一種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應用。本發明將所分離的馬流感病毒的HA基因插入到復制缺陷型腺病毒載體中，構建了H3N8亞型馬流感HA基因重組腺病毒活載體疫苗rAd-XJ3-HA。小鼠和馬免疫試驗結果表明，本發明rAd-XJ3-HA疫苗能夠誘導所有馬產生中和抗體，具有良好的免疫原性，可作為預防或治療EI的候選疫苗。
【專利說明】—種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗及其應用，尤其涉及一種預防和治療H3N8亞型馬流感的重組腺病毒活載體馬流感基因工程疫苗及其應用，屬于生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]馬流感(Equine influenza, EI)是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型流感病毒中的馬流感病毒(Equine influenza virus, EIV)引起的馬屬動物一種嚴重的常見上呼吸道急性高度接觸性傳染疾病，多呈暴發性流行，傳播非常迅速而且廣泛。OIE規定EI為法定報告動物疫病，我國將其列為三類傳染病。
[0003]目前流行的EI主要為H3N8亞型，然而由于各種壓力H3N8亞型EIV也在不斷發生變異導致多個譜系病毒的出現，而且EIV已經跨越種間障礙，犬和豬感染EIV事件的發生，使得EI的防控具有重要的公共衛生學意義。近年來EI頻繁暴發，自2003年以來，在英國及其他歐洲國家和美國經常有EI暴發的報道。此外，其他很少發生EI疫情的地區也已受到影響，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴發了 EI疫情。澳大利亞這樣從未發生過EI的國家于2007年也遭受了 EI的襲擊。
[0004]我國大陸地區一直以來都是EI的高發區。自建國以來我國共發生5次EI疫情。2007-2008年，我國暴發了第四次EI疫情，給我國的養馬業及即將興起的賽馬業以沉重的打擊。疫情首先在新疆暴發，隨后蔓延至全國各地。2007年從新疆疫情中分離到一株H3N8亞型 EIV，命名為 A/Equine/Xinjiang/3/07 (H3N8) (XJ3)。2009 年在廣西省以及 2011 年在貴州省也暴發了小規模EI疫`情。自1974年我國首次暴發EI以來，除了海南，臺灣和福建不曾有文獻報道外，我國EI的分布幾乎遍及大江南北。
[0005]當前疫苗接種是控制EI的效策略。我國曾開展EI疫苗研制工作，但這些疫苗早已不用，一旦EI發生后，主要采取一些對癥治療措施。目前我國所用疫苗都依賴于國外引進，主要是法國Merial公司生產的重組金絲雀活載體疫苗Proteq-Flul。在2008年北京奧運馬術比賽舉辦之際，為了預防EI，我國不得不從國外引進EI疫苗進行緊急預防接種。對我國分離的H3N8亞型EIV的序列分析表明:我國流行的EIV屬于美洲譜系佛羅里達2群，而我國所使用的疫苗Proteq-Flul所對應的美洲譜系疫苗株屬于肯塔基亞譜系，兩者比較，在HA基因上有15個位點氨基酸發生了變異，其中有8個分別位于A、B和C抗原區上，這警示我國的EIV正在進行變異，而且實驗也證實進口疫苗對我國EI不能夠提供完全保護。基于進口疫苗的昂貴價格，以及抗原針對性不強等缺點，開發一種擁有我國自主知識產權、保護性良好的新型高效EI基因工程活載體疫苗具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗，具體涉及一種預防和治療馬流感(EI)的重組復制缺陷型腺病毒活載體馬流感基因工程疫苗，這種疫苗是以EIV XJ3囊膜糖蛋白HA作為保護性抗原的El和E3聯合缺失的復制缺陷型重組腺病毒rAd-XJ3-HA。
[0007]本發明以El和E3聯合缺失的復制缺陷型人腺病毒為載體，在El區攜帶有EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或者與SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或者它們的片段。 [0008]本發明的疫苗是以人腺病毒5型(ATCC VR5)為載體，將其缺失部分早期基因表達El編碼區(A 481-3533bp)和E3編碼區(A 28130_30820bp)，外源HA基因通過在大腸桿菌內同源重組整合入El編碼區。
[0009]本發明的疫苗中，所述的EIV囊膜糖蛋白，來源于我國流行的現地分離株XJ3HA基因全長cDNA，如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，也可為編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或其部分編碼序列，如HAl區(30-1067bp)，或者與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。在本發明的疫苗中，調控EIV囊膜糖蛋白HA基因進行表達的元件包括CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸加尾信號。rAd-XJ3-HA在動物細胞中并不復制，但能表達外源基因HA，其基因組在連續傳代過程中保持穩定。
[0010]本發明的EIV HA基因重組腺病毒的基本特征:1、透射電鏡觀察到所得的重組腺病毒具有典型的腺病毒形態；2、提取不同代次的重組腺病毒DNA進行測序，表明重組腺病毒具有良好的遺傳穩定性；3、重組腺病毒在AD293細胞中的滴度至少能夠達到IO8TCID5tl/ml以上；4、Western blot實驗表明表達的HA蛋白約為72ku,并可被馬抗EIV血清所特異性識別，與天然HA蛋白具有相似的生物學活性。
[0011]4X107TCID50rAd-XJ3-HA肌肉免疫小鼠能夠誘導產生較高的中和抗體效價，并能夠對親本強毒株XJ3的攻擊提供100%臨床保護。
[0012]4X108TCID5QrAd-XJ3-HA肌肉免疫馬能夠誘導產生中和抗體。由此可見，本發明EIV HA基因重組腺病毒活載體疫苗具有良好的免疫原性，可作為預防或治療EI的候選疫苗。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例1重組腺病毒rAd-XJ3_HA的制備流程圖；
[0014]圖2為小鼠免疫重組腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗后中和抗體效價圖；
[0015]圖3為馬免疫重組腺病毒rAd-XJ3-HA疫苗后中和抗體效價圖。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0017]實施例1本發明重組EIV HA基因復制缺陷型腺病毒rAd-XJ3-HA的構建(圖1所示)[0018]1、EIV XJ3HA 基因的 RT-PCR 擴增
[0019]使用華舜柱式病毒RNA提取試劑盒(上海華舜生物技術有限公司)提取EIVXJ3的RNA，具體步驟參見試劑盒說明書。以A型流感病毒反轉錄通用引物Un1-12:5，-AGCAAAAGCAGG-3’為反轉錄引物制備XJ3cDNA，反轉錄體系如下:DEPCH2019.0 μ L、LN27RNA5.0 μ L、AMV RT buffer8.0 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture4.0 μ L,Un1-12 通用引物2.0 μ L>RNase Inhibitorl.0 μ L 和 AMV Reverse Transcriptasel.0 μ L,總體積 40.0 μ L。將上述反轉錄體系混勻，室溫靜置IOmin后，放于42°C水浴鍋中反轉錄lh，然后將反轉錄產物立即冰浴靜置2min，隨后使用或置于_20°C保存。以XJ3cDNA為模板，用HA基因的特異性引物XJ3-HAF:
[0020]5，-CCCTCGAGATGAAGACAACC-3，和 XJ3-HAR:
[0021]5’ -CCCAAGCTTCTATCAGTTTAC-3’ 進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為:10 X PCRbuffer 10.0 μ L> Ex Taq 酶 0.5 μ L、2.5mmol/L dNTP mixture2.0 μ L, lOpmol/L HA基因上、下游引物各1.0 μ L、cDNA模板2.0 μ L和ddH2083.5 μ L,總體積100.0 μ L。PCR反應程序如下:94°C預變性5min、94°C變性30sec、53°C退火45sec、72°C延伸2min、72°C后延伸lOmin，共計30個循環。同時設無模板的陰性對照。反應結束后，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小。結果可見大小為1.7kb左右的HA基因片段，與預期的相符。
[0022]2、EIV HA基因重組腺病毒轉移載體的構建
[0023]HA基因的純化:將1.7kb的EIV HA基因片段從瓊脂糖凝膠上切下來，置于離心管中進行純化，具體試驗方法參見試劑盒說明書進行。
[0024]HA基因以及載體的酶切:將純化后的HA基因和腺病毒轉移載體pShuttle_CMV分別用Hind III和Xhol I進行雙酶切。體系如下:ddH2013.0 μ L/34.0 μ L、HA/pShuttle-CMV30.0μ L/10.0μ LUOXM Buffer5.0 μ L、Hind III 和 Xhol I 各 1.0μ L和石蠟油50.0 μ L，總體積100.0 μ L。37°C水浴2h后，`HA基因酶切產物用PCR純化試劑盒進行純化；pShuttle-CMV質粒酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全切開后，用膠回收試劑盒進行純化。
[0025]HA與載體的連接和轉化:在T4DNA連接酶作用下，將經限制性內切酶處理的HA基因與線性化的pShuttle-CMV進行連接，體系如下HA (Hind III +Xhol I Λ) 10.0 μ L、pShutt Ie-CMV (Hind III +Xhol I Δ) 5.Ομ LUOX T4DNA 連接酶 Buffer2.0 μ L、T4DNA 連接酶1.0 μ L和dd H202.0 μ L，總體積20.0 μ L。上述連接反應混合物置于16°C水浴鍋中連接過夜。將連接產物加入到TOPlO感受態細胞中，輕輕混勻后，冰浴30min，42°C熱激90sec，立即冰浴2min，加入800 μ LSOC培養基，于37°C搖床內，震蕩培養45min ;取出后于4000r/min離心2min ;棄去大部分上清，留200 μ L重懸培養物，涂布于含卡那霉素的LB瓊脂平板上，37 °C溫箱過夜培養。
[0026]HA基因重組質粒的鑒定:將菌落PCR初步鑒定為陽性的菌液分別接種于含卡那霉素的LB液體培養基中，于37°C搖床振蕩培養過夜。每個樣品分別取1.5mL菌液提取質粒進行瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并設有pShuttle-CMV質粒作為陰性對照。將進一步鑒定為陽性的重組質粒送往北京華大基因公司測序鑒定。利用DNASTAR軟件中Seqman程序進行序列拼接比對，結果表明重組質粒pShutt I e-XJ3-HA構建成功，HA基因如SEQ ID N0.1所示。
[0027]3、EIV HA基因重組腺病毒穿梭質粒的構建[0028]將pShuttle-XJ3_HA重組腺病毒轉移質粒用限制性內切酶Pme I線性化，反應體系如下:pShuttle-XJ3-HA44.0uL, IOXM Buffer5.0 u L, Pme I l.0u L,總體積 50.0u L037°C水浴2h，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒進行純化。然后將其電轉化至含有腺病毒骨架質粒PAdeasy-1的BJ5183感受態細胞中進行同源重組，同時設Pme I酶切的pShuttle-CMV空載體作為電轉化陰性對照。涂布卡那霉素抗性LB瓊脂板，37°C培養過夜。挑取菌落置于卡那霉素抗性LB液體培養基中增菌，提取質粒后，取10 y L質粒經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，并用Pac I進行酶切鑒定，反應體系如下:ddH2013.0iiLiiL，pAd-XJ3-HA 或 pAd-Negtive 分別為 30.0 u L, IOXM Buffer5.0 u L, Pac I l.0u L,總體積50.0uL0同時用XJ3-HAF和XJ3-HAR特異性引物進行PCR鑒定。結果顯示經Pac I酶切能夠產生3kb DNA條帶，PCR擴增出1.7kb的片段，表明EIV HA基因重組腺病毒穿梭質粒構建成功，命名為pAd-XJ3-HA，陰性對照命名為pAd-Negtive。
[0029]為了獲得大量高質量的重組質粒，將pAd-XJ3_HA和pAd-Negtive分別轉化T0P10感受態細胞，然后增菌大量提取重組質粒，Pac I酶切后，通過PCR純化試劑盒進行純化，然后用分光光度計進行DNA濃度測定，用于轉染實驗。
[0030]4、重組腺病毒的獲得
[0031]將AD293細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM完全培養液中，轉染前Id均勻鋪于6孔板，每孔約5X IO5個細胞。過夜培養后，將用經Pac I線性化的pAd-XJ3-HA和pAd-Negtive各4 ii g分別用Lipofectamine?2000脂質體轉染試劑進行轉染，具體操作見說明書。轉染后6h換液，繼續培養7d-10d，觀察細胞形態。當細胞大部分出現細胞病變后，反復凍融3次，離心收集上清作為第I代種毒。將第I代種毒以1:100的比例繼續接種AD293細胞，重復上述步驟以提高重組病毒滴度。
[0032]5、重組腺病毒的鑒定
[0033]重組腺病毒的PCR鑒定:提取第4代種毒的基因組DNA，用HA基因的特異性引物進行PCR鑒定，結果可見擴增出1.7kb的HA基因片段，表明HA基因重組腺病毒構建成功，命名為rAd-XJ3-HA，陰性對照命名為rAd-Negtive。
[0034]重組腺病毒的電鏡觀察:將第4代重組腺病毒rAd-XJ3_HA接種AD293細胞，待50%細胞出現病變后收獲上清。按照下述方法進行處理:3000r/min離心30min后，取上清10000r/min離心30min，棄去上清，沉淀用IOOyL PBS重懸，經負染后進行電鏡觀察。結果
可見重組病毒呈腺病毒典型形態
[0035]重組腺病毒復制滴度的測定:將第4、10和15代rAd-XJ3_HA進行10倍倍比稀釋，將IO2-1Oki倍稀釋的病毒液分別接種培養于96孔細胞培養板中的AD293細胞，每個稀釋度設8個重復，100 u L每孔，接毒后5d棄去上清，進行細胞免疫組化實驗，顯微鏡下觀察，有細胞染色則判為陽性，用Reed-Muench方法計算重組腺病毒的TCID5(I。結果顯示重組腺病毒的 TCID5tl 分別為 1.58 X 108/mL> 1.83 X 108/mL 1.49 X 108/mLo
[0036]重組腺病毒rAd-XJ3_HA遺傳穩定性檢測:分別提取第5、10和15代重組腺病毒rAd-XJ3-HA的DNA，并以其為模板用HA基因特異性引物XJ3-HAF和XJ3-HAR進行PCR擴增，然后將PCR產物純化后進行測序。用DNAStar程序中的Seqman軟件進行序列拼接，并與H3N8亞型EIV HA基因進行序列比對。結果表明各代次重組病毒中插入的HA基因核苷酸序列與H3N8亞型EIV HA基因序列相同，沒有發生變異。[0037]實施例2本發明重組腺病毒rAd-XJ3_HA的免疫學鑒定
[0038]1、重組腺病毒表達蛋白的細胞免疫組化檢測
[0039]將第4代rAd-XJ3_HA和rAd-Negtive分別接種培養于6孔組織培養板中的AD293細胞，3d后棄去上清，用預冷的PBS洗滌細胞3次，然后用4%的福爾馬林固定lOmin，加入小鼠抗H3N8亞型EIV特異性血清(1:100倍稀釋)作為一抗，37°C作用lh，用預冷的PBST洗3遍，每次5min，然后加入HRP標記的羊抗鼠IgG (1:2000倍稀釋)作為二抗，37°C作用Ih,用預冷的PBST洗3遍,每次5min,然后經DAB顯色試劑顯色IOmin,顯微鏡下觀察,并拍照記錄結果。同時設未感染病毒的AD-293細胞作為陰性對照。結果可見rAd-XJ3-HA接種細胞獲得染色，而rAd-Negtive接種細胞及正常細胞對照未見染色。
[0040]2、重組腺病毒表達HA蛋白的Western blot檢測
[0041]將第4代rAd-XJ3-HA和rAd-Negtive分別接種AD293細胞，3d后收集細胞，用PBS洗滌除去血清，加入SDS上樣緩沖液常規處理后，進行SDS-PAGE，隨后進行蛋白轉印，用小鼠抗H3N8亞型EIV特異性血清(1:100倍稀釋)作為一抗，以IRDye?700DX熒光標記的山羊抗小鼠IgG (1:1000倍稀釋)作為二抗進行Western blot檢測，同時以未感染病毒的AD293細胞細作為陰性對照。結果只有rAd-XJ3-HA接種細胞在70ku處出現特異性蛋白條帶染色，與預期結果一致。
[0042]實施例3本發明重組腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗對小鼠的免疫保護實驗
[0043]將24只6w雌性Balb/c小鼠隨機分成3組，每組8只。第一組后肢肌肉接種4父107_°1'(:105(^(1^3-通，第二組后肢肌肉接種4\107°1'(:105(^(1-他8衍代作為對照，第三組后肢肌肉接種0.2ml PBS作為對照。一免后4w以相同方式和劑量加強免疫，并于二免后2w第一組和第二組用XJ3親本強毒株以IO7 tlEID5tl的劑量通過呼吸道進行攻毒，第三組不攻毒作為對照。攻毒后每天觀`察臨床癥狀，并定時測量體重，連續監測14d。免疫前Id、一免后2w和4w、二免后2w以及攻毒后2w分別采血,分離血清,測定中和抗體效價(如圖2所示)。
[0044]首免2w rAd-XJ3_HA組小鼠即可檢測到中和抗體。免疫后用親本強毒株XJ3進行攻毒，rAd-XJ3-HA免疫組小鼠體重沒有發生顯著變化，與未攻毒組相似，而rAd-Negtive對照組小鼠體重下降明顯。
[0045]重復上述實驗，小鼠攻毒后每隔Id每組各剖殺2只小鼠，檢測病毒在臟器中的復制。結果表明rAd-XJ3_HA組小鼠沒有檢測到病毒在體內復制,而rAd-Negtive對照組小鼠攻毒后第2d，4d和6d在肺臟中均能夠檢測到病毒。
[0046]實施例4本發明重組腺病毒rAd-XJ3_HA疫苗對馬的免疫原性
[0047]將rAd-XJ3_HA以每匹馬4X 108_tlTCID5tl的劑量頸部肌肉接種4匹馬，另外設非免疫對照2匹馬，每匹馬接種ImL PBS0 一免后4w加強免疫，劑量和方法同一免。二免2w后用XJ3親本強毒株以IO8EID5tl的劑量通過呼吸道進行攻毒。免疫前Id、免疫后每周以及攻毒后lw、2w和3w分別采血，分離血清，測定中和抗體效價(如圖3所示)。疫苗免疫后能夠誘導所有馬產生中和抗體。
[0048]實驗結論:本發明構建的H3N8亞型EI HA基因重組腺病毒活載體疫苗rAd-XJ3_HA在小鼠模型上具有良好的免疫保護效果，在馬體實驗中能夠誘導所有馬產生中和抗體，具有良好的免疫原性，可作為預防或治療EI的候選疫苗。
【權利要求】
1.一種重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感病毒基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗是以El和E3聯合缺失的復制缺陷型人腺病毒為載體，在El區攜帶有H3N8亞型馬流感病毒囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，或者與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡并性的序列，或者它們的片段。
2.根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的人腺病毒為5型人腺病毒(ATCCVR5)。
3.根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的H3N8亞型馬流感病毒囊膜糖蛋白HA 基因來自于 A/Equine/Xinjiang/3/07 (H3N8)病毒。
4.根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的調控馬流感病毒囊膜糖蛋白HA基因進行表達的元件包括CMV啟動子和SV40多聚腺苷酸加尾信號。
5.權利要求1所述的重組復制缺陷型腺病毒載體馬流感基因工程疫苗在制備預防和治療馬流感的活載體疫苗中的應用。
6.一種疫苗組合物，其特征在于，包含權利要求1所述的疫苗，以及藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑等。
【文檔編號】A61K48/00GK103757054SQ201410010283
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】劉明, 劉春國, 相文華 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所