專利名稱：包含止痛肽的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及止痛肽及其衍生物。
背景技術：
雖然疼痛是至關重要的生理學反應，它也產生了不必要的痛苦和苦惱。對疼痛的控制和緩解是醫學的重要分支。疼痛可以是疾病的結果，也可能是醫學治療如化學治療的結果。在各種情況中，重要的是盡可能地減輕疼痛以使患者功能正常。涉及疼痛的兩條神經途徑同時在身體中起作用(1)感覺途徑，其感覺組織損傷， 隨后產生疼痛的感覺；( 止痛途徑，其減輕疼痛的感覺，并阻止疼痛的信息流向中樞神經系統(CNQ，從而使有機體盡管受到損傷仍能維持其正常活動。利用抑制作為疼痛感受器的外周神經的藥物或通過加強天然止痛系統可以實現止痛。由于這些是不同的途徑，因而它們受不同物質的影響。例如，阿司匹林和利多卡因對外周感覺途徑有活性，而嗎啡和相關的物質對止痛系統有作用。目前使用的大多數有效的止痛藥是來源于阿片劑的嗎啡相關物質，已知大腦產生多種內源性阿片劑，這解釋了這些物質的強大效果。它們對神經元的作用是通過專門的受體介導的。這些受體調節的信號阻止信息從外周疼痛神經元流向CNS。這些CNS神經元也對多種其它化學物質包括兒茶酚胺(5-羥色胺，去甲腎上腺素等等)、神經活性肽(神經降壓肽)和抑制性氨基酸(甘氨酸和GABA)敏感。授予Di Stazio的U. S. 4，619，916公開了通式pGLU-X-TRP的13種新的三肽，其中pGLU是環化的谷氨酸(焦谷氨酸)而X可以是GLY，VAL, GLU，ASP，SER, ALA, ASN，GLN， ILE, LEU, PRO, LYS和ARG。同時公開了它們的制備方法，用于口服和腸胃外給藥的含有它們的藥物制劑，和它們作為降壓藥和止痛劑的用途。進一步公開了色氨酸殘基的低級烷基酯，特別是甲酯或乙酯，用作所述肽生產中的保護基團。在合成過程完成時，這些保護基團被除去。沒有公開局部制劑。WO 92/192M公開了 α _取代的單，二，三，四和五肽，可用于治療肥胖，焦急，胃腸潰瘍，疼痛，中風和炎癥。未公開式pGLU-X-TRP的肽。下面的通式pGLU-X-TRP-Z的四肽出現在文獻中X = L-Ala ；Z = L-LeuOH, L-LeuOCH3, L-LeuNH2, L-MetOH, L-MetOCH3,或者 L-MetNH2 (DE 3，340，208)；X = Lys ；Z = L-AlaOH 或者 L-ProOH(Freer，R. J.和 Stewart，J. Μ. (1971)Cienc. Cult. 23(4) :539-42 ；Francis, B.和 Kaiser，I.I. (1993)Toxicon 31(7) :889-899)；X = L-Pro ；Z = L-ValNH2, L-MetOH，L-MetOCH3, L-MetNH2, L-Met 亞砜 0H，L-Met 亞砜 OCH3, L-Met 亞砜 NH2 (DE3, 340，208)。
發明內容
本發明的目的是提供可以局部給藥的止痛藥物組合物。本發明的另一個目的是提供新的肽衍生物。在第一方面，本發明提供了用于局部給藥的藥物組合物，其包含止痛有效量的通式⑴的含有L-氨基酸的肽pGLU-X-Y-Z (I)其中X 是選自 GLY，VAL, GLU，ASP，SER, ALA, ASN, GLN, ILE, LEU、PRO，LYS 和 ARG 的
氨基酸，Y 是 TRP 或 THR，而Z是任何L-氨基酸或Z不存在，其中當Z是任何L-氨基酸時，Y和Z之一是TRP但兩者不都是TRP，而當Z不存在時，Y = TRP,或者止痛有效量的肽衍生物，其中烷基附著于所述肽的氨基酸上，和可藥用賦形劑。現在已經發現，某些肽可以用作局部止痛組合物中的活性成分。本發明組合物的活性成分是通式⑴的肽。本發明的肽的例子是三肽和四肽，其中pGLU是朋2末端的氨基酸，TRP是在第三(Y)或者第四(Z)氨基酸位置，優選的肽的例子是 pGLU-ASN-TRP-OH(pENW)， pGLU-GLU-TRP-OH(pEEff), pGLU-ASN-TRP-THR-OH(pENWT)， pGLU-ASN-THR-TRP-OH(pENTff)和 pGLU-ASN-TRP-LYS-OH(pENWK)。本發明的肽衍生物中烷基鏈附著于肽上。這可能是通過將脂肪酸附著于胺基團來進行的，例如附著于賴氨酸或精氨酸殘基的ε -胺基團，從而得到肽的烷基酰胺，或附著于羥基基團，從而得到肽的烷基酯。烷基鏈可以附著于肽中能夠與烷基鏈反應的任何氨基酸，正如本領域技術人員熟知的。烷基鏈可以是任意長度，但優選中至長鏈，例如4，5，6，7， 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 個碳。肽衍生物的例子是 pGLU-ASN-TRP-LYS (辛酰基)_0H (pENWK_C8)和 pGlu-Asn-Trp-0-辛基 (pENW-C8)。“止痛有效量”是活性成分能夠產生所需要的藥學效果的量，即能夠減輕或預防疼痛的量。這一量取決于多個參數如活性成分和載體的確切組合物，給藥的位置，疼痛的來源等等。該量可以容易地由本領域的一般技術人員通過進行有限量的劑量應答實驗來確定， 例如將一系列濃度的給定配方施用于身體的特定位置。已經發現有效的濃度的例子包括但不限于 0. 0015-0. 02mg/g 載體。本發明的藥物組合物是配制成用于局部給藥的。這樣的組合物還將包含一種或多種可藥用載體或賦形劑，如羊毛脂和凡士林的混合物，用于以油膏、乳霜或藥膏形式局部使用。供局部使用的其它載體是本領域技術人員已知的，并且包括在本發明的范圍內。芳香劑，穩定劑，色料，增稠劑和其它常規物質也可以包括在組合物中。本發明還提供止痛有效量的通式⑴的含有L-氨基酸的肽的用途pGLU-X-Y-Z (I)其中X 是選自 GLY，VAL, GLU, ASP，SER, ALA, ASN, GLN, ILE, LEU, PRO, LYS 和 ARG 的氨基酸，Y 是 TRP 或 THR，而Z是任何L-氨基酸或Z不存在，其中當Z是任何L-氨基酸時，Y和Z之一是TRP但兩者不都是TRP，而當Z不存在時，Y = TRP,或者，提供止痛有效量的肽衍生物的用途，其中烷基附著于所述肽的氨基酸，用于制備治療或預防疼痛的局部使用的藥物組合物。本發明的另一方面是治療或預防哺乳動物疼痛的方法，包括對哺乳動物局部施用止痛有效量的通式(I)的包含L-氨基酸的肽pGLU-X-Y-Z (I)其中X 是選自 GLY，VAL, GLU, ASP，SER, ALA, ASN, GLN, ILE, LEU, PRO, LYS 和 ARG 的
氨基酸，Y 是 TRP 或 THR，而Z是任何L-氨基酸，或Z不存在，其中當Z是任何L-氨基酸時，Y和Z之一是TRP但兩者不都是TRP，而當Z不存在時，Y = TRP,或者局部施用止痛有效量的肽衍生物，其中烷基附著于所述肽的氨基酸上。該肽的局部給藥可以采用局部給藥的常規方式。由于本發明的組合物有時是在一個延遲期后發生作用的，可以預期，它對于慢性疼痛將特別有效，盡管它可以用于治療任何類型的疼痛。在另一個方面，提供了通式(I)的包含L-氨基酸的肽pGLU-X-Y-Z (I)其中X 是選自 GLY，VAL, GLU, ASP，SER, ALA, ASN, GLN, ILE, LEU, PRO, LYS 和 ARG 的
氨基酸，Y 是 TRP 或者 THR，而Z是任何L-氨基酸，或者Z不存在，其中當Z是任何L-氨基酸時，Y和Z之一是TRP但兩者不都是TRP，而當Z不存在時，Y = TRP,或者提供了該肽的衍生物，其中烷基附著于氨基酸上，其中烷基的長度是C4或更長。附帶條件是，當Z是任何L-氨基酸時，如果X = ALA, Z不是LEU或MET，如果X = LYS, Z 不是 ALA 或 PRO，如果 X = PRO, Z 不是 VAL 或 MET，其它附帶條件是當Z不存在時，所述肽具有附著于其氨基酸的烷基。這些肽在文獻中是未知的。本發明的這一方面的其它實施方案是治療或預防疼痛的藥物組合物，其包含止痛有效量的本發明的肽或其烷基酯或酰胺。該藥物組合物可以口服，腸胃外或局部給藥。
具體實施例方式方法和材料
肽和衍生物的制備1. pGlu-Asn-Trp-Lys (辛酰基)-OH 的合成在本發明的一個實施方案中，肽的合成是通過在Fm0c-Lys(Mtt)-Wang樹脂(在Ig 預載樹脂上裝填0. 25毫摩爾)上的分步9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成(SPPQ方法手工進行的。在第一步，用在DCM中的TFA處理而選擇性地除去Mtt (4-甲基三苯甲基)保護基團。通過在存在N-羥基苯并三唑(HOBt)時施加2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲鋪六氟磷酸(HBTU)試劑的常規偶聯方法將辛酸附著于游離氨基上(通過酰胺鍵)。 同樣的偶聯方法也用于其它氨基酸的附著。通過Kaiser實驗檢測偶聯步驟的完成(用乙醇洗滌取自反應中的少量樹脂小珠，轉移到小玻璃管中；加入2滴以下的溶液乙醇中的5% 茚三酮，乙醇中的80%苯酚，吡啶中的0. 00002M氰化鉀；將樣品混合，加熱到120°C 4-6分鐘。藍色樹脂小珠指示實驗陽性)。然后，用20%哌啶除去Fmoc基團，在洗滌樹脂后，引入第二個氨基酸(Fm0c-Trp(B0c))再開始另一個偶聯步驟。每次都根據肽序列加入另一個氨基酸重復這些步驟。所用的氨基酸是Fmoc-Na保護的。三官能氨基酸如下作側鏈保護=Trp(Boc)，Asn(Trt)。在原位用HBTU/HOBt活化各 Fmoc氨基，隨后與樹脂偶聯50分鐘。在偶聯過程中將二異丙基乙胺(DIEA)用作有機堿。 然后用在N-甲基吡咯烷酮(NMP)中的20%哌啶處理20分鐘除去α胺上的Fmoc保護基團。三當量的活化氨基酸用于偶聯反應中。加入每個隨后的氨基酸時重復去保護和偶聯步驟，直到完成肽的合成。先用NMP接著用DCM洗滌肽-樹脂，并且真空干燥。在室溫下，用95%的TFA，5%的三異丙基硅烷(TIS)溶液處理2小時而從樹脂上將如上所述制備的這一肽裂解下來。產物通過加入10體積的醚來沉淀，過濾，在真空中干燥。通常，從1克肽-樹脂可獲得150毫克肽。通過LC/MS鑒定(M+1 = 684. 7)。純化在制備型RP-HPLC 柱(Cw 5 μ mPhenomenex Luna 柱，IOmm I. D. x25cm)上純化粗制肽。在下面的條件下進行層析:A = H20/TFA 0. 05%;B = ACN/TFA 0. 05%； γ = 214nm ； 流速=5ml/min。在柱上裝填50mg肽。在45分鐘利用15%到50% B的梯度。收集主峰的級分，通過分析型HPLC來表征。將最好的級分合并到一起，凍干得到所需要的產物，其純度 > 95%。2. pGlu-Asn-Trp-Ο-辛基的制備這一肽的制備也可以通過包括以下步驟的溶液合成方案來進行a.制備 Boc-iTrp-O-辛基(Boc-Trp 的辛酯)在O °C，向DCMGOml)中引入Boc-Trp (6. 1毫摩爾)，辛醇(6. 8毫摩爾)， DMAP (0. 74g，6. 1毫摩爾)和二環己基碳二亞胺(DCC) (1. 4g，(6. 8毫摩爾)。攪拌混合物， 除去冷卻浴，從而使溫度慢慢上升到室溫。將反應物攪拌過夜，然后過濾以除去二環己基脲 (DCU)。用DCM洗滌固體，將合并的母液用HCl (0. 1N)調節到pH = 4_5。用水(3 X 30ml)洗滌有機相，經MgSO4干燥，過濾和蒸發得到粗產物。b.除去Boc基團在室溫下將Boc-1Trp-O-辛基溶于醚中。加入在二喊烷中的HCl (4N) (4 1摩爾過量)，并且將反應混合物攪拌大約1小時。去保護的產物作為HCl鹽沉淀。過濾，用醚洗滌并干燥。c. DCC/HOBt 偶聯過程將DCM(35ml)中的Boc保護的氨基酸(14. 2毫摩爾)冷卻到0°C。向反應混合物中加入HOBt ·Η20(12. 9毫摩爾，1.75g)和DCC (15. 5mole，3. 2g)，劇烈攪拌1小時。將溶于 DCM(20ml)中的去保護的肽(在除去Boc基團之后)和TEA(18. 1毫摩爾)引入反應，在0°C 將混合物再攪拌30分鐘。除去冷卻浴，將反應混合物置于室溫過夜。在減壓下將產物混合物蒸發至干，加入KOAc (150ml)。通過過濾除去不溶的顆粒 (DCU)，用鹽水(2 X 35ml), NaHCO3 (5% ；2 X 35ml)和水(2 X 35ml)洗滌母液。用 MgSO4 干燥有機相，在減壓下蒸發。在肽合成結束時(最后階段是pGlu的偶聯)，得到粗產物肽。通過LC/MS鑒定，并類似于第一個肽(pGlU-ASU-Trp-LyS(辛酰基)-0H)進行純化。3.從蛇毒純化本發明的部分肽也可以從蛇毒分離，包括從蝰科，眼鏡蛇科和響尾蛇科的蛇得到的毒液。例如，可以從黑唇眼鏡蛇(Naja melanoleuca)毒液，在Mono Q柱上利用20mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7· 0)來純化pENW。將在12-18分鐘從Mono Q柱(峰在14. 3分鐘)洗脫的級分如下通過HPLC進一步純化將該級分裝到HPLC Spherisorb 5柱(5μ ,250X4. 6mm, ffi Sep. S/N 142110)上，利用20mM NH4Ac (pH 5.5)和AcN的梯度來洗脫。在或選的純化方法中，可以在Mono Q柱上利用20mM的乙酸銨緩沖液(pH6. 9)來純化毒液。峰在17分鐘的級分進一步通過HPLC純化，如上所述。NMR，HPLC和LC/MS分析揭示合成的肽和天然的肽一致。同樣，從東部菱斑響尾蛇(Crotalus adamanteus)毒液中，已經純化了 pENW， pEEW，和pENTW或pENWT，pENW已經從山蝰巴勒斯坦亞種(V. palestinae)毒液中純化。實驗1.止痛實驗在各測試中，利用了幾十只相似體重和年齡的倉鼠。根據待測試的樣品數目將倉鼠分成幾組。將含有測試物質的油膏(50%的羊毛脂和50%的凡士林)涂到動物背部皮毛上。沒有除去皮毛，以保證對皮膚不造成損傷。用不含本發明組分的油膏處理對照組的倉鼠。連續局部涂敷6，14，21或觀天來處理倉鼠。在最后一次涂敷油膏之后，進行止痛性實驗。在或選的方案中，在單次涂敷油膏后測試止痛性。在涂敷油膏后，倉鼠通過用舌頭和腿將油膏分散到遍布整個身體來“清潔”自身。 所以，在口腔中也引入了一些油膏，并可能還進入了倉鼠的腸道。在一個典型的測試中，將恒定量的含或不含止痛物質的油膏應用于每只動物，持續一天或多天的預定時間。在這一時期后，通過在大腿區皮下注射0.5ml的IN HC1/0. Ikg 體重來誘發疼痛。倉鼠對注射HCl的反應是用舌頭碰注射的區域，這稱為“舔”。在注射后 20分鐘，觀察倉鼠60分鐘，記數“舔”的次數。“舔”的次數作為HCl誘導的疼痛的定量指標。將對照動物中“舔”的平均次數與處理動物中的次數相比較來確定止痛效果。利用t_檢驗統計確定差異的顯著性。實施例1
將0. 6mg 的 pENW，pENWK_C8 或 pENWGAT (pENW 的二聚體)溶于 5ml DDff 中，通過超聲混合器混合2分鐘，然后溶于315gr的油膏中。最終的肽濃度是0. OOaiig/gr。在4星期內，進行6次涂敷。在最后一次涂敷油膏后10天進行止痛性測試。結果
概括在下面的表中
權利要求
1.一種局部給藥藥物組合物，其包含止痛有效量的通式(I)的含有L-氨基酸的肽 pGLU-ASN-TRP-Z (I)其中Z是選自Lys和Thr的L-氨基酸，或者不存在；或止痛有效量的肽衍生物，其中C8烷基附著于所述肽的氨基酸上，和適于局部給藥的賦形劑。
2.權利要求1所述的藥物組合物，其中所述烷基是通過酰胺鍵附著的。
3.權利要求1所述的藥物組合物，其中所述烷基是通過酯鍵附著的。
4.權利要求1所述的藥物組合物，其中所述肽是pGLU-ASN-TRP、pGLU-ASN-TRP-THR、或 PGLU-ASN-TRP-LYS-C8。
5.止痛有效量的通式(I)的包含L-氨基酸的肽的用途 pGLU-ASN-TRP-Z (I)其中Z是選自Lys和Thr的L-氨基酸，或者不存在；或者止痛有效量的肽衍生物的用途，其中C8烷基附著于所述肽的氨基酸上，用于制備治療或預防疼痛的局部給藥的藥物組合物。
6.權利要求5所述的用途，其中所述烷基通過酰胺鍵附著。
7.權利要求5所述的用途，其中所述烷基是通過酯鍵附著的。
8.權利要求5所述的用途，其中所述肽是pGLU-ASN-TRP、pGLU-ASN-TRP-THR、或 PGLU-ASN-TRP-LYS-C8。
9.一種肽，其中所述肽是 pGLU-ASN-TRP-THR、或 pGLU_ASN-TRP-LYS_C8。
全文摘要
用于局部給藥的藥物組合物，其包含止痛有效量的通式(I)的包含L-氨基酸的肽pGLU-X-Y-ZM(I)和可藥用賦形劑。X是選自GLY，VAL，GLU，ASP，SER，ALA，ASN，GLN，ILE，LIU，PRO，LYS和ARG的氨基酸，Y是TRP或THR，而Z是任何L-氨基酸，或Z不存在。當Z是任何L-氨基酸時，Y和Z之一是TRP但兩者不都是TRP，而當Z不存在時，Y是TRP。烷基可以附著于所述肽的氨基酸上。同時公開了所述肽，藥物組合物的制備和治療或預防哺乳動物疼痛的局部應用方法。
文檔編號C07K5/097GK102160890SQ20111005202
公開日2011年8月24日 申請日期2001年8月6日 優先權日2000年8月10日
發明者A·舒洛弗, N·普里默 申請人:S·I·S·舒洛弗科學研究有限公司