一種表達ibdv vp2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種表達IBDV?VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒，屬于基因工程和生物制品研究領域。將10拷貝法氏囊素三肽（BS10）嵌合IBDV?VP2基因表達盒與火雞皰疹病毒（HVT）結合在一起，獲得了一種全新的重組火雞皰疹病毒（rHVT-BS10-VP2），該病毒同時也是一種馬立克氏病和雞傳染性法氏囊病的二聯重組疫苗。本發明的二聯重組疫苗，不僅可以對雞MD起到良好的免疫保護作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平的商品化雞群中可以誘導抗IBDV的持久保護性免疫，與現有的雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT-013-69株)相比，rHVT-BS10-VP2免疫組的保護率（100％)高于rHVT-VP2免疫組的保護率(93.3％)。
【專利說明】—種表達IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白重組火雞皰疹病毒
[0001]一、【技術領域】
本發明屬于基因工程和生物制品研究領域。具體涉及一種表達IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒。[0002]二、【背景技術】
雞馬立克氏病(Marek，s disease, MD)和雞傳染性法氏囊病(Infectious bursaldisease, IBD)是兩種影響家禽生產最常見的免疫抑制性疾病。其中IBD是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起，主要危害3周齡~12周齡青年雞的急性、高度接觸性傳染病。變異株和超強毒株(vvIBDV)的出現使該病的防控難度加大，IBD免疫預防失敗已成為禽病防控中的重要問題。
[0003]目前商品化的傳染性法氏囊病活毒疫苗分為弱毒、中毒和強毒三類。弱毒活疫苗對SPF雞安全，但對有母源抗體雞群的免疫保護力很差。中等毒力和強毒疫苗的免疫
保護
力雖然要高很多，但由于具有一定的致病力而損傷法氏囊。同時，由于母源抗體的干擾以及IBDV的特點，在實際應用中傳統疫苗可形成不可避免的免疫空白期。因此，在當前IBD防控實際工作中，急需免疫效力強、生物安全性高新型IBD疫苗。
[0004]MD是由馬立克氏病病毒(Marek，s disease virus,MDV)引起的雞淋巴組織增生性疾病，以外周神經、虹膜、皮膚、肌肉和內臟器官的淋巴樣細胞浸潤，增生和腫瘤形成為特征。MDV疫苗株可作為活病毒載體來表達外源基因，對其分子生物學的研究表明，MDV基因組較大，并已經確定了多處病毒復制非必需區，其本身是優良的病毒表達載體。相較于其它病毒載體，MDV作為載體具有獨特的優勢，MDV為嚴格的細胞結合型，可以突破母源抗體的干擾，適合早期免疫，通過雞胚免疫，操作更方便。并且，一次免疫可誘發終生的細胞和體液免疫應答，節約成本。基于以上特點，以MDV為載體進行的活疫苗研究倍受青睞，而火雞皰疹病毒(HVT)為其中的一種α皰疹病毒，因其與MDV抗原相關性，同時又由于HVT與MDV有明顯區別對雞無致病性，被廣泛用作預防馬立克氏病(MD)的活疫苗。
[0005]法氏囊(BF)是禽類特有的免疫器官，為B細胞發育、成熟提供微環境，是免疫球蛋白基因轉變場所；其免疫活性物質為三肽囊素(Bursin，BS)，它能誘導家禽和哺乳動物B細胞前體分化；其靶器官是BF，能夠拮抗IBD疫苗對BF的損傷，提高ND弱毒疫苗及油苗產生抗體水平。因此如何能夠以火雞皰疹病毒(HVT)為載體進行雞傳染性法氏囊病(IBD)的高效活疫苗研究成為一項亟待攻克的難題。
[0006]三、
【發明內容】
技術問題
本發明的發明人提供了一種重組火雞皰疹病毒(rHVT-BS10-VP2)，不僅可以對雞MD起到良好的免疫保護作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平商品化雞群中可以誘導抗IBDV的持久保護性免疫。
[0007]技術方案一種表達IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT- BS10-VP2，其特征在于:其攜帶在啟動子序列控制下的10拷貝法氏囊素三肽(BSlO)嵌合IBDV VP2基因表達盒的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
[0008]所述的表達IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其制備方法如下:
1)10拷貝法氏囊素三肽BSlO寡核苷酸的合成:選用編碼賴氨酸Lys、組氨酸His和甘氨酸Gly的常用密碼子按順序排列成BS基因:5’-AAGCATGGC-3’，連續合成10個BS，BS串連基因單鏈及其反向互補鏈，通過退火使其復性成雙鏈；
2)含IBDVVP2和BSlO嵌合基因表達盒的火雞皰疹病毒HVT轉移載體的構建:根據已注冊的GenBank N0.X00221.1的gpt基因序列設計引物，以E.colim, a DNA為模板采用PCR方法擴增gpt基因，用其作為外源篩選基因，與質粒pEGFP中的CMV啟動子及poly (A)連接構建gpt表達盒CMV-gpt-poly A,經酶切測序驗證后，插入到含有火雞皰疹病毒HVT非必需區US10、S0RF3兩側基因的同源臂克隆質粒pUAB中，構建帶有篩選基因表達盒的克隆質粒pUAB-gpt ;將BS10-VP2嵌合基因插入到pUAB-gpt中，獲得重組火雞皰疹病毒轉移載體 pUAB-gpt-BS10-VP2，大小為 IOlOObp ；
3)表達嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒的制備:采用脂質體介導法，將重組轉移載體質粒pUAB-gp t-BS 10-VP2與HVT-FC126株基因共轉染原代雞胚成纖維細胞CEF，待出現病毒噬斑后，利用霉酚酸MPA阻斷核酸代謝途徑，經過篩選獲得純化的重組病毒rHVT-BS10-VP2。
[0009]所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10_VP2，其在禽類宿主中誘導抗禽類皰疹病毒和雞傳染性法氏囊病毒的保護性免疫的應用，其也可作為疫苗株應用。
[0010]有益效果
1)將10拷貝法氏囊素三肽(BSlO)嵌合IBDV VP2基因表達盒插入HVT基因組中的位置位于HVT FC126基因組(ACCESSION N0.NC_002641)的非必需區USlO基因和S0RF3基因之間，更具體的位置為HVT FC126基因組(ACCESSION N0.NC_002641)的138687bp-138826bp位置之間，獲得了一種免疫增強型重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，該病毒同時也是一種馬立克氏病和雞傳染性法氏囊病的二聯疫苗，rHVT-BS10-VP2不僅可以對雞MD起到良好的免疫保護作用，而且在具有高IBDV母源抗體水平商品化雞群中可以誘導抗IBDV的持久保護性免疫，與現有的雞傳染性法氏囊病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗(vHVT-013- 69株)相比，rHVT-BS10-VP2免疫組的保護率((100% )高于rHVT_VP2免疫組的保護率(93.3% )。
[0011]2)以gpt為篩選基因構建的rHVT-BS10-VP2重組病毒能夠表達gpt，該酶利用外源黃嘌呤完成了鳥嘌呤的外源補救合成，從而使得重組病毒DNA的復制能夠正常進行，可經過幾輪篩選野生病毒全部死亡，而重組病毒逐漸可得到富集和純化。
[0012]
四、【專利附圖】
【附圖說明】
圖1為rHVT-BS10-VP2重組病毒的DNA序列模式圖；
圖2 HVT基因組插入BS10-VP2示意圖；
圖3篩選標記基因gpt的表達盒Egpt (CMV-gpt-poly A)擴增結果電泳示意圖；圖4為BS10-VP2 PCR擴增結果電泳示意圖；
圖5為重組質粒pUAB-gpt-BS10-VP2構建過程示意圖。
[0013]五、【具體實施方式】
IBDV變異株AHl株(見參考文獻:王永山等.近期引起免疫失敗的傳染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中國獸醫科學，2008，38(12): 1013_1019)VP2基因系用RT-PCR方法從2007年12月在安徽引起免疫失敗的IBDV變異株(AHl)中克隆，該變異株具有IBDV強毒株全部的標志性氨基酸殘基，VP2基因七肽基序為SWSASGS，在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別是A、Q、1、D、A、I和S，與現行商品疫苗毒株B87的VP2基因序列有較大差異。因此，對當前IBDV的防控更具有針對性和實際意義。
[0014]實驗材料
1.1載體、菌種及主要試劑 pMD18-T simple vector購自寶生物工程(大連)有限公司；含有綠色熒光蛋白基因的表達質粒PEGFP-Nl (劉蒙蒙，楊德成，周國輝等，共表達O型FM DV衣殼蛋白和綠色熒光蛋白重組腺病毒的構建，2012 (24) 83-86) ； E.coli DH5 α和Ε.coli DHlOB (購自寶生物工程(大連)有限公司)。AxyPr印質粒小量純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen，X_gal、IPTG、限制性核酸內切酶、T4 DNA Ligase, ATP、dNTP及Taq DNA聚合酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM培養基購自Invitrogen公司；胰酶購自Thermo公司。
1.2SPF雞胚和病毒9~10日齡SPF雞胚、火雞抱疫病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)Fcl26株均購自南京天邦生物科技有限公司;傳染性法氏囊病毒BC6/85的標準毒株購自中國獸藥監察所；
2實驗方法
2.1引物設計與合成
根據GenBank上發表的HVT Fcl26株全長基因組序列(AF291866)、gpt序列(X00221.1)以及pEGFP-Cl質粒序列設計了以下PCR引物(表1)，引物由Invitrogen公司合成。
[0015]表1重組病毒轉移載體的引物構建
【權利要求】
1.一種表達IBDV VP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其特征在于:其攜帶在啟動子序列控制下的10拷貝法氏囊素三肽BSlO嵌合IBDVVP2基因表達盒的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
2.根據權利要求1所述的表達IBDVVP2和法氏囊素三肽嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒rHVT- BS10-VP2，其制備方法如下: 1)10拷貝法氏囊素三肽BSlO寡核苷酸的合成:選用編碼賴氨酸Lys、組氨酸His和甘氨酸Gly的常用密碼子按順序排列成BS基因:5’-AAGCATGGC-3’，連續合成10個BS，BS串連基因單鏈及其反向互補鏈，通過退火使其復性成雙鏈； 2)含IBDVVP2和BSlO嵌合基因表達盒的火雞皰疹病毒HVT轉移載體的構建:根據已注冊的GenBank N0.X00221.1的gpt基因序列設計引物，以E.colim, a DNA為模板采用PCR方法擴增gpt基因，用其作為外源篩選基因，與質粒pEGFP中的CMV啟動子及poly (A)連接構建gpt表達盒CMV-gpt-poly A,經酶切測序驗證后，插入到含有火雞皰疹病毒HVT非必需區US10、S0RF3兩側基因的同源臂克隆質粒pUAB中，構建帶有篩選基因表達盒的克隆質粒pUAB-gpt ;將BS10-VP2嵌合基因插入到pUAB-gpt中，獲得重組火雞皰疹病毒轉移載體 pUAB-gpt-BS10-VP2，大小為 IOlOObp ； 3)表達嵌合蛋白的重組火雞皰疹病毒的制備:采用脂質體介導法，將重組轉移載體質粒pUAB-gpt-BS 10-VP2與HVT-FC126株基因共轉染原代雞胚成纖維細胞CEF，待出現病毒噬斑后，利用霉酚酸MPA阻斷核酸代謝途徑，經過篩選獲得純化的重組病毒rHVT-BS10-VP2。
3.如權利要求1或2所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其在禽類宿主中誘導抗禽類皰 疹病毒和雞傳染性法氏囊病毒的保護性免疫的應用。
4.如權利要求1或2所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其作為疫苗株的應用。
5.如權利要求3所述的重組火雞皰疹病毒rHVT-BS10-VP2，其作為疫苗株的應用。
【文檔編號】A61P31/22GK103589693SQ201310566984
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】潘群興, 王永山, 歐陽偉, 王曉麗, 畢振威, 夏興霞, 諸玉梅, 董晨紅, 何孔旺, 肖琦 申請人:江蘇省農業科學院