Otud3蛋白在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用的制作方法

Otud3蛋白在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了OTUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用。OTUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達OTUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-7)中至少一種功能的產品中的應用。本發明的實驗證明，OTUD3作為一個新發現的重要抑癌蛋白抑制腫瘤的生成與轉移，OTUD3功能的發現將對腫瘤診斷、預防及治療提供重要的科學依據與應用價值。
【專利說明】0TUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種0TUD3蛋白在制備抑制腫瘤生長的產品中的應用。

【背景技術】
[0002]抑癌蛋白 PTEN (phosphatase and tens1n homologue deleted from chromosome10，又稱作MMACl或TEP1)基因是1997年由美國的兩個獨立研究小組在人類染色體10q23.3定位的一個新的抑癌基因。該基因編碼的蛋白PTEN長403個氨基酸，由磷酸酶結構域(15-185)、C2 結構域(186-351)、PEST 模序區(352-400)和 PDZ 結合區(401-403)構成，PTEN具有脂質磷酸酶和蛋白質磷酸酶活性，更為精細的研究表明，其脂質磷酸酶活性在其抑癌活性中具有更為重要的地位，它能特異性地使磷脂酰肌醇_3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3, 4, 5-triphosphate, PIP3)的3位磷酸基團去磷酸化，從而拮抗PI3K激酶的功能，抑制PI3K下游特別是Akt通路的信號轉導，具有抑制細胞生長、增殖、遷移等多種效應。PTEN基因是繼p53基因之后目前已知與腫瘤發生發展關系最為密切的抑癌基因之一，在血液系統腫瘤、腦膠質瘤、消化道腫瘤、婦科腫瘤、泌尿道腫瘤、肺癌、骨肉瘤等諸多腫瘤中均檢測到該基因的突變或雜合性缺失(LOH)，并發現其蛋白表達水平下調或缺失，在腫瘤易感的疾病如Cowden疾病、Bannayan-Riley-Ruvalcaba綜合征病人中也常檢測到PTEN突變。純合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死，雜合缺失PTEN基因的小鼠則自發形成多種類型的腫瘤，確證PTEN確實在體內具有抑癌基因的功能。近年來，大量組織特異性的PTEN基因敲除小鼠模型的建立及表型分析進一步揭示，PTEN在細胞代謝、細胞運動性與極性、腫瘤微環境、細胞衰老、干細胞調控等諸多細胞學過程中發揮了極為重要的生理功能。目前公認的PTEN在細胞質內的主要作用機理仍然是通過調控PIP3的去磷酸化而抑制PI3K-Akt通路，因此常稱為PTEN-PI3K-Akt通路或PTEN-Akt-mTOR通路等，在幾乎每一種PTEN基因敲除的組織或器官中，Akt活性均上調，且Aktl敲除可以挽救PTEN+/_小鼠在許多易感組織成瘤的表型，表明PTEN確實是Akt信號通路的重要負調控分子。近五年來，有研究揭示，PTEN不僅在細胞質以磷酸酶依賴的方式發揮作用，也可以在細胞核內以磷酸酶非依賴的方式發揮功能且對其抑癌作用同樣具有重要貢獻。PTEN可定位于著絲粒并與動粒蛋白CENP-C蛋白結合，維持著絲粒穩定性；作用于染色質，上調Rad51水平，促進DNA雙鏈斷裂損傷修復，維持染色體穩定性；同時也可以與泛素連接酶APC/C結合，增強APC/C-Cdhl復合體的抑癌作用。
[0003]鑒于PTEN的重要性，其活性與穩定性必然受到嚴謹的調控。與P53半衰期非常短(約15-30分鐘)、細胞內源蛋白水平很低不同，PTEN半衰期相對較長(幾個小時)、細胞內源蛋白水平較高，二者同為重要的抑癌蛋白，發揮功能的機制雖也有交叉、但更多的是不同，P53主要在細胞核內作為轉錄因子發揮功能，而PTEN主要在細胞質中作為磷酸酶發揮功能；在細胞周期進程中，P53主要監控G1/S期，PTEN主要調控M期。理論上講，蛋白穩定性及蛋白量的控制，除了受到轉錄水平及蛋白質合成的影響外，非常重要的一種機制就是泛素化降解與去泛素化的陰陽平衡調控。泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)促進底物泛素化修飾，攜帶泛素鏈的蛋白為26S蛋白酶體識別并降解為肽段；與之相反，去泛素化酶(deubiquitinase, DUB)可以去除底物的泛素化，阻斷蛋白酶體介導的降解(proteasomaldegradat1n),保護底物蛋白使其水平上調。E3與DUB,就如同激酶與磷酸酶一樣,構成調節蛋白穩定性的重要分子對。考慮到P53和PTEN的半衰期差異，相對而言，促進p53泛素化修飾的E3 (如Mdm2、ARFBPl等)在調節p53半衰期中具有重要功能，相反，抑制PTEN泛素化修飾、阻斷蛋白酶體降解的DUB在調節PTEN半衰期中具有相對更為重要的角色。
[0004]截至目前，促進PTEN泛素化(包括單泛素化與多聚泛素化)的E3已報道有5個分子，分別是Nedd4-1、WWP2、CHIP、XIAP和剛剛在線發表的TRM27/RFP，而促進PTEN去泛素化的DUB只報道有I個分子，即HAUSP (又稱作USP7)，值得注意的是HAUSP特異地去除PTEN的單泛素化、促使PTEN從細胞核移位到細胞質，但并不影響PTEN的蛋白穩定性和蛋白量。確實，單泛素化和K63鏈式的多聚泛素化一般并不影響蛋白質的降解，而包括K48鏈式在內的其他類型的多聚泛素化才介導蛋白質的降解。因此，截至目前，去除PTEN多聚泛素化、抑制PTEN降解的DUB仍未見報道。
[0005]0TUD3是在國際上首次鑒定到的一個重要的蛋白，截止目前國際上0TUD3所公開的信息只有其基因序列、蛋白序列與其OTU結構域的空間結構，關于它的生物學功能與疾病相關性則均無公開。


【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達0TUD3蛋白的慢病毒的用途。
[0007]本發明提供的0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達0TUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-9)中至少一種功能的產品中的應用:
[0008]I)治療和/或預防腫瘤；2)抑制腫瘤細胞增殖；3)促進腫瘤細胞凋亡；4)抑制腫瘤細胞遷移；5)抑制腫瘤細胞偽足形成；6)抑制腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成能力；7)抑制正常細胞發生癌變；8)抑制腫瘤形成；9)抑制腫瘤發生轉移；所述0TUD3蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0009]上述應用中，所述0TUD3蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中序列I。
[0010]上述應用中，所述含有其編碼基因的重組載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入表達載體中得到的重組載體；
[0011 ] 所述表達載體具體為慢病毒表達載體或原核表達載體。
[0012]上述應用中，所述表達0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細胞，包裝得到慢病毒；
[0013]所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達載體中得到的重組載體。
[0014]本發明另一個目的是提供抑制0TUD3蛋白表達的物質的用途。
[0015]本發明提供的抑制0TUD3蛋白表達的物質在制備具有如下I)-8)中至少一種功能的產品中的應用也是本發明保護的范圍:1)促進腫瘤細胞增殖；2)抑制腫瘤細胞凋亡；3)促進腫瘤細胞遷移；4)促進腫瘤細胞偽足形成；5)促進腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成能力；6)促進正常細胞發生癌變；8)促進腫瘤形成；8)促進腫瘤發生轉移。
[0016]上述應用中，所述抑制0TUD3蛋白表達的物質為0TUD3蛋白的抑制劑，為干擾0TUD3基因表達的siRNA、干擾0TUD3基因表達的shRNA、含有干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體、表達干擾0TUD3基因表達的shRNA的慢病毒；
[0017]所述干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的核昔酸序列為序列表中序列6或序列7。
[0018]上述應用中，所述含有干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體為將干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因插入表達載體中得到的重組載體；
[0019]所述表達載體具體為慢病毒表達載體或原核表達載體；
[0020]所述表達0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細胞，包裝得到慢病毒；
[0021]所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達載體中得到的重組載體。
[0022]上述應用中，所述腫瘤為乳腺癌、結腸癌、肝癌或子宮頸癌。
[0023]上述應用中，所述產品為藥品。
[0024]本發明的第三個目的是提供一種抑制0TUD3蛋白表達的物質。
[0025]本發明提供的物質，為干擾0TUD3基因表達的siRNA、所述干擾0TUD3基因表達的shRNA、所述含有干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體或所述表達干擾0TUD3基因表達的shRNA的慢病毒；
[0026]所述干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
[0027]本發明的實驗證明，0TUD3作為抑癌蛋白PTEN的去泛素化酶，通過去除PTEN的多聚泛素化修飾、抑制PTEN蛋白質降解、穩定細胞質中PTEN的蛋白穩定性,從而抑制Akt通路的激活。裸鼠成瘤實驗表明0TUD3的敲低顯著促進細胞的成瘤能力及轉移能力，而0TUD3的過表達則顯著抑制腫瘤的生長。轉基因小鼠模型也證明0TUD3的高表達能夠抑制小鼠乳腺癌的發生發展。來自乳腺癌病人的臨床樣本顯示0TUD3在癌旁組織中的表達高于癌組織，與PTEN的表達成正相關。進一步的分析發現在癌組織中0TUD3存在功能性基因突變，是在國際上首次發現0TUD3作為一個抑癌蛋白抑制腫瘤的生成與轉移。
[0028]綜上所述，0TUD3作為一個新發現的重要抑癌蛋白，可以抑制腫瘤的生成與轉移，0TUD3功能的發現將對腫瘤診斷、預防及治療提供重要的科學依據與應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為敲低0TUD3的表達促進腫瘤細胞的生長與遷移
[0030]其中，IA敲低0TUD3的表達細胞增殖實驗結果；IB細胞凋亡實驗結果；IC在乳腺癌細胞MCF7中敲低0TUD3的表達遷移能力結果；1D在結腸癌細胞HCT116、肝癌細胞H印G2以及子宮頸癌細胞HeLa中敲低0TUD3的表達遷移能力結果；1E在乳腺癌細胞MCF7、結腸癌細胞HCTl 16、肝癌細胞H印G2以及子宮頸癌細胞HeLa中敲低0TUD3的表達細胞偽足結果；IF軟瓊脂集落形成實驗。
[0031 ] 圖2為0TUD3抑制腫瘤細胞生長
[0032]圖2A，2B為敲低0TUD3的表達軟瓊脂集落形成實驗及裸鼠成瘤實驗結果；
[0033]圖2C，2D為過表達0TUD3軟瓊脂集落形成及裸鼠成瘤能力；
[0034]圖2E、2F、2G、2H為0TUD3抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的發生結果；
[0035]圖21為其它腫瘤細胞中敲低0TUD3的表達WB結果；
[0036]圖3為敲低0TUD3的腫瘤細胞發生肝轉移
[0037]圖3A-3D為敲低0TUD3腫瘤細胞的肝轉移能力結果；
[0038]圖3E為對臨床腫瘤(乳腺癌、結直腸癌等)病人樣本癌旁組織中0TUD3的mRNA結果;
[0039]圖3F為通過免疫組化分析發現0TUD3在癌旁組織中的表達；
[0040]圖3G、3H、3I對200多例臨床樣本分析0TUD3的表達與PTEN的表達呈正相關性；
[0041]圖4為0TUD3突變體E86K對腫瘤細胞的生長與遷移的影響
[0042]圖4A為0TUD3突變位點E86K ；
[0043]圖4B和4C為E86K的突變導致0TUD3喪失了對PTEN的穩定作用；
[0044]圖4D和4E為E86K的突變使0TUD3喪失了對PTEN的去泛素化能力；
[0045]圖4F和4G為E86K突變導致細胞增殖加快；
[0046]圖4H為E86K突變導致細胞遷移能力增強；
[0047]圖41為E86K突變有利于細胞偽足；
[0048]圖4J為E86K突變利于細胞軟瓊脂集落的形成。

【具體實施方式】
[0049]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0050]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0051]實施例1、過表達0TUD3慢病毒和敲低0TUD3表達慢病毒的獲得
[0052]1、過表達0TUD3慢病毒的獲得
[0053]I)、0TUD3蛋白及編碼基因的獲得
[0054]人源0TUD3基因包含8個外顯子和7個內含子，其mRNA序列全長6523nt (核苷酸序列為序列5)，CDS區為1197nt (核苷酸序列為序列1)，編碼一個含有398個氨基酸的蛋白質0TUD3 (氨基酸序列為序列2)。
[0055]0TUD3蛋白主要含有2個結構域:0TU (ovarian tumor domain)結構域和UBA (ubiquitin-associated domain)結構域。通過激光共聚焦顯微鏡觀察到0TUD3主要定位于細胞的細胞質中。
[0056]利用購買的0TUD3抗體，在12種乳腺癌細胞系、HCT116(結腸癌細胞)、H印G2(肝癌細胞)以及HeLa (子宮頸癌細胞)和293T (人胚腎細胞)中檢測了 0TUD3的表達，結果顯示0TUD3在各細胞系中均有表達，但在轉移能力較強的乳腺癌細胞中表達很低。
[0057]2)、過表達0TUD3重組質粒Flag_0TUD3的制備
[0058]設計正向反向引物對:
[0059]正向引物:gatGAATTC a ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜體為 EcoRI 的酶切位點)
[0060]反向引物:ataGGTACC TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜體為 KpnI 的酶切位點)
[0061]以人工合成的序列2為模板，用上述引物對進行PCR擴增，回收1216bpPCR擴增產物。用限制性內切酶EcoR I和Kpn I雙酶切PCR擴增產物，回收酶切產物，將酶切產物與經過同樣酶切的pFlag-CMV-2表達載體(Sigma，目錄號為E7398)連接，得到重組載體Flag-0TUD3,經過測序,該重組質粒為將序列表序列2所示的0TUD3插入pFlag-CMV-2表達載體的EcoR I和Kpn I酶切位點間得到的重組載體。
[0062]3)過表達0TUD3的慢病毒制備
[0063]設計正向反向引物對:
[0064]正向引物:gatggatcc ac ATGTCCCGAAAGCAGGCGG(斜體為 BamH I 的酶切位點)
[0065]反向引物:ataaccggt TCAGATGTTGAGAGCGGCG(斜體為 Age I 的酶切位點)
[0066]以Flag_0TUD3質粒為模板，用上述引物對進行PCR擴增，回收1216PCR擴增產物，用限制性內切酶BamH I和Age I雙酶切上述PCR擴增產物，回收酶切產物，將酶切產物與AgeI酶切的慢病毒表達載體FUGW(Addgene，目錄號為14883)連接，得到重組慢病毒過表達質粒,經過測序,重組慢病毒過表達質粒為將序列表中序列2所示的0TUD3插入慢病毒表達載體FUGW的Age I酶切位點間得到的載體。
[0067]將重組慢病毒過表達質粒與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G(Invitrogen)共轉染293T細胞，收集帶病毒的細胞培養液，濃縮儲存，得到過表達0TUD3的慢病毒(滴度為5X108TU/ml)。
[0068]將FUGW與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉染293T細胞，收集帶病毒的細胞培養液，濃縮儲存，得到陰性對照慢病毒。
[0069]2、敲低0TUD3表達的慢病毒制備
[0070]設計如下三條靶向人源0TUD3基因的shRNA的編碼基因:
[0071 ] #1: TGGAAATCAGGGCTTAAAT (序列 6)
[0072]#2:GAGTTACACATCGCATATC (序列 7)
[0073]#3: CGTCTGCCATCGCATATTA (序列 8)
[0074]Contro 1: TTCTCCGAACGTGTCACGT (序列 9)
[0075]以上各條shRNA以及陰性對照control shRNA由Dharmacon公司負責合成。
[0076]分別將合成的四條shRNA連接到慢病毒載體GV112上，得到連接不同shRNA的重組慢病毒敲低質粒#1、#2、#3。
[0077]經過測序，
[0078]重組慢病毒敲低質粒#1為將序列表中序列6所示的核苷酸插入慢病毒載體GV112的Agel和EcoRl酶切位點間得到的載體；
[0079]重組慢病毒敲低質粒#2為將序列表中序列7所示的核苷酸插入慢病毒載體GV112的Agel和EcoRl酶切位點間得到的載體；
[0080]重組慢病毒敲低質粒#3為將序列表中序列8所示的核苷酸插入慢病毒載體GVl 12的Agel和EcoRl酶切位點間得到的載體。
[0081]將重組慢病毒敲低質粒#1、重組慢病毒敲低質粒#2、重組慢病毒敲低質粒#3分別與慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G共轉染293T細胞，收集帶病毒的細胞培養液，濃縮儲存，得到敲低0TUD3表達的慢病毒#1、#2、#3 (滴度均為5X 108TU/ml)。
[0082]實施例2、0TUD3或敲低0TUD3表達的物質的功能研究
[0083]一、0TUD3在抑制腫瘤細胞的增殖中的應用
[0084]用由實施例1制備的敲低0TUD3表達的慢病毒#1、過表達0TUD3的慢病毒和陰性對照慢病毒分別感染乳腺癌細胞MCF7(北京協和醫科大學細胞庫)，通過嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達的細胞系MCF7、過表達0TUD3的細胞系MCF7和陰性對照細胞系MCF7。
[0085]將IX 13個上述3種細胞分別種植于96孔板中，培養24小時、48小時、72小時、96小時、120小時后加入0.05mg Inr1MTS (Promega)，在37°C繼續培養4小時后，檢測490納米光波下的吸光度值(0D490)。根據標準曲線計算相應的細胞數。
[0086]結果如圖1A所示:
[0087]敲低0TUD3表達的細胞系MCF7 (sh0TUD3#l)培養24小時、48小時、72小時、96小時的細胞數分別為3X 103、5.5X 103、8X 103、1.6X 14個;陰性對照細胞系MCF7 (control)培養24小時、48小時、72小時、96小時的細胞數分別為1.5Χ103、3.5Χ 103、4X 103、7X 13個。
[0088]結果如圖4G所示:
[0089]過表達0TUD3的細胞系MCF7 (0TUD3-WT)培養24小時、48小時、72小時、96小時、120小時的細胞數分別為2X103、3X103、4.5X 13,8X 13U.1 X 14個；陰性對照細胞系MCF7培養24小時、48小時、72小時、96小時、120小時的細胞數分別為3Χ103、5.5Χ103、8Χ103、1.2Χ104、1.8Χ104 個。
[0090]從上述可以看出，與陰性對照細胞系相比，過表達0TUD3細胞系抑制腫瘤細胞增殖；敲低0TUD3細胞系促進腫瘤細胞增殖，表明，0TUD3抑制腫瘤細胞增殖、敲低0TUD3表達的慢病毒促進腫瘤細胞增殖。
[0091]二、0TUD3促進腫瘤細胞的凋亡
[0092]敲低0TUD3表達的細胞系MCF7 (sh0TUD3#l)和陰性對照細胞系MCF7 (control)培養48小時后加10 μ M cisplatin(Sigma)和陰性對照試劑DMSO處理12小時，收集細胞，用PBS 洗漆后，用 fluorescein isoth1cyanate-Annexin V and propidium 1dide (BeijingB1sea b1technology Annexin V Kit)染色。用流式細胞儀檢測凋亡細胞的比率。
[0093]結果如圖1B所示:
[0094]敲低0TUD3表達的細胞系凋亡細胞的比率為12% ；
[0095]陰性對照細胞系轉染的細胞系凋亡細胞的比率為28%。
[0096]從上述可以看出，與陰性對照細胞系相比，敲低0TUD3細胞系抑制腫瘤細胞凋亡，表明，0TUD3促進腫瘤細胞凋亡，敲低0TUD3的慢病毒抑制腫瘤細胞凋亡。
[0097]三、0TUD3抑制腫瘤細胞的遷移
[0098]用敲低0TUD3表達的慢病毒#1、#2和陰性對照慢病毒分別感染乳腺癌細胞MCF7、結腸癌細胞HCT116、肝癌細胞H印G2以及子宮頸癌細胞HeLa，通過嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3 表達的細胞系 MCF7 (#1、#2)、HCTl 16 (#1、#2)、H印G2 (#1、#2)、HeLa (#1、#2)和陰性對照細胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa。用0TUD3過表達的慢病毒和陰性對照慢病毒分別感染乳腺癌細胞MCF7，通過嘌呤霉素篩選得到0TUD3過表達的細胞系MCF7和陰性對照細胞系MCF7。
[0099]將IX 16個上述各種細胞分別懸浮于不含有血清的培養基中種植于transwell小皿的內室中，外室中添加含有10% FBS的培養基。培養48小時后，用棉簽去除內室的細胞，在外室培養基中加入終濃度0.05mg Iiir1MTS(Promega)，在37°C繼續培養4小時后，在490納米光波下檢測吸光度值。
[0100]結果如圖1C所示:
[0101]敲低0TUD3表達的細胞系MCF7(sh01D3#l)遷移的細胞數為1.4X 15個；
[0102]敲低0TUD3表達的細胞系MCF7 (sh01D3#2)遷移的細胞數為1.6 X 15個；
[0103]陰性對照的細胞系MCF7的遷移細胞數為0.6 X 15個；
[0104]結果如圖1D所示:
[0105]敲低0TUD3表達的細胞系HCT116(sh0TUD3#l)遷移的細胞數為1.2X 15個；
[0106]敲低0TUD3表達的細胞系HCT116(sh0TUD3#2)遷移的細胞數為1.0X 15個
[0107]敲低0TUD3表達的細胞系H印G2(sh0TUD3#l)遷移的細胞數為1.4X 15個；
[0108]敲低0TUD3表達的細胞系H印G2 (sh0TUD3#2)遷移的細胞數為1.5 X 15個
[0109]敲低0TUD3表達的細胞系HeLa(sh0TUD3#l)遷移的細胞數為0.85 X 15個；
[0110]敲低0TUD3表達的細胞系HeLa(sh0TUD3#2)遷移的細胞數為0.9 X 15個；
[0111]陰性對照的細胞系HCT116的遷移細胞數為0.3X105個；
[0112]陰性對照的細胞系!fepG2的遷移細胞數為0.4 X 15個；
[0113]陰性對照的細胞系HeLa的遷移細胞數為0.2 X 15個。
[0114]結果如圖4H所示:
[0115]0TUD3過表達的細胞系MCF7 (0TUD3-WT)遷移的細胞數為0.5 X 14個；
[0116]陰性對照的細胞系MCF7(_)的遷移細胞數為2.2 X 14個；
[0117]可以看出，0TUD3抑制腫瘤細胞的遷移，敲低0TUD3表達的慢病毒促進遷移。
[0118]四、0TUD3抑制腫瘤細胞偽足的形成
[0119]用敲低0TUD3表達的慢病毒#1和陰性對照慢病毒分別感MCF7、HCT116、H印G2和HeLa ;通過嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達的細胞系MCF7、HCT116、H印G2、HeLa和陰性對照細胞系 MCF7、HCTl 16、H印G2、HeLa。
[0120]將上述各種細胞株種植在confocal小皿中，48小時后，對細胞進行固定。封閉處理后對F-actin，PTEN, 0TUD3進行間接免疫熒光染色以及對細胞核進行DAPI染色。通過激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細胞偽足的形成情況。
[0121]結果如圖1E所示，control為陰性對照細胞系MCF7、sh0TUD3為敲低0TUD3表達的細胞系MCF7(sh 0TUD3#1)，可以看出，與control相比，sh0TUD3偽足的形成能力顯著增強。
[0122]轉染結腸癌細胞HCT116、肝癌細胞H印G2以及子宮頸癌細胞HeLa，結果與上述無顯著差異。
[0123]表明，0TUD3抑制腫瘤細胞偽足的形成、敲低0TUD3表達的慢病毒促進腫瘤細胞偽足的形成。
[0124]五、0TUD3抑制腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成能力
[0125]用敲低0TUD3表達的慢病毒#1、#2、過表達0TUD3的慢病毒和陰性對照慢病毒分別感染乳腺癌細胞MCF7，通過嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達的細胞系MCF7、過表達0TUD3的細胞系MCF7、陰性對照細胞系MCF7。
[0126]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基。將上述各細胞系IX 14個穩定細胞株懸浮于含有0.35%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續培養3周后，進行結晶紫染色對直徑大于
0.1mm的克隆群進行計數。
[0127]結果如圖1F所示:
[0128]敲低0TUD3表達的細胞系MCF7(sh0TUD3#l)的克隆群數為100個左右，敲低0TUD3表達的細胞系MCF7 (sh0TUD3#2)的克隆群數為90個左右，陰性對照細胞系MCF7的克隆群數為25個左右；
[0129]結果如圖4J所示:
[0130]過表達0TUD3的細胞系MCF7(WT)的克隆群數為100個左右，陰性對照細胞系MCF7的克隆群數為35個左右。
[0131]表明，敲低0TUD3的慢病毒促進MCF7細胞的軟瓊脂集落形成能力，0TUD3抑制MCF7細胞的軟瓊脂集落形成能力。
[0132]六、敲低0TUD3促進正常細胞的癌變
[0133]用敲低0TUD3表達的慢病毒#1、#2和陰性對照慢病毒分別感染正常乳腺上皮細胞MCFlOA(北京協和醫科大學細胞庫)，通過嘌呤霉素篩選得到敲低0TUD3表達的細胞系MCF1A、陰性對照細胞系MCF1A。
[0134]用Western blotting檢測(WB檢測)敲低 0TUD3 表達的細胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對照細胞系MCF10A，結果如圖2A所示，可以看出，與陰性對照細胞系MCFlOA相比，sh0TUD3#l和sh0TUD3#2細胞中0TUD3表達量明顯降低，說明敲低成功。
[0135]在6孔板中加入Iml含有0.7%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基。將I X 14個敲低0TUD3表達的細胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對照細胞系MCFlOA懸浮于含有0.35%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續培養3周后，進行結晶紫染色對直徑大于0.1mm的克隆群進行計數。
[0136]結果如圖2B所示，
[0137]敲低0TUD3表達的細胞系MCFlOA(sh0TUD3#l)的克隆群數為100個左右；敲低0TUD3表達的細胞系MCFlOA (sh0TUD3#2)的克隆群數為90個左右；
[0138]陰性對照細胞系MCFlOA卻沒有克隆形成。
[0139]將24只6周齡雌裸鼠隨機分為3組，分別將2X 17個上述制備的敲低0TUD3表達的細胞系MCFlOA (sh0TUD3#l和sh0TUD3#2)、陰性對照細胞系MCFlOA (control)種植在6周齡雌裸鼠的近腋窩處的皮下。每周觀察小鼠的成瘤情況。對腫瘤做H&E染色和免疫組化分析。
[0140]結果如下表I所示，
[0141]
裸鼠皮+K注射敲低0TUD3奪圍性對愿_胞系MCFlOA后的成瘤怙況

?瘤小鼠的數.? (%)—
3周4周5周
Control 0/8 (0)0/8 (0)0/8 (0)
shOTUDS #1 4/8 (50)δ/8 (62.δ)5/8 (62.5)
shOTUDS #2 3/8 (87.5) 4/8 (50)5/8 (62.5)
[0142]sh0TUD3#l組有5只小鼠成瘤；
[0143]sh0TUD3#2組有5只小鼠成瘤；
[0144]control組有O只小鼠成瘤；
[0145]可以看出，敲低0TUD3促進正常細胞的癌變。
[0146]七、過表達0TUD3抑制腫瘤的形成
[0147]用上述得到的0TUD3過表達的以及陰性對照慢病毒感染乳腺癌細胞MCF7，通過嘌呤霉素篩選得到0TUD3過表達細胞系MCF7、陰性對照細胞系MCF7。
[0148]用WB檢測0TUD3過表達細胞系MCF7 (WT)、陰性對照細胞系MCF7，結果如圖2C所示，可以看出，與陰性對照細胞系MCF7相比，0TUD3過表達細胞系MCF7 (WT)中0TUD3表達量明顯提高，說明過表達成功。
[0149]在6孔板中加入1ml含有0.7%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基。將I X 14個0TUD3過表達細胞系MCF7 (WT)、陰性對照細胞系MCF7懸浮于含有0.35%低熔點瓊脂糖和10% FBS的DMEM培養基，加入上層。在37°C、5% CO2恒溫箱中連續培養3周后，進行結晶紫染色對直徑大于0.1mm的克隆群進行計數。
[0150]結果如2D所示， [0151 ] 0TUD3過表達細胞系MCF7 (WT)的克隆群數為35個左右；
[0152]陰性對照細胞系MCF7的克隆群數為100個左右。
[0153]將16只6周齡雌裸鼠隨機分為2組，將2 X 17個0TUD3過表達細胞系MCF7 (WT)、陰性對照細胞系MCF7分別種植在6周齡雌裸鼠的近腋窩處的皮下。每周觀察小鼠的成瘤情況。對腫瘤做H&E染色和免疫組化分析。
[0154]結果如表2所示，

【權利要求】
1.0TUD3蛋白或其編碼基因或含有其編碼基因的重組載體或表達0TUD3蛋白的慢病毒在制備具有如下1)-9)中至少一種功能的產品中的應用: 1)治療和/或預防腫瘤； 2)抑制腫瘤細胞增殖； 3)促進腫瘤細胞凋亡； 4)抑制腫瘤細胞遷移； 5)抑制腫瘤細胞偽足形成； 6)抑制腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成能力； 7)抑制正常細胞發生癌變； 8)抑制腫瘤形成； 9)抑制腫瘤發生轉移； 所述0TUD3蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述0TUD3蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于:所述含有其編碼基因的重組載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入表達載體中得到的重組載體； 所述表達載體具體為慢病毒表達載體或原核表達載體。
4.根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于:所述表達0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細胞，包裝得到慢病毒； 所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達載體中得到的重組載體。
5.抑制0TUD3蛋白表達的物質在制備具有如下1)-8)中至少一種功能的產品中的應用: 1)促進腫瘤細胞增殖； 2)抑制腫瘤細胞凋亡； 3)促進腫瘤細胞遷移； 4)促進腫瘤細胞偽足形成； 5)促進腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成能力； 6)促進正常細胞發生癌變； 7)促進腫瘤形成； 8)促進腫瘤發生轉移。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于: 所述抑制0TUD3蛋白表達的物質為干擾0TUD3基因表達的siRNA、干擾0TUD3基因表達的shRNA、含有干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體、表達干擾0TUD3基因表達的shRNA的慢病毒； 所述干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于: 所述含有干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體為將干擾0TUD3基因表達的shRNA編碼基因插入表達載體中得到的重組載體； 所述表達載體具體為慢病毒表達載體或原核表達載體； 所述表達0TUD3蛋白的慢病毒為將含有其編碼基因的重組慢病毒載體侵染宿主細胞，包裝得到慢病毒； 所述重組慢病毒載體為將所述0TUD3蛋白編碼基因插入慢病毒表達載體中得到的重組載體。
8.根據權利要求1-7中任一所述的應用，其特征在于:所述腫瘤為乳腺癌、結腸癌、肝癌或子宮頸癌。
9.根據權利要求1-7中任一所述的應用，其特征在于:所述產品為藥品。
10.一種抑制OTUD3蛋白表達的物質，為干擾OTUD3基因表達的siRNA、所述干擾OTUD3基因表達的shRNA、所述含有干擾OTUD3基因表達的shRNA編碼基因的重組載體或所述表達干擾OTUD3基因表達的shRNA的慢病毒； 所述干擾OTUD3基因表達的shRNA編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6或序列7。
【文檔編號】A61K48/00GK104174012SQ201410413298
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月20日 優先權日:2014年8月20日
【發明者】張令強, 賀福初, 袁林, 呂艷蓉, 李洪昌, 邢桂春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所