抑制腫瘤轉移的IgE抗體的制作方法

抑制腫瘤轉移的IgE抗體的制作方法
【專利說明】抑制腫瘤轉移的IgE抗體
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2013年6月12日提交的美國臨時申請No.61/834,169的權益，W及2013 年7月11日提交的美國專利申請No. 13/939，781的權益。W上申請的全部教導內容整體W引 用方式并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發明的作出得到了政府支持，具體為由美國國立衛生研究院（National InstitutesofHealth)資助的第CA111639號合同。政府在本發明中享有某些權利。
【背景技術】
[000引I姐抗體介導過敏和哮喘反應，運些反應的特征在于需要募集效應細胞的速發型 超敏和炎癥延遲型應答。I巧抗體從外周循環轉運到組織中，在那里它們可經由W下Ξ種類 型的化受體而結合過敏效應細胞，諸如肥大細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、樹突細胞、 朗格漢斯細胞、單核細胞和巨隧細胞:FceRK或高親和力化eRKKa=l0iiM-i)、FceRII(或低 親和力化eR，CD23KKa<l08M-i)和半乳凝素-3。不同于IgG類抗體，I巧W極高的親和力結合 到其化R，該親和力就化eRI而言比IgG對化R(Fc丫RI-III)的親和力高大約Ξ個數量級，且 就FcεRII而言，與IgG對其高親和力Fc丫RI的親和力一樣高（Gould，HJ，etal.， Annu.Rev.Immunol21:579-628.(2003);Gounni,AS,etalNature,367:183-186 (1994);Kinet,JP,Annu.Rev.Immunol.,17:931-72:931-972(1999)和RavetchJV,and KinetJP,Annu.Rev.Immunol.,9:457-492(1991))0
[0006]過敏腫瘤學(AllergoOncology)新出現的領域基于表明IgE介導的過敏與癌癥之 間存在逆相關性的觀察結果和研究（TurnerMC，etal.Jnt.J.Cancer,118 :3124-3132 (2006)；WangH&DiepgenTL,Allergy60:1098-1111,(2005)；TurnerMC,etal., Am.J.Epidemiol.,162:212-221(2005)；WangH,etal.,Int.J.Cancer,119:695-701 (2006)；MillsPK,etal.,Am.J.Epidemiol.,136:287-295(1992)；WiemelsJL,etal., (MincerRes.,64:8468-8473(2004);DodigS.,etal.,ActaPharm.,55:123-138(2005)和 WrenschM.,etal.,CancerRes.,66:4531-4541(2006))。因此，該領域的研究人員正在探 索I巧抗體類在W下前提下在預防和治療某些癌癥中的治療潛力:最初作為對微生物/寄生 蟲感染的適應性反應而發生的免疫反應在抗惡性腫瘤時可能是有用的。
[0007] IgE在癌癥治療方面的應用由Nagy等人倡導（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother.，34:63-69(1991))，他們開發了對小鼠乳瘤病毒(MTV)的大囊膜糖 蛋白（gp36)具有特異性的鼠I姐單克隆抗體并證實了在具有同基因MMTV分泌性乳腺腺癌 (H27 12)的C3H/HeJ小鼠中的顯著抗腫瘤活性（Nagy，E.，etal.，Cancer Immunol.Immunother. ,34:63-69 (1991))oKershaw等人(Kershaw,ΜΗ,etal. ,Oncol.Res., 10:133-142(1998))開發了名為30.6的鼠單克隆IgE,其為在結直腸腺癌細胞表面上表達的 抗原決定簇特異性的。小鼠I姐30.6抑制了在嚴重聯合免疫缺陷（SCID)小鼠中的皮下生長 的既定人結直腸癌COLO205細胞的生長，但運種效應是短暫的。相比之下，小鼠IgG30.6未 顯示出抗腫瘤效應。小鼠I巧的特定效果歸因于該抗體與具有FceR的效應細胞之間的相互 作用，因為該活性具體地通過事先施用非特異性小鼠I扣而喪失化ershaw，MH，etal.， Oncol.Res.，10:133-142(1998))eGould等人開發了卵巢癌腫瘤相關抗原葉酸鹽結合蛋白 (FBP)特異性的小鼠/人嵌合IgE(MOvlS-IgE)和IgGMOvlS(IgGl)。在人卵巢癌SCID小鼠異 種移植模型（IGR0V1)中對MOvlS-I巧和M0vl8-IgGl的保護活性進行了比較。MOvlS-I巧的有 益效果大于M0vl8-IgGl且持續時間更長，從而證實了I姐抗體優異的抗腫瘤效果(Gould, 町，etal.'Eur.J.Immunol.,29:3527-3537(1999))。
[0008]近來，Karagiannis等人證實了單核細胞通過兩種不同的途徑介導IgE依賴性腫瘤 細胞殺傷:ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)和ADCP(抗體依賴性細胞介導的吞隧作 用），運兩種途徑通過FceRI和FceRII介導（Karagiannis,SN,etalCancer Immunol.Immunother.,57:247-263(2008)和Karagiannis,SN,etal.,J.Immunol.,179: 2832-2843(2007))。該小組還使用運種測定系統證實了抗化巧可激活單核細胞而經由 ADCC在體外殺傷腫瘤細胞化arragiannisP.,etal.,(MincerImmunol.Immunother.,58: 915-930(2009) ,2008年10月22日在線出版）。另外的實例包括化等人(Clin.Exp.Immunol.， 153:401-409，2008)，他們證實了從膜腺癌患者分離的I姐類抗體介導對抗癌細胞的ADCC， W及Spillner等人(CancerImmunol.Immunother. ,61:1565-1573(2012)，他們展示了使用 單核細胞，在體外與抗EGFRIgG相比，抗EGFRI巧將對抗人上皮癌細胞系A431的細胞毒性 提高了高達95 %。
[0009]盡管在過敏腫瘤學的新興領域中出現了鼓舞人屯、的發現，但是仍然迫切需要開發 治療轉移癌的新型治療劑。

【發明內容】

[0010] 本發明提供了可用于抑制腫瘤生長和轉移的新型I姐抗體。提供了具有對腫瘤相 關抗原(TAA)的結合特異性的包含人ε恒定區和可變區的治療性單克隆I姐抗體。還提供了 對位于原發性實體瘤微環境中的至少一種宿主源非腫瘤細胞的活性重編程的方法，從而逆 轉該非腫瘤細胞促進腫瘤生長和轉移的能力。提供了治療患者中的轉移癌、抑制原發性腫 瘤發生轉移和減緩原發性或轉移性腫瘤的生長動力學的方法。
[0011] 在一個實施方案中，本發明提供了對位于患者實體瘤的微環境中的至少一種宿主 源非腫瘤細胞的活性重編程的方法，其中非腫瘤細胞介導腫瘤轉移的能力受到抑制，該方 法包括施用腫瘤相關抗原特異性的I姐抗體的步驟，其中抗體在腫瘤的微環境內形成Ξ元 復合物，所述Ξ元復合物由I巧抗體、腫瘤相關抗原和腫瘤環境內源性的宿主源非腫瘤細胞 構成，其中抗體特異性結合到腫瘤相關抗原和位于宿主源非腫瘤細胞的表面上的抗體受 體，該抗體受體為I巧特異性的。
[0012] 在另一個實施方案中，本發明提供抑制患者中的實體瘤轉移的方法，該方法包括 向患者施用能夠在腫瘤的微環境內形成Ξ元復合物的I巧抗體，所述Ξ元復合物由腫瘤相 關抗原特異性的I巧抗體、腫瘤相關抗原和腫瘤微環境內源性的宿主源非腫瘤細胞構成，其 中抗體特異性結合到腫瘤相關抗原和位于宿主源非腫瘤細胞的表面上的抗體受體，該抗體 受體為I巧特異性的，并且其中在形成Ξ元復合物后，非腫瘤細胞介導腫瘤轉移的能力受到 抑制。
【附圖說明】
[0013]前述的W及其他的目標、特征和優點會從W下的本發明的優選的實施方案的更具 體的描述中更明顯地表現出來，如附圖所示，在不同的視圖中，相似的字母對應相同的部 件。附圖并不一定是按照比例制作的，而是在強調表現本發明的原理。
[0014]圖1.嵌合I姐抗體的構造和抗原特異性。（A)載體構建體的圖形表示。親代載體為 pcDNA3.1/新霉素（pEpsilonI)、pEF6/滅攝素（pEpsilonII)、pcDNA3.1/博萊霉素 (pKappaI)和pcDNA3.1/潮霉素(pKappaII)。重鏈和輕鏈可變區基因從表1中的雜交瘤克 隆，并插入人ε或人k恒定區基因的上游。（B)SDS-PAGE分析。從轉染的CH0-K1克隆純化的嵌 合I姐W及得自骨髓瘤細胞系SK0-007的對照人I巧通過電泳在4-12%梯度丙締酷胺凝膠上 分離，并通過考馬斯藍染色。（C)抗體特異性分析。疊加柱狀圖示出了與未轉染的細胞系相 比，結合到用同族抗原轉染的細胞系的I姐的FACS分析。1巧.higE(抗hCD20)結合了用人 CD20cDNA轉染的A20細胞，而3C6.hI巧(抗hMUC1，部分糖基化的形式)在用hMUC1cDNA轉染的 小鼠乳腺癌細胞系4T-1上檢測到人MUC1。折線圖顯示了通過4冊.hi姐(抗hMUCl蛋白骨架） 對合成的hMUCl串聯重復膚（50mer)的ELISA檢測。對照膚源自hCD20的第二個胞外環 (43mer)。
[001引圖2.肥大細胞和嗜酸性粒細胞介導的體外腫瘤細胞毒性。柱狀圖顯示％PrCFSE+ 腫瘤細胞。將0CI-Ly8人B細胞淋己瘤細胞化CD20+)用l0-5mMCFSE標記15分鐘。將lXl05個 標記的細胞與未染色的CBMC和2.扣g/mlI巧(A和B)或廝帶血源性嗜酸性粒細胞(CBEo)和5 μg/mlI巧(C和D)混合，然后在37°C溫育2地。將細胞混合物用艦化丙晚(PI)染色，然后進行 流式細胞術分析。Pr細胞在CFSEhi組分中的百分比代表總腫瘤細胞毒性，并且結果W柱狀 圖形式示出。(A)在不同的效應細胞:祀細胞比率下CBMC和hi巧介導的腫瘤細胞毒性。（B)添 加化g/ml的封閉抗體或同種型對照化:Τ比率4:1)。（0在不同的效應細胞:祀細胞比率下 〔860和}11姐介導的腫瘤細胞毒性。（0)添加化旨/1111封閉抗體或101]/1111肝素。化:1'比率2.5: 1)。運里還顯示了由單獨的抗體誘導的腫瘤死亡的數據（即，在不存在效應細胞的情況下）。 顯示的結果為一個代表性實驗的平均值±SD。學生t檢驗*，ρ<0.05;**，ρ<0.01;***，ρ< 0.005。
[0016]圖3.腫瘤特異性I巧抑制體內腫瘤生長。在第0天將105個4Τ1.hMUCl腫瘤細胞皮下 接種到hFceRI小鼠的兩偵U。在第1、2、3、4和5天施用20yg對照或3C6.hIgE(抗hMUCl)。獲取2 維卡尺測量值，直到腫瘤面積超過300mm2"(A)平均腫瘤大小對時間的曲線圖。誤差條表示 每個組的平均值±50。在最后的時間點每個組的存活小鼠/總小鼠數在括號中指出。抗 hMUCl組明顯不同于對照組(雙向4顯￥4，口<0.001)。（8和〇從(4)中所示的實驗在第34天從 存活的小鼠收獲腫瘤、切片并針對肥大細胞染色。肥大細胞在腫瘤的中屯、區W及在瘤周區 域中基本上不存在。存在的肥大細胞(紅色箭頭)未脫粒(B)。僅有來自3C6.hi巧處理組的小 鼠的一個腫瘤含有被肥大細胞浸潤的區域，其顯示了脫粒的證據(C)。
[0017]圖4.}^1](：1特異性的小鼠1邑6介導。。61?1中的完全腫瘤排斥。將用人11](：1、抗hMUClI巧(3C6.mIgE)和/或細胞因子(MCP-1、比-5)轉染的4T1腫瘤細胞的四種不同組合在 第0天皮下接種到hFceRITg+小鼠的兩側。每只小鼠總共施用1〇5個細胞(n= 4只/組）"(A)四 個實驗組的說明。（B)實驗被設計為測試I姐抗體與同族抗原(MUC1)和被所研究的兩種細胞 因子吸引的髓樣細胞的相互作用。將細胞混合，然后立即皮下注射到FceRIKO/Tg小鼠的兩 側（100，000個細胞/小鼠）。通過二維卡尺生長來監控腫瘤生長。除了第4組外，在每個組中 均觀察到了漸進生長，在第4組中，腫瘤可暫時性觸知，然后永久性消退。所示的數據代表兩 個單獨的實驗。誤差條表示平均腫瘤大小±SD。
[001引圖S.hMUCl特異性的小鼠I巧介導化εΚΙKO/Tg小鼠中的完全腫瘤排斥。各個生長 曲線W及得自圖6所示實驗的重復實驗的腫瘤測量平均值。將表達3C6.ml巧或細胞因子的 4T1腫瘤細胞如圖6A中所示進行混合。數據得自各個腫瘤測量(A，C)或腫瘤體積的平均值 (B，D)。注意，在重復實驗中，存在一組共4個表現出生長的腫瘤，盡管生長動力學大大降低。
[0019]圖6.hMUCl特異性的小鼠I巧不能在野生型小鼠中介導完全的腫瘤排斥，但掲示出 預防轉移的能力。將表達3C6.hi姐或細胞因子的各組4T1腫瘤細胞如圖6A中所示進行混合， 并注入Ba化/c小鼠中。顯示了各個腫瘤生長曲線(A，B)，和小組的平均值(C，D)。未在化εΚΙ KO/Tg小鼠中生長的第4組腫瘤在野生型小鼠中生長，盡管生長動力學大大降低。注意，第3 組腫瘤(單獨的4Tl/hMUCl和細胞因子)表現出中等生長動力學。Ξ只化eRIKO/Tg轉基因小 鼠包括在該實驗中作為陽性對照，并且所有Ξ只在用第4組腫瘤注射時均未能展示出任何 腫瘤生長(D圖，Π-Π)。第3組腫瘤(僅MUC1和細胞因子）降低的生長動力學可能源于W下 事實:運些小鼠在腫瘤發展過程的早期發生了轉移，并且到第10天時開始體重減輕（圖7)。 具有第4組腫瘤(3C6-mIgE+MUCl+細胞因子）的小鼠未顯示出體重減輕或其他明顯的轉移跡 象，盡管在其兩側具有小的腫瘤。
[0020] 圖7.第3和第4組小鼠中的體重減輕動力學。對用第3和第4組腫瘤注射的野生型小 鼠每5天進行稱重，并計算平均值和標準偏差。注意，到第1