝主要有溶劑揮發法、相分離法、噴霧干燥法、沉淀析出法和凝聚法等。但多肽，蛋白類藥物緩釋微球制備、儲存和釋放過程中蛋白活性的損失又成為其廣泛應用的制約因素，究其原因主要有兩方面，一是在制備過程中，一些劇烈的機械力作用(如攪拌、超聲)及有機溶劑和乳化劑的接觸，導致蛋白聚集，變性，失活；二是在貯存和緩慢釋放時，聚合物降解產物使蛋白質周圍微環境的PH值下降，這種酸性環境易使蛋白質發生降解、聚合而變性。
[0007]目前國內外的科研工作者已通過改進微球制備方法與優選添加劑等方法來提高蛋白穩定性，并取得了一定的進展。(田瑞，王連艷，吳頡，張潔，曾燁婧，馬光輝.快速膜乳化法制備粒徑均一的PLGA微球和微囊[J].過程工程學報，2009, 9 (4): 754-762 ；RafiM.Dj Singh S.Mj Kanchan V，Anish C.Kj Panda A.K.Controlled release of bioactiverecombinant human growth hormone from PLGA microparticles[J].Journal of Microencapsulation.2010，27(6):552-560 ;樊莉.無水法制備干擾素-a -2b PLGA緩釋微球的研究[D].第二軍醫大學，2006)。但目前能夠成功同時保持多肽，蛋白類藥物在微球制備、儲存與體內外釋放過程中的生物學活性的報道仍然很少，極大限制了臨床應用。目前唯一上市的蛋白類緩釋注射微球是美國Genentech，Inc公司采用低溫噴霧提取法開發的重組人生長激素PLGA微球(Nutropin Depot?)0然而使用這種方法需要相應的設備，樣品需要量大，成本高，難于推廣，并且這種方法只能改善保持蛋白在緩釋微球制備過程中活性的保持，還不能實現長期釋放過程的蛋白的活性保持，美國Genentech，Inc公司已經于2004年停止該產品的生產和銷售。
[0008]靜電紡絲技術的基本原理是將聚合物溶液帶上高壓靜電，帶電的聚合物液滴在電場力的作用下在毛細管的Taylor錐頂點被加速，當電場力足夠大時，聚合物液滴克服表面張力形成噴射細流。細流在噴射過程中溶劑蒸發，最終落在接收裝置上，形成類似非織造布的纖維氈。
[0009]目前靜電紡絲技術已廣泛應用于復合材料、結構增強體、電化學傳感材料、骨架和組織工程材料的制造。在生物醫學領域，主要應用于組織工程的細胞生長支架的建立，并復合各種蛋白類生長因子促進細胞增殖分化。
[0010]目前，靜電紡絲技術在藥物微球控釋領域的發展剛剛起步，有關的文獻報道也僅限于可溶性藥物包裹于海藻酸、殼聚糖等水溶性囊材中，藥物包封率較低、粒徑分布寬、藥物體外達不到長期釋放的目的。(陸麗芳，魏剛，高建成，陸偉躍.高電壓靜電成囊技術制備牛血清白蛋白微囊的探索[J].中國醫藥工業雜志，2004，35 (6):341-344 ;Zhou X.F，Liu
B,Yu X.H, et al.Controlled release of PEI/DNA complexes from mannose-bearingchitosan microspheres as a potent delivery system to enhance immune responseto HBV DNA vaccine[J].J Controlled Release, 2007, 121 (3):200-207 ；Ma L, Liu
C.Preparationof chitosan microspheres by ionotropic gelation under a highvoltage electrostatic field for protein delivery.Colloids Surf B Biointerfaces? 2010，75(2):448-53)。
[0011]專利 申請人:課題組在前期研究中發現通過控制靜電紡絲技術中關鍵參數的指標，可制備粒徑分布窄，包封率高的PLGA長效蛋白微球。并且由于靜電紡絲工藝在微球制備過程中在無水、低溫條件下作業，也沒有添加表面活性劑和乳化劑，有望極大促進蛋白類藥物在制備過程中的活性保持。
[0012]但單純依靠靜電紡絲技術還是只能提高微球制備過程中的蛋白穩定性，不能改善藥物釋放過程中PLGA降解產物導致的蛋白質周圍微環境的低pH值，長期儲存、釋放過程的蛋白的活性仍然不能得到足夠保持。這就需要對靜電紡絲技術制備的蛋白微球作進一步的工藝和處方改進。目前國內、外也有向聚乳酸類生物降解微球中加上Mg(OH)2等堿性顆粒的研究。有研究發現在聚乳酸類生物降解微球中加上Mg(OH)2等堿性顆粒.模型藥物BSA的聚集情況得到改善,蛋白失活情況得到了改善(Zhu G et al, PharmRes.2000Mar;17(3):351-357 ；Kang J et al, Biomaterials.2002Tan;23(I):239-45)。但在常規向PLGA生物降解微球中加入Mg (OH) 2顆粒的制備方法中Mg (OH) 2不能全程中和PLGA的降解產物乳酸，只能在微球釋放前期起到維持蛋白類藥物穩定的作用，在微球釋放的中后期，蛋白類藥物還是會由于處在低PH值的環境中而易于降解、失活。并且由于不同型號的聚乳酸類生物材料具有不同的降解速度，常規加入Mg(OH)2顆粒的方法，不能同步中和不同型號的聚乳酸類生物材料的降解所產生的低PH微觀環境。這樣常規向PLGA生物降解微球中加入Mg (OH) 2顆粒的制備方法還是難于保持蛋白、多肽類藥物在儲存和釋放過程中的穩定性。
[0013]生物活性玻璃(Bioglass)是20世紀60年代由Larry Hench教授發明的基于Na2O-CaO-SiO2為主體的透明生物活性材料，在其植入體內后，接觸體液后，可以在材料界面誘發特殊的生理響應，緩慢形成具有堿性基團的碳酸羥基磷灰石(速率受Na2O-CaO-SiO2比例影響)，可引起組織間特殊生物反應從而導致移植材料與骨組織之間的成骨，能夠幫助骨組織以更快的速度再生和修復。經過20多年的前期基礎及性能的完善，在90年代經美國食品及藥品監督管理局(FDA)正式批準應用于骨、齒科臨床，用于修復因各種原因導致的骨缺損，并取得良好的治療效果。目前國內、外生物活性玻璃作為一種重要的醫學材料已經廣泛應用于生物醫學等領域。但目前尚未有將生物活性玻璃應用于蛋白類緩釋注射微球制備的研究。本專利申請中原創性的在采用靜電紡絲技術進行蛋白微球制備過程中，復合納米生物活性玻璃，通過調整生物活性玻璃的Na2O-CaO-SiO2-P2O5的比例，以期達到與PLGA近似于同步的降解速率，通過堿性碳酸羥基 磷灰石的緩慢形成來中和PLGA緩慢降解過程中產生的低PH，從而同步提高蛋白類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩定性。
【發明內容】
[0014]本發明為了提高蛋白、多肽類藥物在制備、儲存和釋放過程中的穩定性采用的技術方案是:采用靜電紡絲技術制備蛋白多肽類聚乳酸類緩釋微球體系，通過優化關鍵性參數如電場電壓、靜電紡絲距離及推進速度制備粒徑分布窄、包封率高、活性高保持的長效多肽、蛋白藥物緩釋微球。并在靜電紡絲技術的基礎上，添加生物活性玻璃，通過調整生物活性玻璃的組成的比例，達到與聚乳酸類高分子近似于同步的降解速率，通過碳酸羥基磷灰石的緩慢形成來中和聚乳酸類高分子緩慢降解過程中產生的低PH，從而同步提高蛋白、多肽類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩定性。
[0015]本發明的緩釋微球主要包括主藥(蛋白或多肽類藥物)、生物活性玻璃、聚乳酸類生物醫學材料組成。其中按重量份計，蛋白或多肽類藥物5~30份，聚乳酸類生物降解材料30~90份，生物活性玻璃5~50份。
[0016]所述的蛋白、多肽類藥物，包括所述蛋白或多肽類藥物包括但不局限于以下藥物:醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、胰島素、骨膠原形成蛋白、血管生長因子、艾賽那肽、醋酸奧曲肽、降鈣素、重組人生長激素或重組人干擾素。
[0017]本發明所選用聚乳酸類生物醫學材料作為緩釋材料，包括聚乳酸(PLA)或者聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)。
[0018]生物活性玻璃的Si02:Ca0:P205摩爾比可在26:70:4~70:15:15之間；
[0019]本專利還提供制備上述蛋白、多肽類藥物緩釋微球的制劑的方法，包括如下步驟:
[0020]( I)生物活性玻璃的制備
[0021 ] I)取一定量的濃硝酸與乙醇混合均勻，得到溶液I ;
[0022]2)溶液I加入正硅酸乙酯，1000rmp預水解30min，得到溶液2 ；
[0023]3)向溶液2中再加入P2O5, 1000rmp攪拌30min，得到溶液3 ；[0024]4)向溶液3中加入四水硝酸鈣，1000rmp攪拌lh，充分溶解形成清澈溶膠。
[0025]5)將步驟4)中制備好的溶膠倒入燒杯，置60°C烘箱中72h，形成凝膠；
[0026]6)將步驟5)中得到的凝膠在130°C干燥72h ；
[0027]7)將步驟6)所得凝膠球磨、篩分，并將所得的干凝膠粉在700°C煅燒得到納米生物活性
[0028]玻璃；
[0029](2)蛋白、多肽緩釋微球的制備
[0030]I)將蛋白、多肽類藥物和納米生物活性玻璃混懸于含有PLGA或者PLA的有機溶液；
[0031]2)將步驟I)中混懸液通過靜電紡絲裝置制備不同粒徑(1~80 ii m)的液球；
[0032]3)將步驟2)中制備的液球滴入置有-196°C液氮容器中，將液球凍結固形成球，接收距離為IOcm,；
[0033]4)將步驟3)中容器至于-60攝氏度~-90°C低溫環境中，用醇類萃取劑將二氯甲烷帶走，使聚合物產生沉積，微球得以固化；
[0034]5)用去離子水清洗步驟4)中固化的微球，離心后凍干保存。
[0035]上述(2)的步驟1)中所采用的有機溶劑選自二氯甲烷，氯仿，丙酮，こ醇，六氟異丙醇，三氟乙醇中的ー種或幾種混合物。步驟2)中，混懸液通過靜電紡絲裝置制備不同粒徑的液球的エ藝條件為:滴速為0.5ml/h~10ml/h，電壓為3KV~30KV，針頭到接收板距離為5~30cm,相對濕度為15%~50%。
[0036]對本領域技術人員來說，在制備生物活性玻璃時，能根據原料的量來調節生物活性玻璃中SiO2:CaO = P2O5的比例。
[0037]本發明的優點是:1、靜電紡絲技術在無水、低溫條件下作業，不添加表面活性劑和乳化剤，與現有的微球制備方法如溶劑揮干法法相比，可以極大促進蛋白多肽類藥物在制備過程中的活性保持。2、在微球制備過程中使用優化比例的復合納米生物活性玻璃可以達到與聚乳酸類生物降解材料近似于同步的降解速率，中和聚乳酸類生物降解材料緩慢降解過程中產生的低PH，從而提高蛋白、多肽類藥物在微球儲存和釋放過程中的穩定性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0038]圖1是根據實施例1制備的胰島素緩釋微球的體外釋放曲線圖。
[0039]圖2是根據實施例1制備的胰島素緩釋微球的體外釋放過程中的活性保持測定圖。
[0040]圖3是根據實施例2制備的重組人干擾素緩釋微球的體外釋放過程中樣品的UVCD圖譜。
[0041]圖4是根據實施例2制備的重組人干擾素緩釋微球的體外釋放過程中樣品的FTIR圖譜。
[0042]圖5是根據實施例2制備的重組人干擾素緩釋微球的掃描電鏡圖譜。
【具體實施方式】
[0043]本發明通過以下實施實例作更詳細的描述，但不能將其解釋為限制本發明的保護范圍。
[0044]實施例一
[0045]I胰島素緩釋微球的制備
[0046]1.1生物活性玻璃的制備
[0047]取7ml濃硝酸，加入53g乙醇，所得溶液中加入10.84g正硅酸乙酯，1000rmp預水解30min,再加入P2O5L 14g, 1000rmp攪拌30min,加入33g四水硝酸鈣，1000rmp攪拌Ih,充分溶解形成清澈凝膠。將制備好的溶膠倒入燒杯，置60°C烘箱中72h，形成凝膠，然后在130°C干燥72h，將凝膠球磨、篩分，并將所得的干凝膠粉在70(TC煅燒2h，粉碎得納米生物活性玻璃微粉。
[0048]該步驟制備后生物活性玻璃的組成和成分比例為；SiO2: CaO = P2O5摩爾比=26:70:4
[0049]1.2緩釋微球的制備
[0050]精密稱取IOOmgPLGA (分子量5KD)溶于5ml 二氯甲烷中。精密稱取IOmg胰島素微粉與20mg納米級生物活性玻璃粉混懸于PLGA 二氯甲烷溶液中。采用靜電紡絲工藝進行微球制備:滴液速度10ml/h，電壓3kV，針頭到接收板距離10cm，相對濕度30%。將液球滴入置有_196°C液氮容器中，將液球凍結固形成球后于_60°C用醇類萃取劑將二氯甲烷帶走，使聚合物產生沉積，微球得以固化；去離子水清洗，離心后凍干得微球粉末。
[0051]2胰島素緩釋微球的質量評價
[0052]2.1包封率，含量，收率的計算與平均粒徑的考察
[0053]精密稱取含藥微球約10mg，加入5.0ml0.lmol/L NaOH(含有0.5% SDS)，37°C水浴振蕩24h，使微球完全溶解，鹽酸調節pH至中性，取上清液采用BCA Kit法進行蛋白含量測定，并計算載藥量和包封率。其中藥物含量為1.14%(w/w)。微球產率為90.2%(w/w)。微球體積平均粒徑為30 μ m。
[0054]2.2溶出度的測定與溶出過程中穩定性的考察
[0055]精密稱取含藥微球20mg置于5mll0mmol/L pH7.4緩沖液(含0.02%疊氮鈉作為抑菌劑，0.02% F-68潤濕劑)作為釋放介質，置于恒溫水浴搖床中，在IOOrpm振蕩速度、370C ±0.5°C溫度條件下進行微球的體外釋放度測定。用BCA Kit法測定上清液中蛋白的濃度，計算累計釋藥百分數。并同時取上清液作為供試品溶液，采用小鼠血糖法測定上清液中胰島素的活性。結果見附圖1~2。
[0056]實施例二
[0057]I重組人干擾素緩釋微球的制備
[0058]1.1生物活性玻璃的制備
[0059]取7ml濃硝酸，加入53g乙醇，所得溶液中加入29.17g正硅酸乙酯，1000rmp預水解 30min,再加入 P2054.26g, 1000rmp 攪拌 30min,加入 7.08g 四水硝酸鈣，1000rmp 攪拌 Ih,充分溶解形成清澈凝膠。將制 備好的溶膠倒入燒杯，置60°C烘箱中72h，形成凝膠，然后在130°C干燥72h，將凝膠球磨、篩分，并將所得的干凝膠粉在70(TC煅燒2h，粉碎得生物活性玻璃微粉。
[0060]該步驟制備后生物活性玻璃的組成和成分比例為Si02:Ca0:P205摩爾比=70:15:15[0061]1.2緩釋微球的制備
[0062]精密稱取150mgPLGA (分子量5KD)溶于6ml 二氯甲烷中。精密稱取8mg重組人干擾素微粉與15mg納米級生物活性玻璃粉混懸于PLGA 二氯甲烷溶液中。采用靜電紡絲エ藝進行微球制備:滴液速度0.5ml/h,電壓30KV，針頭到接收板距離5cm，相対濕度25%。將液球滴入置有-196°C液氮容器中，將液球凍結固形成球后于-80°C用醇類萃取劑將二氯甲烷帶走，使聚合物產生沉積，微球得以固化；去離子水清洗，離心后凍干得微球粉末。
[0063]2重組人干擾素緩釋微球的質量評價
[0064]2.1微球的粒徑分布:采用激光光散射儀(CoulterL S_230Particle SizeAnalyzer, Miami, USA)測定微球平均粒徑及粒徑分布。
[0065]2.2微球表面形態學觀察:微球的表面形態使用掃描電子顯微鏡進行觀察。
[0066]2.3微球的載藥量和包封率的測定精密稱取含藥微球約10mg，加入5.0ml0.1mol/LNaOH(含有0.5%(w/v) SDS)，37°C水浴振蕩24h，使微球完全溶解，鹽酸調節pH至中性，取上清液采用BCA Kit法進行蛋白含量測定，并計算載藥量和包封率。
[0067]2.4微球的體外藥物釋放:精密稱取含藥微球20mg置于5mll0mmol/L pH7.4緩沖液(含0.02%疊氮鈉作為抑菌劑，0.02 % F-68潤濕劑)作為釋放介質，置于恒溫水浴搖床中，在IOOrpm振蕩速度、37°C ±0.5°C溫度條件下進行微球的體外釋放度測定。用BCA Kit法測定上清液中重組人干擾素的濃度，計算累計釋藥百分數。采用FTIR和UVCD考重組人干擾素的2級與3級空間立體結構的保持。結果見附圖3~4。
[0068]如上所述，本發明的包含蛋白、多肽類藥物的的無機、有機物復合緩釋微球可以實現蛋白、多肽類藥物在儲存與釋放過程中的活性保持。
[0069]雖然已經根據上述特定的實施方案敘述了本發明，但應該承認，本領域技術人員可能對本發明做出各種修飾和轉變，而這些修飾和轉變同樣屬于所附權利要求書所定義的本發明的范圍內。
【權利要求】
1.一種可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球的制備方法，包括以下步驟: (1)納米生物活性玻璃制備: 1)取一定量的濃硝酸與乙醇混合均勻，得到溶液I; 2)溶液I加入正硅酸乙酯，1000rmp預水解30min，得到溶液2； 3)向溶液2中再加入P2O5,1000rmp攪拌30min，得到溶液3 ； 4)向溶液3中加入四水硝酸鈣，1000rmp攪拌lh，充分溶解形成清澈溶膠； 5)將步驟4中制備好的溶膠倒入燒杯，置60°C烘箱中72h，形成凝膠； 6)將步驟5中得到的凝膠在130°C干燥72h； 7)將步驟6所得凝膠球磨、篩分，并將所得的干凝膠粉在700°C煅燒得到納米生物活性玻璃； (2)蛋白、多肽緩釋微球的制備 1)將蛋白、多肽類藥物和納米生物活性玻璃混懸于含有PLGA或者PLA的有機溶劑； 2)將步驟I)中混懸液通過靜電紡絲裝置制備不同粒徑的液球； 3)將步驟2)中制備的液球滴入置有_196°C液氮容器中，將液球凍結固形成球； 4)將步驟3)中容器至于-60°C'9(TC低溫環境中，用醇類萃取劑將有機溶劑帶走，使聚合物產生沉積，微球得以固化； 5)用去離子水清洗步驟4)中固化的微球，離心后凍干保存。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:在所述(2)的步驟I)中所采用的有機溶劑選自二氯甲烷，氯仿，丙酮，乙醇，六氟異丙醇，三氟乙醇中的一種或幾種混合物。
3.根據權利要求1中所述制備方法，其特征在于:在所述(2)的步驟2)中，混懸液通過靜電紡絲裝置制備不同粒徑的液球的工藝條件為:滴速為0.5 ml/tTlO ml/h，電壓為3kV^30 kV，針頭到接收板距離為5~30cm，相對濕度為15%~50%。
4.一種可保持蛋白、多肽類藥物活性的緩釋聚乳酸類微球，其特征在于，按重量份計，包括蛋白或多肽類藥物5~30份，聚乳酸類生物降解材料30~90份，納米生物活性玻璃5~50份。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白或多肽類藥物是醋酸亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、胰島素、骨膠原形成蛋白、血管生長因子、艾賽那肽、醋酸奧曲肽、降鈣素、重組人生長激素或重組人干擾素。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述生物活性玻璃的組成成分組成比例:SiO2, CaO 和 P205 ;Si02: CaO: P205 摩爾比在 26:70:4 ~70:15:15。
【文檔編號】A61K38/28GK103585635SQ201310529364
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優先權日:2013年10月31日
【發明者】劉宏飛, 曹進, 師雙雙, 奚菊美 申請人:江蘇大學