本申請要求2014年8月13日提交的美國臨時專利申請第62/036,675號和2014年8月13日提交的第62/036,839號的優先權，該等臨時專利申請以引用的方式并入本文中。
背景技術：
：：向大腦和中樞神經系統(CNS)中的藥物遞送是困難的，尤其當需要向CNS中的特定細胞進行靶向遞送時較困難。藥物和遞送媒劑必須克服血腦屏障(BBB)，在大腦組織中移動，并且定位在目標細胞中。患有神經疾病(包括帕金森氏病(Parkinson'sdisease)、阿茲海默氏病(Alzheimer'sdisease)、大腦腫瘤和大多數神經遺傳性病癥的患者受到嚴重衰弱癥狀困擾并且缺乏提供治愈性治療的治療選項。已經研發出操控或繞過血腦屏障(BBB)的各種策略[杰恩(Jain),納米醫學(林德)(Nanomedicine(Lond)),2012.7(8):1225-33；沃爾法特(Wohlfart)等人,控釋雜志(JControlRelease),2012.161(2):264-273.]，該血腦屏障是向大腦進行全身性遞送的主要屏障。這些方法包括向CNS局部投藥[帕特爾(Patel)等人,先進藥物遞送評論(AdvancedDrugDeliveryReviews),2012.64(7):701-705]和經由聚焦超聲對BBB進行可逆的破壞馬克特(Marquet)等人公共科學圖書館·綜合(PLoSOne).2011；6(7)；e22598；唐斯(Downs)等人公共科學圖書館·綜合.2015年5月6日；10(5)；e0125911]或化學試劑[克羅爾(Kroll)等人,神經外科(Neurosurgery),1998.42(5)；1083-1099；討論1099-100.]。然而，一旦到達BBB的另一邊，已經廣泛公認見于大腦細胞之間的各向異性并帶靜電的細胞外基質(ECM)是另一個關鍵性屏障(索恩(Thorne)等人美國國家科學院院刊(ProcNatlAcadSciUSA).2006年4月4日；103(14):5567-72；南斯(Nance)等人,科學·轉化醫學(SciTranslMed),2012.4(149)；149ra119；思科瓦(Sykova)等人,生理學評論(PhysiolRev),2008.88(4):1277-1340；查美尼克(Zamecnik),J.,神經病理學學報(ActaNeuropathol),2005.110(5):435-442)。不論投藥方法如何，此‘大腦組織屏障’妨礙大分子和納米粒子在大腦中的廣泛分布，因而限制其在整個神經疾病散播性目標區域中的覆蓋性[沃吉斯(Voges),J等人,神經病學年鑒(AnnNeurol)2003.54(4):479-487；南斯,E.A.等人,科學·轉化醫學,2012.4(149):149ra119；思科瓦等人,生理學評論,2008.88(4):1277-340；馬開(MacKay)等人,大腦研究(BrainRes),2005.1035(2):139-153]。ECM富含透明質酸、硫酸軟骨素、蛋白多糖、連接蛋白和腱生蛋白，并且可以提供針對陽離子聚合載劑滲透的帶負電粘附性屏障[思科瓦等人,生理學評論,2008.88(4):1277-1340；齊默爾曼(Zimmermann)等人,組織化學和細胞生物學(HistochemCellBiol),2008.130(4):635-653]。此外，ECM的孔隙大小對納米粒子在CNS中的移動施加立體屏障，其中非粘附性的114nm，而非200nm粒子能夠穿透在大腦組織內[南斯,E.A.等人,科學·轉化醫學,2012.4(149):第149ra119頁；肯尼(Kenny),G.D.等人,生物材料(Biomaterials),2013.34(36):9190-9200。已經展示，格外良好地涂布有親水性并且不帶電的聚乙二醇(PEG)的小于100nm的納米粒子在大腦ECM中快速擴散，從而允許治療劑的廣泛分布[南斯等人,美國化學學會·納米(ACSNano),2014年10月28日:8(10):10655-64.doi:10.1021/nn504210g,電子版2014年10月8日；南斯,E.A.等人,科學·轉化醫學,2012.4(149):第149ra119頁]。對可以改變或逆轉CNS疾病自然病史的特定遺傳目標的累積知識已經使基因療法成為有吸引力的治療策略[奧馬尼(O'Mahony),A.M.等人,藥學雜志(JPharmSci),2013.102(10):3469-3484；倫茨(Lentz)等人,神經生物學疾病(NeurobiolDis),2012.48(2):179-188.]。多種臨床前和臨床研究旨在使用特定集中于增強轉基因表達在整個大腦組織中的水平和分布的前沿性病毒或非病毒基因載體來改善核酸向CNS中的遞送[奧馬尼等人,藥學雜志,2013.102(10):3469-3484.；珀勒茲-馬丁尼茲(Perez-Martinez)等人,阿茲海默氏病雜志(JAlzheimersDis),2012.31(4):697-710]。盡管相對高效，但病毒基因載體已經受到一個或多個缺點限制，包括低包裝容量，技術上難以放大規模、高生產成本[托馬斯(Thomas)等人,自然·遺傳學評論(NatRevGenet),2003.4(5):346-358.]和突變形成風險[奧爾森(Olsen)和施泰因(Stein),新英格蘭醫學雜志(NEnglJMed),2004.350(21):2167-2179.]。此外，盡管CNS具有免疫特許性質，但使免疫反應中和可能在重復投藥或先前暴露之后發生[倫茨等人,神經生物學疾病,2012.48(2):179-188；肖(Xiao),X.等人,病毒學雜志(JVirol),1996.70(11):8098-8108；徹繆爾(Chirmule),N等人,病毒學雜志,2000.74(5):2420-2425；洛溫斯坦(Lowenstein),P.R.等人,當今基因療法(CurrGeneTher),2007.7(5):第347-60頁；洛溫斯坦,P.R.等人,神經病療法(Neurotherapeutics),2007.4(4):715-724；沃吉斯,J.等人,神經病學年鑒2003.54(4):479-487.]。非病毒基因載體可在沒有許多這些限制的情況下提供有吸引力的用于基因遞送的替代性策略[奧馬尼,A.M.等人,藥學雜志,2013.102(10):3469-3484]。基于陽離子聚合物的基因載體為活體外和活體內的DNA縮合和高效基因轉移提供可定制平臺。其正電荷密度允許穩定壓實帶負電的核酸[孫(Sun),X.和N.張(Zhang),藥物化學小評論(MiniRevMedChem),2010,10(2):108-125；鄧拉普(Dunlap),D.D.等人,核酸研究(NucleicAcidsRes),1997.25(15):3095-3101]并且保護其免受酶促降解影響[庫克斯卡-拉塔洛(Kukowska-Latallo),J.F.等人,人類基因療法(HumGeneTher)2000.11(10):1385-1395.]。另外，可質子化的胺的數目提供緩沖能力增加，其經由“質子海綿效應”促進內體逸出，從而引起高效轉染[阿金克(Akinc),A.等人,基因醫學雜志(JGeneMed),2005.7(5):657-663]。為此目的已經研發出多種陽離子聚合物，提供具有不同物理化學概況和活體內行為的基因載體[明策爾(Mintzer),M.A.和E.E.塞瑪內克(Simanek).化學評論(ChemRev),2009.109(2):259-302；帕塔克(Pathak)等人,生物技術雜志(BiotecholJ),2009.4(11):1559-72.]。然而，非病毒基因載體在到達大腦中的目標細胞處之前仍面臨多種屏障[奧馬尼等人,藥學雜志,2013.102(10):3469-3484]。可以應用對流增強型遞送(Conventionenhanceddelivery；CED)以通過在顱內投藥期間提供壓力梯度來進一步增強治療劑分布[阿拉德(Allard)等人,生物材料,2009.30(12):2302-2318.]。然而，如果粒子由于粘附性相互作用和/或立體阻塞而保持截留在大腦實質中，那么CED不太可能提供顯著益處。粒子允許在大腦實質中不受阻礙的擴散的物理化學特性對于在CED后實現粒子滲透增強來說仍是關鍵的[阿拉德等人,生物材料,2009.30(12):2302-18；肯尼等人,生物材料,2013.34(36):9190-9200]。即使在CED后，帶正電粒子與帶負電ECM之間的相互作用仍將陽離子納米粒子限制于注射點和血管周空間中，并且限制其向大腦實質中的滲透[馬開等人,大腦研究,2005.1035(2):139-153；肯尼等人,生物材料,2013.34(36):9190-9200；萊特(Writer)等人,控釋雜志,2012.162(2)；第340-8頁.]。除克服血腦屏障和在大腦實質中擴散以外，關鍵挑戰是靶向疾病過程中所涉及的特定細胞，如大腦中免疫過程中所涉及的微神經膠質細胞和星形膠質細胞。這在若干神經發炎性、神經發育性和神經退化性病癥中變得尤其關鍵，在該等病癥中擴散神經炎癥是關鍵因素并且可能涉及CNS中的若干區[卡納安(Kannan)S等人,科學·轉化醫學,2012,18:4(130:130fs8)]。總之，因為BBB、大腦微環境和神經炎癥的擴散性質，向大腦的藥物和基因遞送較困難。因此，許多神經病癥，尤其神經發育性病癥因此具有有限的治療選項和有限的技術發展。瑞特氏癥候群(Rettsyndrome；RTT)是造成衰弱的神經發育性病癥的一個實例。RTT通過在最初表現正常的兒童中減緩發育，接著導致功能突然退化來影響女孩。這些兒童具有手部有意運動喪失、手部絞擰增加、呼吸困難、大腦生長減少、無法行走/爬行、無法說話、智力殘疾和癲癇。患有RTT的患者展現見于自閉癥中的若干特征，并且可以被視為自閉癥的嚴重形式。大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥的兒童中的癥狀致病機制和惡化中起關鍵作用。不存在可治愈這些病癥的方法。在RTT中，不知道是血腦屏障還是大腦微環境是治療的主要屏障，或這兩者的組合(如大多數神經疾病的情況)是主要屏障。目前療法包括抗癲癇藥劑和運動性殘疾的職業療法。減輕炎癥的靶向療法可以對瑞特氏病癥和自閉癥譜系障礙(autismspectrumdisorder)具有影響。如果全身性投與的抑制神經炎癥中所涉及細胞的療法可以到達大腦處，那么其可以對改善有效性、減少副作用和成本具有顯著影響。因此，本發明的一個目標是提供改善的遞送，如特異性靶向受傷細胞并且同時在大腦和CNS中靶向這些細胞的多個路徑。本發明的另一個目標是提供治療大腦和中樞神經系統的神經、神經發育性和神經退化性病癥，尤其自閉癥和RTT的手段。技術實現要素：可以全身性投與包括遞送治療劑、預防劑和/或診斷劑的樹枝狀聚合物的醫藥組合物以到達大腦和中樞神經系統中的目標細胞處。在一個優選實施例中，樹枝狀聚合物組合物用于治療大腦和CNS的神經、神經發育性和神經退化性病癥，包括自閉癥譜系障礙和RTT。如使用RTT小鼠模型所展現的；當與未經治療或游離藥物治療相比較時，抗炎劑與樹枝狀聚合物的結合引起運動性、步態、腳爪絞擰、腳爪緊握、震顫和呼吸模式的改善。當與未經治療的動物相比較時，樹枝狀聚合物結合物在改善死亡率和運動/行為功能中比單獨的藥物顯著更好。具有本文所描述的表面特質的樹枝狀聚合物克服目前與‘大腦組織屏障’相關的許多挑戰。在優選實施例中，樹枝狀聚合物呈樹枝狀聚合物納米粒子形式，該等樹枝狀聚合物納米粒子包含共價連接于至少一種治療劑、預防劑或診斷劑的羥基封端聚(酰胺基胺)(PAMAM)樹枝狀聚合物。在用于治療RTT或自閉癥譜系障礙的特別優選的實施例中，樹枝狀聚合物納米粒子包括以在個體中有效治療瑞特氏癥候群或自閉癥譜系障礙的一種或多種癥狀的量存在的共價連接于生物活性劑的一種或多種羥基封端的乙二胺核心PAMAM4-10級(≥G4-OH)樹枝狀聚合物。也可以使用相同組合物來治療興奮性毒性病癥。結果展現，與4級樹枝狀聚合物相比，使用6級樹枝狀聚合物觀察到進入受損或患病大腦的吸收顯著增強。如實例中所描述，展示6級樹枝狀聚合物在大腦損傷的大型動物模型中具有非常可取的腦脊髓液(CSF)比血清水平，指示這些組合物對于將CNS藥物選擇性地遞送到受傷大腦中較優越。臨床相關的大型動物模型(在許多方面中類似于人類)中的陽性結果強調該等發現的重要性。這提供用于診斷以及治療的手段。樹枝狀聚合物的另一個益處是，可以使用相同樹枝狀聚合物來遞送兩種或更多種不同藥劑。這可以是兩種不同治療劑，或一種治療劑與一種或多種診斷劑或預防劑的組合。附圖說明圖1A是在MeCP2剔除小鼠中進行NAC和D-NAC療法后的卡普蘭-邁耶存活率曲線(Kaplan-Meiersurvivalcurve)。在每周兩次NAC或D-NAC療法后對MeCP2剔除幼鼠評定存活率。與未治療的動物(PBS)相比較，D-NAC不改善存活率。D-NAC改善NAC的安全性。與NAC治療的幼鼠相比較，D-NAC和PBS治療的MeCP2剔除幼鼠具有顯著更好的50％存活率(p＝0.014)，指示NAC在以游離調配物形式給予時的潛在毒性。圖1B是在MeCP2剔除小鼠中進行D-NAC療法后的神經行為結果線圖。在3周齡時(PND21)開始用生理鹽水(PBS)、10mgkgNAC或10mgkg(以NAC計)D-NAC治療MeCP2剔除小鼠。每周兩次對幼鼠進行治療。在PND10和PND1時進行行為測試以確定基線，并且在PND21時開始在每一治療日治療之前進行行為測試。使用同窩匹配的T幼鼠作為體重和行為對照兩者。與NAC和PBS治療相比較，D-NAC療法顯著地改善行為結果。與未治療的幼鼠相比較，D-NAC改善MeCP2剔除小鼠的整體外觀。未治療的幼鼠消瘦，具有多個緊握的腳爪、駝背體態和不良的眼睛條件。圖2A-2F是促炎性和抗炎性mRNA表達水平在T小鼠(空心條形)和MeCP2剔除小鼠(陰影條形)中的表達的圖。圖2A，TNF-α圖2B，IL-6圖2C，IL-Iβ圖2D，TGF-β圖2E，IL-10和圖2F，IL-4。圖3A-C是在T小鼠和有癥狀前與有癥狀的MeCP2剔除小鼠的大腦中的發炎性概況圖。在1、2、3、5和數周齡時，在T幼鼠(空心)和MeCP2剔除幼鼠(陰影)的大腦中測量促炎性和抗炎性細胞激素的mRNA水平。呈現中值2ΔΔCT值，并且誤差條由四分位范圍上限和下限表示。(圖3A)發炎性概況隨時間的變化呈現為復合促炎性評分(包括TNFα、I-6和I-1β)與復合抗炎性評分(包括TGF-β、I-10和I-4)的比率。復合評分通過在既定基因分型中取得每一壽命的所有幼鼠在該壽命時的所有促炎性2ΔΔCT值或所有抗炎性2ΔΔCT值的中值來產生。(圖3B)MeCP2剔除小鼠的促炎性概況傾向于促炎性標記物在2周和數周時增加。然而，在2周、5周和數周齡時，與周齡和同窩匹配的T小鼠相比較，抗炎性mRNA表達(圖3C)在MeCP2剔除小鼠中展示顯著減少。這表明，MeCP2剔除小鼠中的神經發炎性過程由抗炎性表達的顯著減少來驅動，而非由促炎性表達增加的傾向來驅動。圖4是大腦中D-Cy5的量(μg/g)隨大腦損傷嚴重性(基于復合行為評分)而變化的圖。對吸收與損傷嚴重性的相關性的此展現提供診斷損傷程度的手段。圖5是大腦脊髓液中D-Cy5的濃度/血清中D-Cy5的濃度隨時間(以小時為單位)變化的圖。圖6是海馬區、皮質和小腦中樹枝狀聚合物積聚(μg/g)的圖。圖7是各種器官和大腦中樹枝狀聚合物積聚(μg/g)的圖。具體實施方式I.定義術語“治療劑”是指可以投與以預防或治療疾病或病癥的一種或多種癥狀的藥劑。實例包括(但不限于)核酸、核酸類似物、小分子、肽模擬物、蛋白質、肽、碳水化合物或糖、脂質、或界面活性劑，或其組合。術語“治療”是指預防或減輕疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀。治療疾病或病狀包括減輕特定疾病或病狀的至少一種癥狀，即使潛在病理生理學不受影響；如通過投與鎮痛劑來治療個體疼痛，盡管此類藥劑不治療該疼痛的原因。短語“藥學上可接受”是指組合物、聚合物以及其它材料和/或劑型在合理醫學判斷的范圍內，適合用于與人類和動物的組織接觸而不產生過量毒性、刺激、過敏反應或其它問題或并發癥，與合理的益處/風險比相稱。短語“藥學上可接受的載劑”是指涉及將任何主題組合物從一個器官或身體部分運載或轉運到另一個器官或身體部分的藥學上可接受的材料、組合物或媒劑，如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。每一載劑在與主題組合物的其它成分相容并且對患者無害的意義上必須是“可接受的”。短語“治療有效量”是指以可適用于任何藥物治療的合理益處/風險比產生某種所需效果的治療劑的量。有效量可以取決于如以下的因素而變化：所治療的疾病或病狀、所投與的特定靶向構筑體、個體的身材或疾病或病狀的嚴重性。所屬領域的一般技術人員可以在不必需進行過度實驗的情況下憑經驗確定特定化合物的有效量。II.調配物A.樹枝狀聚合物如本文所用的術語“樹枝狀聚合物”包括(但不限于)以下分子架構，其具有內部核心、規則地附接到此引發劑核心上的重復單元內部層(或“級”)、以及附接到最外級上的端基外表面。樹枝狀聚合物的實例包括(但不限于)PAMAM、聚酯、聚賴氨酸和PPI。PAMAM樹枝狀聚合物可以具有羧酸、胺和羥基終端，并且可以是任何級的樹枝狀聚合物，包括(但不限于)1級PAMAM樹枝狀聚合物、2級PAMAM樹枝狀聚合物、3級PAMAM樹枝狀聚合物、4級PAMAM樹枝狀聚合物、5級PAMAM樹枝狀聚合物、6級PAMAM樹枝狀聚合物、7級PAMAM樹枝狀聚合物、8級PAMAM樹枝狀聚合物、9級PAMAM樹枝狀聚合物或10級PAMAM樹枝狀聚合物。適合一起使用的樹枝狀聚合物包括(但不限于)聚酰胺基胺(PAMAM)、聚丙胺(POPAM)、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚酯、蝶烯(iptycene)、脂肪族聚(醚)和/或芳香族聚醚樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物復合物的每一樹枝狀聚合物都可以具有與其它樹枝狀聚合物類似或不同的化學性質(例如，第一樹枝狀聚合物可以包括PAMAM樹枝狀聚合物，而第二樹枝狀聚合物可以包含POPAM樹枝狀聚合物)。在一些實施例中，第一或第二樹枝狀聚合物可以進一步包括其它藥劑。多臂PEG聚合物包括具有至少兩個帶有硫氫基或硫吡啶端基的分支的聚乙二醇；然而，本文所公開的實施例不限于此類別，并且可以使用帶有其它端基(如琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端)的PEG聚合物。可以使用分子量10kDa到80kDa的PEG聚合物。樹枝狀聚合物復合物包括多個樹枝狀聚合物。舉例來說，樹枝狀聚合物復合物可以包括第三樹枝狀聚合物；其中該第三樹枝狀聚合物與至少一種其它樹枝狀聚合物復合。此外，第三藥劑可以與第三樹枝狀聚合物復合。在另一個實施例中，第一和第二樹枝狀聚合物各自與第三樹枝狀聚合物復合，其中該第一和第二樹枝狀聚合物是PAMAM樹枝狀聚合物，并且該第三樹枝狀聚合物是POPAM樹枝狀聚合物。可以在不脫離本發明精神的情況下并入其它樹枝狀聚合物。當利用多個樹枝狀聚合物時，也可以并入多個藥劑。這不受彼此復合的樹枝狀聚合物的數目限制。如本文所用，術語“PAMAM樹枝狀聚合物”意味著使用酰胺基胺建構嵌段的聚(酰胺基胺)樹枝狀聚合物，其可以含有不同核心。用于制造其的方法是所屬領域的技術人員已知的，并且一般來說，涉及圍繞中央引發劑核心產生樹枝狀β-丙胺酸單元的同心殼層(級)的兩步反復(iterative)反應程序。此PAMAM核-殼架構隨殼層(級)增加而在直徑中線性生長。同時，表面基團在每一級根據樹枝狀分支數學以指數方式擴增。其可以具有5種不同核心類型和10種表面官能團的G0-10級形式獲得。樹枝狀聚合物分支聚合物可以由聚酰胺基胺(PAMAM)、聚甘油、聚酯、聚醚、聚賴氨酸或聚乙二醇(PEG)、多肽樹枝狀聚合物組成。根據一些實施例，所用PAMAM樹枝狀聚合物可以是羥基附接到其表面官能團上的4級或更高級樹枝狀聚合物。多臂PEG聚合物包含具有2個和更多個帶有硫氫基或硫吡啶端基的分支的聚乙二醇；然而，實施例不限于此類別，并且可以使用帶有其它端基(如琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端)的PEG聚合物。可以使用分子量10kDa到80kDa的PEG聚合物。在一些實施例中，樹枝狀聚合物呈納米粒子形式，并且詳細地描述于國際專利公開第W02009/046446號中。制備PAMAM-NAC下文是用于使N-乙酰基半胱氨酸結合到胺封端的第四級PAMAM樹枝狀聚合物(PAMAM-NH2)上的合成方案，其使用3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)作為連接子來進行。3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)的合成通過兩步程序來進行，方案1。首先，使3-巰基丙酸與2,2'-聯吡啶二硫化物通過硫醇-二硫化物交換反應以得到2-羧基乙基2-吡啶基二硫化物。為了促進胺封端的樹枝狀聚合物與SPDP的連接，使琥珀酰亞胺基團與2-羧基乙基2-吡啶基二硫化物反應以獲得3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯，該反應通過使用N,N'-二環己基碳二亞胺和4-二甲基氨基吡啶來與N-羥基琥珀酰亞胺進行酯化來進行。方案1為了引入硫氫基反應性基團，使PAMAM-NH2樹枝狀聚合物與異雙官能性交聯劑SPDP反應，方案2。SPDP的N-琥珀酰亞胺基活化酯與終端伯胺偶合以產生酰胺連接的2-吡啶基二硫基丙酰基(PDP)，方案2。在與SPDP反應之后，可以使用RP-HPLC來分析PAMAM-NH-PDP以確定SPDP與樹枝狀聚合物已經反應的程度。方案2在另一個實施例中，可以使用在下文方案4中所描述的合成途徑，以便合成D-NAC直到經過吡啶基二硫基(PDP)官能化的樹枝狀聚合物3。接著在室溫下使化合物3與NAC在DMSO中反應過夜以獲得D-NAC5。制備樹枝狀聚合物-PEG-丙戊酸結合物(D-VPA)最初，用硫醇反應性基團對丙戊酸進行官能化。如方案3中所示，使用DCC作為偶合試劑使具有三個(CH2)2O-重復單元的短鏈PEG-SH與丙戊酸。反應所獲得的粗PEG-VPA通過柱色譜來純化，并且通過質子NMR來表征。在NMR光譜中，存在鄰近PEGOH基團的CH2質子峰從3.65ppm下移到4.25ppm，確認PEG-VPA的形成。盡管硫醇基也可能易于與酸官能團反應，但NMR光譜并不指示屬于與PEG硫醇基相鄰的CH2質子峰的任何下移。這表明硫醇基任意與具有硫醇反應性的經過官能化的樹枝狀聚合物反應。方案3為了使PEG-VPA與PAMAM-OH結合，在樹枝狀聚合物與丙戊酸之間引入二硫鍵，方案4。首先，通過使樹枝狀聚合物與受芴基甲氧羰基(Fmoc)保護的γ-氨基丁酸(GABA)反應來將樹枝狀聚合物轉化成雙功能樹枝狀聚合物1。PEG-VPA與雙功能樹枝狀聚合物的結合涉及兩步法；第一步驟是使經過胺官能化的雙功能樹枝狀聚合物1與3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)反應，并且第二步驟涉及使經過硫醇官能化的丙戊酸結合。使SPDP在N,N'-二異丙基乙胺(DIEA)存在下與中間物2反應以獲得經過吡啶基二硫基(PDP)官能化的樹枝狀聚合物3。方案4盡管這是原位反應過程，但通過1HNMR來確立結構。在光譜中，介于6.7與7.6ppm之間的吡啶基芳香族質子的新峰確認形成產物。證實吡啶基的數目與GABA連接子的數目相同，其指示大多數胺基與SPDP反應。因為這是使藥物與樹枝狀聚合物結合的關鍵步驟，所以每胺基使用的SPDP摩爾當量和反應所需的時間得到驗證。最后，使PEG-VPA與經過PDP官能化原位反應以得到樹枝狀聚合物-PEG-丙戊酸(D-VPA)。通過1HNMR來確認最終結合物的形成和VPA的負載量，并且通過逆相HPLC來評估結合物的純度。在NMR光譜中，介于0.85與1.67ppm之間的VPA脂肪族質子的多重峰、介于3.53與3.66ppm之間的PEGCH2質子的多重峰和吡啶基芳香族質子的不存在確認結合物形成。使用質子積分法來估計，VPA的負載量是約21個分子，其表明1～2個胺基保留未反應。在HPLC圖中，D-VPA的洗脫時間(17.2分鐘)與G4-OH的洗脫時間(9.5分鐘)不同，確認結合物是純的，不具有可測量的痕量VPA(23.4分鐘)和PEG-VPA(39.2分鐘)。VPA負載量與樹枝狀聚合物的百分比是～12％w/w，并且驗證用于分三個不同批次制造公克級量的方法。B.偶聯劑和間隔子樹枝狀聚合物復合物可以由結合或附接到樹枝狀聚合物或多臂PEG上的治療活性劑或化合物(在下文中稱為“藥劑”)形成。附接可以經由在藥劑與樹枝狀聚合物之間提供二硫橋鍵的適當間隔子進行。在身體中所見的還原條件下，樹枝狀聚合物復合物能夠通過硫醇交換反應來活體內快速釋放藥劑。如本文所用的術語“間隔子”打算包括用于將治療活性劑連接于樹枝狀聚合物的組合物。間隔子可以是單一化學實體或連接在一起以將聚合物與治療劑或成像劑橋連的兩種或更多種化學實體。間隔子可以包括具有硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯基砜和碳酸酯終端的任何較小化學實體、肽或聚合物。間隔子可以選自用硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯基砜和碳酸酯基團封端的一類化合物。間隔子可以包含硫吡啶封端的化合物，如二硫聯吡啶、3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、6-(3-[2-吡啶基二硫基]-丙酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯LC-SPDP或磺基-LC-SPDP。間隔子也可以包括肽，其中該等肽是主要具有硫氫基的直鏈或環狀肽，如谷胱甘肽、高半胱氨酸、半胱氨酸和其衍生物，arg-gly-asp-cys(RGDC)、環(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Cys)(c(RGDfC))、環(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)、環(Arg-Ala-Asp-d-Tyr-Cys)。間隔子可以是巰基酸衍生物，如3巰基丙酸、巰基乙酸、4巰基丁酸、硫雜環戊-2-酮、6巰基己酸、5巰基戊酸以及其它巰基衍生物，如2巰基乙醇和2巰基乙胺。間隔子可以是硫代水楊酸和其衍生物，(4-琥珀酰亞胺基氧羰基-甲基-α-2-吡啶基硫基)甲苯，(3-[2-吡啶二硫基]丙酰基酰肼。間隔子可以具有馬來酰亞胺終端，其中該間隔子包含聚合物或較小化學實體，如雙-馬來酰亞胺基二乙二醇和雙-馬來酰亞胺基三乙二醇、雙-馬來酰亞胺基乙烷、雙馬來酰亞胺基己烷。間隔子可以包含乙烯基砜，如1,6-己烷-雙-乙烯基砜。間隔子可以包含硫代糖苷，如硫代葡萄糖。間隔子可以是經過還原的蛋白質，如牛血清白蛋白和人類血清白蛋白、能夠形成二硫鍵的任何硫醇封端的化合物。間隔子可以包括具有馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基和硫醇終端的聚乙二醇。C.治療劑、預防劑和診斷劑如本文所用的術語“樹枝狀聚合物復合物”是指樹枝狀聚合物與治療、預防和/或診斷活性劑的組合。樹枝狀聚合物還可以包括靶向劑，但如由實例所展現，這些靶向劑對于向受傷大腦遞送是并必要的。這些樹枝狀聚合物復合物包括附接或結合于PAMAM樹枝狀聚合物或多臂PEG的藥劑，其能夠在活體內所見的還原條件下優先在細胞內釋放藥物。樹枝狀聚合物復合物在通過靜脈內注射投與時可以僅在患病條件下并且不在正常條件下優先通過血腦屏障(BBB)。樹枝狀聚合物復合物還適用于治療劑在神經炎癥、大腦性麻痹、ALS和由對組織的炎癥和損傷表征的其它CNS疾病中的靶向遞送。藥劑可以共價附接或分子內分散或囊封。樹枝狀聚合物優選地是具有羧酸、羥基或胺終端的至多10級的PAMAM樹枝狀聚合物。PEG聚合物是具有2個或更多個臂并且分子量為10kDa到80kDa的星形聚合物。PEG聚合物具有硫氫基、硫吡啶、琥珀酰亞胺基或馬來酰亞胺終端。樹枝狀聚合物經由末端為二硫鍵、酯鍵或酰胺鍵的間隔子而連接于藥劑。代表性治療劑(包括前藥)、預防劑或診斷劑可以是肽、蛋白質、碳水化合物、核苷酸或寡核苷酸、小分子或其組合。示例性治療劑包括抗炎性藥物、抗增生劑、化學治療劑、血管擴張劑和抗感染劑。抗生素包括β-內酰胺，如青霉素(penicillin)和安比西林(ampicillin)；頭胞菌素，如頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢力新(cephalexin)、頭孢羥氨芐(cephydroxil)、頭孢泊肟(cepfodoxime)和普塞酯(proxetil)；四環素抗生素，如多西環素(doxycycline)和二甲胺四環素(minocycline)；大環內酯(microlide)抗生素，如阿奇霉素(azithromycin)、紅霉素(erythromycin)、雷帕霉素(rapamycin)和克拉霉素(clarithromycin)；氟喹諾酮(fluoroquinolone)，如環丙沙星(ciprofloxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)和諾氟沙星(norfloxacin)；托普霉素(tobramycin)；黏菌素(colistin)或氨曲南(aztreonam)，以及已知具有抗炎活性的抗生素，如紅霉素、阿奇霉素或克拉霉素。優選的抗炎劑是包括N-乙酰基半胱氨酸的抗氧化性藥物。優選的NSAIDS包括甲芬那酸(mefenamicacid)、阿司匹林(aspirin)、二氟尼柳雙水楊酸酯(DiflunisalSalsalate)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、酮洛芬(Ketoprofen)、脫乙酰基酮洛芬(Deacketoprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)、噁丙嗪(Oxaprozin)、洛索洛芬(Loxoprofen)、吲哚美辛(Indomethacin)、舒林酸(Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、酮洛酸雙氯芬酸(KetorolacDiclofenac)、萘丁美酮(Nabumetone)、吡羅昔康(Piroxicam)、美洛昔康(Meloxicam)、替諾昔康(Tenoxicam)、屈噁昔康(Droxicam)、氯諾昔康(Lornoxicam)、伊索昔康(Isoxicam)、甲氯芬那酸(Meclofenamicacid)、氟芬那酸(Flufenamicacid)、托芬那酸(Tolfenamicacid)、伊萊考昔(elecoxib)、羅非考昔(Rofecoxib)、伐地考昔(Valdecoxib)、帕瑞考昔(Parecoxib)、魯米考昔(Lumiracoxib)、依托考昔(Etoricoxib)、非羅考昔(Firocoxib)、磺苯胺(Sulphonanilides)、尼美舒利(Nimesulids)、氟尼酸(Niflumicacid)和利克飛龍(Licofelone)。代表性小分子包括類固醇，如甲基潑尼松(methylprednisone)、地塞米松(dexamethasone)；非類固醇抗炎劑，包括COX-2抑制劑；皮質類固醇抗炎劑；金化合物抗炎劑；免疫抑制、抗炎和抗血管生成劑；抗興奮性毒性劑，如丙戊酸、D-氨基膦酰基戊酸酯、D-氨基膦酰基庚酸酯；谷氨酸酯形成/釋放的抑制劑，巴氯芬；NMDA受體拮抗劑；水楊酸酯抗炎劑；蘭比珠單抗(ranibizumab)；抗VEGF劑，包括阿柏西普(aflibercept)和雷帕霉素。其它抗炎性藥物包括非類固醇藥物，如吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林、乙酰胺苯酚、雙氯芬酸鈉(diclofenacsodium)和布洛芬。皮質類固醇可以是氟新諾龍丙酮(fluocinoloneacetonide)和甲基潑尼龍(methylprednisolone)。肽藥物可以是鏈激酶。在一些實施例中，分子可以包括抗體，包括例如達利珠單抗(daclizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)蘭比珠單抗(ranibizumab)巴利昔單抗(basiliximab)、蘭比珠單抗和哌加他尼鈉(pegaptanibsodium)；或肽，如SN50；和NF拮抗劑。代表性寡核苷酸包括siRNA、微RNA、DNA和RNA。治療劑可以是具有羥基封端胺的PAMAM樹枝狀聚合物。示例性診斷劑包括順磁分子、熒光化合物、磁性分子和放射性核素、x射線顯影劑和造影劑。這些也可以是由前述診斷劑標記的配體或抗體，或結合于可通過所屬領域的技術人員已知的方法檢測的經過標記的配體或抗體。示例性診斷劑包括染料、熒光染料、近紅外染料、SPECT顯影劑、PET顯影劑和放射性同位素。代表性染料包括羰花青、吲哚羰花青、氧雜羰花青、硫雜羰花青和部花青、聚甲炔、香豆素、若丹明、二苯并哌喃、熒光素、硼-聯吡咯甲烷(BODIPY)、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、DyLight647、HiLyteFluor647、HiLyteFluor680、HiLyteFluor750、IRDye800CW、IRDye800RS、IRDye700DX、ADS780WS、ADS830WS和ADS832WS。代表性SPEGT或PET顯影劑包括螯合劑，如二-亞乙基三-胺五-乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四-氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二-胺二硫醇、活化的巰基乙酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(MAG3)和酰肼煙酰胺(HYNIC)。代表性同位素包括Tc-94m、Tc-99m、In-111、Ga-67、Ga-68、Gd3+、Y-86、Y-90、Lu-177、Re-186、Re-188、Cu-64、Cu-67、Co-55、Co-57、F-18、Sc-47、Ac-225、Bi-213、Bi-212、Pb-212、Sm-153、Ho-166和Dy-i66。靶向部分包括葉酸、直鏈或環狀的RGD肽、TAT肽、LHRH和BH3。在用于治療RTT和自閉癥譜系障礙的一個實施例中，樹枝狀聚合物納米粒子由共價連接于至少一種生物活性劑的羥基封端的PAMAM樹枝狀聚合物形成，該生物活性劑的量在個體中有效治療瑞特氏癥候群和自閉癥譜系障礙。連接于生物活性化合物或治療活性劑的樹枝狀聚合物復合物可以用于進行若干功能，包括靶向、在患病位點處定位、釋放藥物和成像目的。可以在存在或不存在靶向部分的情況下標記樹枝狀聚合物復合物，以使得在樹枝狀聚合物與藥劑或成像劑之間的二硫鍵經由間隔子或連接分子形成。D.裝置和調配物樹枝狀聚合物可以通過硬膜下、靜脈內、羊膜內、腹膜內或皮下途徑非經腸地投與。本文所用的載劑或稀釋劑可以是固體載劑或用于固體調配物的稀釋劑、液體載劑或用于液體調配物的稀釋劑、或其混合物。對于液體調配物，藥學上可接受的載劑可以是例如水性或非水性溶液、懸浮液、乳液或油。非經腸媒劑(用于皮下、靜脈內、動脈內或肌肉內注射)包括例如氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏溶液和不揮發性油。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有機酯(如油酸乙酯)。水性載劑包括例如水、醇/水溶液、環糊精、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩沖介質。樹枝狀聚合物也可以在乳液，例如油包水中投與。油的實例是石油、動物、植物或合成來源的那些油，例如花生油、大豆油、礦物油、橄欖油、葵花油、魚肝油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄欖、石蠟脂和礦物油。適合用于非經腸調配物中的脂肪酸包括例如油酸、硬脂酸和異硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸異丙酯是合適的脂肪酸酯的實例。適合于非經腸投藥的調配物可以包括抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、和使得調配物與預期接受者的血液等張的溶質、以及可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸浮液。靜脈內媒劑可以包括流體和營養補充劑、電解質補充劑，如基于林格氏右旋糖的那些媒劑。一般來說，水、生理鹽水、右旋糖和相關糖水溶液以及如丙二醇或聚乙二醇的二醇是優選的液體載劑，尤其對于可注射溶液來說。所屬領域的一般技術人員熟知用于可注射組合物的可注射醫藥載劑(參見例如制藥學和藥學實踐(PharmaceuticsandPharmacyPractice),J.B.利平科特公司(LippincottCompany),費城(Philadelphia),賓夕法尼亞州(PA),班克(Banker)和查默斯(Chalmers)編,第238-250頁(1982)；和可注射藥物的ASHP手冊(ASHPHandbookonInjectableDrugs),托塞爾(Toissel),第15版,第622-630頁(2009))。用于對流增強型遞送(“CED”)的調配物包括低分子量鹽和如甘露糖醇的糖的溶液。III.治療方法A.向大腦和CNS中的遞送連接于治療劑、預防劑或診斷劑的樹枝狀聚合物復合物組合物(包括優選為至少四級樹枝狀聚合物并且更優選為至少六級樹枝狀聚合物的樹枝狀聚合物)可以選擇性地靶向微神經膠質細胞和星形膠質細胞，其在若干神經變性病(包括大腦性麻痹)的致病機制中起關鍵作用。通過靶向這些細胞，樹枝狀聚合物特異性地遞送藥劑以治療神經炎癥。已經充分探究和研究N-乙酰基半胱氨酸(N-acetylcysteine；“NAC”)。還探究與母體胎兒感染相關的神經炎癥。然而，NAC由于高血漿蛋白結合而幾乎沒有生物可用性。樹枝狀聚合物復合物組合物克服血漿蛋白結合而不影響NAC的活性。通過單一靜脈內投藥，G4PAMAM-NAC的活體內有效性可以是游離藥物NAC的十到一百倍。游離藥物NAC展現極高血漿蛋白結合，導致生物可用性降低。此樹枝狀聚合物復合物的主要優點之一是，其通過限制不合需要的藥物血漿蛋白質相互作用來增強生物可用性，并且選擇性地引起藥物在細胞內的快速釋放以展現所需治療作用。藥物NAC在G4PAMAM-NAC中的高有效負載需要極小量(～50mg/kg)的載劑，PAMAM樹枝狀聚合物和較小量的藥物(～10mg/kg)，因而減少投與量。相比之下，在動物模型中通常以100-300mg/kg日劑量使用游離NAC。藥劑量的減少限制與該藥劑相關聯的副作用。因為藥劑的生物可用性保持較高，所以盡管投與較小量的藥劑，但該藥劑的正面效果未降低。包括樹枝狀聚合物-藥物結合物的樹枝狀聚合物復合物限制其向組織和器官中的生物分布，并且優先在目標位點處遞送藥物，因而減少非所要副作用。樹枝狀聚合物復合物有效跨BBB轉運，并且因此適用于在神經、神經發育性和神經退化性病癥以及大腦損傷中進行靶向藥物遞送。G4-PAMAM-S-S-NAC結合物在神經發炎性病癥中特異性地靶向活化的微神經膠質細胞和星形膠質細胞。在用脂多糖(LPS)進行動物治療兩天以在發育中的兔大腦中誘導白質損傷和髓鞘形成不良(大腦性麻痹的動物模型)之后，評估G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物結合物的治療效果。選擇性地由G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復合物遞送的NAC強有力地遏制促炎性(TNF-α、IL-6mRNA)；發炎性信號傳導因子，包括NF.κ.B和硝基酪氨酸，并且增強GSH水平。與游離NAC相比較，發現G4-PAMAM-S-S-NAC的有效性是十到一百倍。這支持以下結論：G4-PAMAM-S-S-NAC橫穿跨越BBB。NAC從樹枝狀聚合物復合物向活化微神經膠質細胞中的靶向遞送在大腦性麻痹的新生兔模型中改善運動缺陷和從LPS誘導的大腦損傷的恢復減弱。在投與G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復合物后，觀察到促炎性細胞激素(TNF-α、IL-6mRNA)的顯著減少。當與用生理鹽水治療的套組相比較時，用NAC和G4-PAMAM-S-S-NAC治療的套組展示胎兒炎癥反應減少以及運動缺陷改善。當與由于持續由G4-PAMAM-S-S-NAC結合物遞送NAC而單獨接受NAC的套組相比較時，用G4-PAMAM-S-S-NAC結合物治療的套組的行為變化較小并且大腦中的微神經膠質細胞活化較低。結果指示G4-PAMAM-S-S-NAC結合物的效果比單獨NAC更大，這是因為其優先由活化巨噬細胞和微神經膠質細胞吸收，降低發炎性和氧化性和亞硝基化效果。用G4-PAMAM-S-S-NAC樹枝狀聚合物復合物治療減少白質損傷和微神經膠質細胞活化。當以G4-PAMAM-S-S-NAC形式投與以引起與對游離NAC所觀察到的類似的反應時，觀察到NAC劑量顯著減少。濃度100mg/kg的游離NAC和濃度10mg/kg的G4-PAMAM-S-S-NAC10mg都引起相同反應，展現在結合于樹枝狀聚合物后，實現劑量減少。較低濃度的G4-PAMAM-S-S-NAC展示比游離NAC顯著的針對LPS誘導的大腦損傷、TNF-α抑制和IL-6活性下調的保護效果。樹枝狀聚合物-NAC結合物的此活性可以歸因于其干擾早期炎性反應的能力，該干擾通過阻斷或修改信號轉導因子NF.κ.B和硝基酪氨酸，因而調節細胞活化來進行。TNF-α和IL-6在海馬區中的下調很可能歸因于在大腦中具有微神經膠質細胞特異性細胞吸收的樹枝狀聚合物復合物的優先生物分布。樹枝狀聚合物-NAC復合物可以用于治療發展出與母體感染相關聯的臨床癥狀并且在嬰兒中發展出PVL和CP的風險增加的孕婦。結果展示，用樹枝狀聚合物-NAC抑制微神經膠質細胞、星形膠質細胞在新生兔大腦中減少白質損傷。此外，樹枝狀聚合物展現結合藥物的持續釋放，并且在長時段內增強藥物的有效性。在較低劑量下，樹枝狀聚合物-NAC結合物比單獨NAC更有效。樹枝狀聚合物-NAC結合物似乎提供更多優點，包括顯著劑量減少、增強的生物可用性和給藥減少。6和8臂PEG-NAC結合物在2小時內以細胞內GSH濃度(2和10mM)釋放74％的NAC。在介于0.008-0.8mM之間的濃度范圍內，結合物對微神經膠質細胞無毒性。在等摩爾濃度的NAC(0.5mM)下，6臂PEG-S-S-NAC和8臂PEG-S-S-NAC在抑制GSH消耗中比游離NAC更高效。當與等摩爾濃度的游離NAC相比較時，各自為0.5mM和5Mm濃度的6臂和8臂PEG-S-S-NAC結合物都展示在ROS生產中的顯著抑制。研究展現，與游離NAC相比，結合物在抑制NO產生中較優越。在最高濃度(5mM)下，游離藥物使H2O2水平和亞硝酸酯水平降低30％-40％，而結合物使H2O2和亞硝酸酯水平降低超過70％。這展示結合物能夠將藥物運到細胞內側，并且釋放游離形式的藥物，并且比游離藥物顯著地更有效。在5mM濃度下，當與等濃度的NAC(Pb0.05)相比較時，6臂PEG-S-S-NAC結合物(1)展示TNF-α產生的顯著抑制(70％)。在5mM下，當與等濃度的NAC(Pb0.05和Pb0.01)相比較時，8臂PEG-S-S-NAC結合物(3)展示TNF-α產生的顯著抑制(70％)。PEG化NAC是具有醫藥工業效用的樹枝狀聚合物復合物，因為批準PEG用于人類使用并且此裝置解決NAC的限制并提供更大功效。如在實例中所展現，六級樹枝狀聚合物提供甚至更大的遞送，尤其向受損大腦組織中的遞送。相應地調節用四級樹枝狀聚合物所測定的劑量以補償增加的遞送。所屬領域的技術人員能夠在不進行不當實驗的情況下確定相對劑量。通常，主治醫生將在考慮到多種因素，如年齡、體重、一般健康狀況、飲食、性別、待投與的化合物、投藥途徑和所治療病狀的嚴重性的情況下決定用于治療每一個別個體的組合物劑量。組合物的劑量可以是每千克待治療個體的體重約0.0001到約1.000mg、每千克體重約0.01到約100mg、約0.1mg/kg到約10mg/kg和每千克體重約0.5mg到約5mg。一般來說，將調節投藥的時間安排和頻率以使既定治療或診斷時程的功效與既定遞送系統的副作用平衡。示例性給藥頻率包括連續輸注；單次和多次投藥，如每小時、每日、每周、每月或每年給藥。所屬領域的技術人員應理解，在本發明方法中所用的給藥方案可以是足以在個體中治療瑞特氏癥候群和/或相關自閉癥譜系障礙的任何時間長度。如本文所用的術語“慢性”意味著給藥方案的時間長度可以是數小時、數天、數周、數月或可能數年。樹枝狀聚合物復合物可以與一種或多種其它治療活性劑組合投與，已知該等治療活性劑能夠治療上文所論述的病狀或疾病。B.待治療的病癥或疾病大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥譜系障礙的兒童中的癥狀致病機制和惡化中起關鍵作用。如本文所用，術語“大腦發炎性疾病”意味著與大腦微神經膠質細胞或星形膠質細胞活化相關聯的大腦疾病，包括例如在美國精神病學會診斷和統計學手冊V中分類的RTT和自閉癥譜系障礙。瑞特氏癥候群瑞特氏癥候群(RTT)是造成衰弱的神經發育性病癥的一個實例，其具有許多與自閉癥譜系障礙共有的方面。RTT通過在最初表現正常的兒童中減緩發育，接著導致功能突然退化來影響女孩。大腦中的炎癥在患有RTT和自閉癥的兒童中的癥狀致病機制和惡化中起關鍵作用。不存在可治愈這些病癥的方法。患有瑞特氏癥候群的兒童在早期常常展現自閉癥樣行為。在約6到18月齡出現的瑞特氏癥候群最早癥狀看起來極像自閉癥；兒童遠離社會活動，失去交流能力并且發展出重復運動，如手部絞擰。谷氨酸酯增加見于患有瑞特氏癥候群的患者的CSF中，并且微神經膠質細胞活化增加見于患有自閉癥的患者的尸檢樣本中。瑞特氏病的動物模型具有與瑞特氏病相關聯的最常見遺傳異常，其為MeCP2缺失。小鼠展現如在患有瑞特氏病和自閉癥的患者中所見的特征性腳爪絞擰和扣緊運動。在此模型中，動物從3周時癥狀發作快速進展到約7周齡死亡。與未治療的動物相比較，從1周齡或3周齡開始一周一次用樹枝狀聚合物-抗炎劑(D-NAC10mg/kg)治療引起癥狀改善，癥狀發作延遲和/或癥狀無進展，但這不伴隨有存活率顯著增加。樹枝狀聚合物-NAC治療引起所治療動物體重增加的增加。在所治療動物的微神經膠質細胞形態和表型中也存在改善。在人類中，改善癥狀將是顯著進步。在一個優選實施例中樹枝狀聚合物復合物將用于遞送抗炎劑(D-NAC)和抗興奮性毒性和D-抗谷氨酸酯劑。優選的候選物是：MK801、美金剛(Memantine)、氯胺酮、1-MT、JHU-29、抗谷氨酸胺酶抑制劑和GCPH抑制劑，如2-MPPA和2-PMPA。自閉癥譜系障礙自閉癥譜系障礙(ASD)的特征在于：在跨多種情形的社會交流和社會互動中的持續性缺陷；受限、重復的行為、興趣或活動模式；癥狀必須在早期發育時段中存在(通常在生命的前兩年辨識出)；和，癥狀在社會、職業或其它重要目前活動領域中引起臨床上顯著的障礙。術語“譜系”是指患有ASD的兒童可能具有的廣泛范圍的癥狀、技巧和障礙或殘疾水平。一些兒童因其癥狀而出現輕度障礙，而其它嚴重殘疾。最新版本的精神障礙診斷與統計手冊(DSM-5)不再包括埃斯博格氏癥候群(Asperger'ssyndrome)；但在更廣類別的ASD內包括埃斯博格氏癥候群的特征。在一些情況下，患有ASD的嬰兒可能在其發育的極早期似乎不同。甚至在其第一個生日之前，一些嬰兒變得過度集中于某些物體，很少進行眼神接觸，并且未能參加典型的來回游戲和與其父母咿呀學語。其它兒童可能正常發育直到生命第二或甚至第三年為止，但接著開始失去對其它人的興趣并且變得沉默、遠離或不關心社會信號。正常發育的喪失或反轉稱為退化，并且在一些患有ASD的兒童中發生。自閉癥譜系障礙(ASD)診斷常常是兩階段過程。第一階段涉及在兒科醫師或早期兒童醫療服務人員對健康兒童的檢查期間進行的一般發育篩選。對展示一些發育問題的兒童進行其它評估。第二階段涉及由具有廣泛范圍專業的醫生和其它健康專業人員的小組進行徹底評估。在此階段，兒童可能診斷為患有ASD或另一種發育病癥。此時，由FDA批準治療ASD各方面的僅有的藥劑是抗精神病劑利培酮(risperidone)(Risperdal)和阿立哌唑(aripripazole)(Abilify)。這些藥劑可以在兒童年齡階段幫助減少易怒，易怒意味著攻擊性、自我傷害行為或壞脾氣。可以開出處方的未得到官方批準的一些用于患有ASD的兒童的藥劑包括以下：抗精神病藥劑更常用于治療嚴重心理病，如精神分裂癥。這些藥品可以幫助在兒童，包括患有ASD的兒童中減少攻擊性和其它嚴重行為問題。其也可以幫助減少重復行為、多動癥和注意力問題。抗憂郁藥劑(如氟西汀(fluoxetine)或舍曲林(sertraline))通常開出處方以治療抑郁癥和焦慮癥，但有時開出處方以減少重復行為。一些抗抑郁劑也可以幫助在患有ASD的兒童中控制攻擊性和焦慮癥。刺激藥劑(如哌醋甲酯(methylphenidate)(Ritalin)在治療患有注意缺陷多動病癥(ADHD)的人中安全并有效。已經展示哌醋甲酯也在患有ASD的兒童中有效治療多動癥。但并沒有許多患有ASD的兒童對治療有反應，并且那些有反應的兒童已經展示比具有ADHD而非ASD的兒童更多的副作用。本文所描述的樹枝狀聚合物結合物應具有用于治療和診斷此類個體的功效，確切地說，鑒于最近研究展示，在死后大腦樣本和細胞激素CSF水平中，患有自閉癥的患者具有由活化的微神經膠質細胞和星形膠質細胞存在增加而見的神經炎癥證據。瓦爾加斯(Vargas)等人,神經病學年鑒(AnnNeurol.)2005年1月；57(1):67-81.糾錯于:神經病學年鑒2005年2月；57(2):304中。興奮性毒性病癥興奮性毒性是神經細胞因為受到過度刺激而經由其變的受損的過程。多種病狀與興奮性毒性相關，包括中風、創傷性腦損傷、多發性硬化癥、肌肉萎縮性側索硬化、阿茲海默氏病(Alzheimer'sdisease)和脊椎損傷。對神經細胞的損傷引起相對應神經癥狀，其可以取決于何種細胞受損和損傷范圍如何而變化。一旦受損，神經細胞無法修復，并且患者可能經歷永久障礙。興奮性毒性經由其發生的過程開始于谷氨酸酯升高。谷氨酸酯是用以促進神經細胞之間電學信號傳導的興奮性神經傳遞素。然而，當谷氨酸酯水平上升太多時，其基本上堵塞開放位置的神經元，允許鈣自由流動到細胞中。鈣損傷細胞的結構和DNA，并且隨著細胞死亡而產生串聯反應并釋放涌進鄰近細胞的谷氨酸酯，造成損傷擴展。神經細胞上的若干受體對谷氨酸酯敏化，包括AMPA和NDMA受體。神經元之間的此相互作用可以是興奮性或抑制性的。主要興奮性氨基酸神經傳遞質是谷氨酸酯和天冬氨酸酯，而GABA(γ-氨基丁酸)、甘氨酸(胺基乙酸)和牛磺酸是抑制性的。具有挑戰性的神經病癥多樣性(包括中風、外傷、癲癇癥和甚至神經退化性病狀，如亨廷頓氏病(Huntingtondisease)、AIDS癡呆復合征和肌肉萎縮性側索硬化)，但通常不認為此譜群的疾病共用相同的神經元損傷和死亡機制。外傷是大規模升高細胞外谷氨酸酯水平的遲鈍機制。正常細胞外谷氨酸酯濃度是約0.6μmol/L。實質性神經元興奮性毒性損傷在谷氨酸酯濃度2到5μmol/L的情況下發生。對神經元的外傷性損傷可能產生將正常細胞內谷氨酸酯濃度約10μmol/L暴露于細胞外空間中災難性后果。因此，對單個神經元機械損傷使所有鄰近神經元具有風險。由此類型的谷氨酸酯釋放發生對周圍神經元的顯著間接損傷。一個最近的治療策略是立即用谷氨酸酯受體阻斷劑治療具有頭部或脊椎柱損傷的個人以使超出立即物理破壞神經元的神經元死亡的擴展減到最少。過量谷氨酸酯積聚的若干機制很可能導致出現局部缺血。谷氨酸酯從其在神經元囊泡中的儲存位點的異常釋放是至少一個因素。隨著此釋放谷氨酸酯刺激其它谷氨酸酯釋放，產生反饋環路。局部缺血也造成損害谷氨酸酯轉運體再吸收的能量缺乏。這些轉運體表現為同向轉運體，其依賴于跨細胞膜的鈉梯度與谷氨酸酯濃度梯度相反地將谷氨酸酯移動到細胞中。然而，鈉梯度由能量依賴性泵維持，該泵在局部缺血的情況下失效。此類失效不僅影響谷氨酸酯轉運離開突觸空間，并且還造成轉運體反向運作，成為細胞外谷氨酸酯的來源而非谷氨酸酯接收器。局部缺血使神經元喪失氧和葡萄糖，導致能量缺乏；然而，能量缺乏本身并不對神經元具有特定毒性。神經毒性的所得谷氨酸酯受體依賴性機制的級聯活化的情況下發生。如果這些受體由適當拮抗劑阻斷，那么神經元可以在喪失氧和代謝底物的時段內存活。這是谷氨酸酯受體阻斷劑治療急性缺血事件的最近發展與試驗的基本原理。雖然無法搶救梗塞區，但希望預防具有風險的相鄰半影區的周圍損傷。這些受體阻斷劑在研發中的干預領域和藥理學上相關的重新建立向大腦急性缺血區域灌注的嘗試中也可能是關鍵的。栽不同時停止處于受體或細胞內水平的興奮性毒性級聯的情況下向缺血區域進行組織灌注和氧濃度增加可以通過提供呈過氧化物陰離子形式的其它自由基以及通過刺激粒線體鈣存儲的釋放增加細胞內細胞溶質鈣水平來增加而非減少神經元損傷。已經研發和使用多種藥物來試圖中斷、影響或暫時停止引起神經元損傷的谷氨酸酯興奮性毒性級聯。一種策略是“上游”嘗試以減少谷氨酸酯釋放。此類別的藥物包括利魯唑(riluzole)、拉莫三嗪(lamotrigine)和利法利嗪(lifarizine)，其為鈉通道阻斷劑。常用的尼莫地平(nimodipine)是電壓依賴性通道(L型)阻斷劑。也已經進行影響偶合的谷氨酸酯受體本身各種位點的嘗試。這些藥物中的一些包括非爾胺酯(felbamate)、艾芬地爾(ifenprodil)、鎂、美金剛和硝化甘油。這些“下游”藥物嘗試影響如以下的細胞內事件：自由基形成、氧化氮形成、蛋白水解、核酸內切酶活性和ICE樣蛋白酶形成(在導致漸進式細胞死亡或細胞凋亡的過程中的重要組分)。將通過參考以下非限制性實例進一步理解本發明。實例1：向患有RTT的小鼠全身性投與樹枝狀聚合物-藥物結合物材料和方法在下文實驗中所用的詳細材料和方法(包括用于制造樹枝狀聚合物-Cy5和樹枝狀聚合物-藥物結合物的方案)已經由卡納安S等人科學·轉化醫學,4:130ra46(2012)并且在美國專利案第8,889.101號中描述。RTT小鼠是可購自杰克遜實驗室(JacksonLaboratory)的阿德里安·伯德型(AdrianBirdmodel)。樹枝狀聚合物注射和動物處死。向RTT小鼠靜脈內注射樹枝狀聚合物。對于靜脈內注射，在股區制造小切口之后，經由30g針頭將溶解于100μL無菌PBS中的600μgD-Cy5注射到股靜脈中。用游離Cy5和PBS注射的動物充當此研究的陽性或陰性對照。在樹枝狀聚合物注射后的適當時間點(24小時、72小時和21天，并且最多六周后)，使用氯胺酮/甲苯噻嗪使動物麻醉，并且使用致命劑量的戊巴比妥鈉進行安樂死。立即取出大腦，并且進行加工以用于免疫組織化學分析。高效液相色譜(HPLC)分析。使用與Empower軟件接合的配備有沃特斯(Waters)線上脫氣裝置、二元泵、光電二極管陣列(PDA)檢測器、多元熒光λ檢測器和自動取樣器(維持在4℃下)的沃特斯HPLC儀器(馬薩諸塞州米爾福德的沃特斯公司(WatersCorporation,Milford,Massachusetts))來分析樹枝狀聚合物-Cy5結合物(D-Cy5)的純度。同時使用沃特斯2998PDA檢測器對樹枝狀聚合物監測HPLC色譜圖中210nm處吸收并且對Cy5監測650nm處吸收，使用沃特斯2475熒光檢測劑監測HPLC色譜圖中645nm處激發和662nm處發射的熒光。水/乙腈(0.1％w/wTFA)經過新鮮制備、過濾、脫氣，并且用作流動相。使用與TSK-Gel保護柱連接的TSK-GelODS-80Ts(250×4.6mm，25cm長，5μm粒度)。使用以下梯度流：初始條件為90:10(H2O/ACN)，并且接著以1ml/min的流動速率在30分鐘內逐漸增加乙腈濃度達到10:90(H2O/ACN)，并且在60分鐘內返回原始初始條件90:10(H2O/ACN)。動物和炎癥的評定還評定體重和行為。使用用于評定發炎性標記物的標準小鼠引物來測量細胞激素(卡納安S等人科學·轉化醫學,4:130ra46(2012))。免疫組織化學和共聚焦顯微鏡檢查。將大腦切片固定在含2％多聚甲醛(PFA)的PBS中。以1:2比率分別使用含干冰的異戊烷將大腦在具有最優切割溫度化合物(OCT)的20％蔗糖(加利福尼亞州托蘭斯的櫻花優越技術美國公司(SakuraFinetekUSAInc.,Torrance,CA))中冷凍。將低溫塊儲存在-80℃下直到切片為止。使用低溫恒溫器從冷凍塊切割8μm切片。在兔抗離子化鈣結合銜接子1分子(Iba-1)(美國和光化學品公司(Wakochemicals,USA))(其是微神經膠質細胞標記物)中培育切片，并且施用山羊抗兔Cy3二級抗體。在蔡司(Zeiss)510共聚焦顯微鏡上分析切片。激發和發射波長以及激光設定與分析IV注射動物中的所有組織相同。取得Z形堆疊的切片并且收縮，以得到穿過完整部分深度的圖像。樹枝狀聚合物結合物的結合。使用先前報導的方法來進行樹枝狀聚合物與Cy5的結合(卡納安等人,科學·轉化醫學(2012年4月)。對于藥物實驗，使樹枝狀聚合物結合于N-乙酰基-半胱氨酸，并且在不同時間點以介于2-20mg/kg范圍內的劑量投與。每3-4天用D-藥物或PBS對小鼠進行注射。統計分析。使用斯圖登氏t檢驗分析數據的再現性以確定兩組之間的顯著性。等于或小于0.05的p值視為顯著的。結果樹枝狀聚合物結合物可以在大腦中介導炎癥的活化微神經膠質細胞中聚積。在3周齡時在有癥狀的RTT小鼠中全身性投與經過Cy5標記的樹枝狀聚合物，并且對大腦進行采集、灌注和固定以查看在微神經膠質細胞中定位的樹枝狀聚合物。樹枝狀聚合物定位于先前研究中已展示受傷或損傷的大腦區中的微神經膠質細胞中。健康對照小鼠未展示大腦中的積聚。當在呈現有代表RTT的癥狀的小鼠中全身性投與時，與具有類似疾病嚴重程度的未治療小鼠相比較，樹枝狀聚合物-藥物結合物(D-藥物)展示在8周齡為止時整體幼鼠健康狀況、外觀和疾病行為標志中的顯著改善。在3周齡全身性投與的結合于Cy5的樹枝狀聚合物在RTT小鼠側向皮質中微神經膠質細胞中積聚。當在有癥狀的RTT小鼠中從3周齡開始每3-4天全身性投與時，樹枝狀聚合物-藥物(D-藥物)結合物提供在8周齡時整體健康狀況和外觀的顯著改善。PBS治療的小鼠展示嚴重的腳爪緊握、駝背體態和失明。與游離藥物相比較，經過治療的小鼠展示存活率改善(圖1A)。圖1A是在MeCP2剔除小鼠中進行NAC和D-NAC療法后的卡普蘭-邁耶存活率曲線。在每周兩次NAC或D-NAC療法后在MeCP2剔除幼鼠中評定存活率。與未治療的動物相比較，D-NAC不改善存活率。D-NAC改善NAC的安全性。與NAC治療的幼鼠相比較，D-NAC和PBS治療的MeCP2剔除幼鼠具有顯著更好的50％存活率(p＝0.014)，指示NAC在以游離調配物形式給予時的潛在毒性。在于樹枝狀聚合物-藥物結合物(DNAC)上藥物相當的劑量下，游離非結合藥物(NAC)實際上導致比未治療的瑞特氏小鼠更壞的存活率。與PBS治療的瑞特氏小鼠相比較，用樹枝狀聚合物-藥物結合物治療維持顯著改善的行為(圖1B)。圖1B是在MeCP2剔除小鼠中進行D-NAC療法后的神經行為結果圖。在3周齡時(PND21)開始用生理鹽水(PBS，黑色虛線)、10mg/kgNAC(紅色線)或10mg/kg(以NAC計)D-NAC(藍色線)治療MeCP2剔除小鼠。每周兩次對幼鼠進行治療。在PND10和PND17時進行行為測試以確定基線，并且在PND21時開始在每一治療日治療之前進行行為測試。使用同窩匹配的WT幼鼠作為體重和行為對照兩者。與NAC和PBS治療相比較，D-NAC療法顯著地改善行為結果。與未治療的幼鼠相比較，D-NAC改善MeCP2剔除小鼠的整體外觀。未治療的幼鼠顯著消瘦，具有多個緊握的腳爪、駝背體態和不良的眼睛條件。在治療之前每3-4天對動物進行錄像，并且按照0-3的等級對所有運動性、步態、震顫、腳爪緊握、腳爪緊握時間、腳爪絞擰和呼吸進行評分，其中‘0’指示最壞評分并且‘3’是最佳或正常。產生復合評分(0-21的范圍，其中正常、健康小鼠的評分為20-21)并且在組間比較，其中較低評分指示惡化的行為。對展現類似存活率的研究中所有小鼠的評分進行平均(66天齡，或6周治療)。確定并且比較T小鼠與MeCP2剔除小鼠中的大腦吸收和細胞定位。在有癥狀前的時段(1周齡)，樹枝狀聚合物(D-Cy5，紅色)定位主要在室上性區中的微神經膠質細胞(Iba)中而不在星形膠質細胞(GFAP)中。在充分進入有癥狀時段的數周齡時沒D-Cy5定位于皮質中的微神經膠質細胞中和室上性區中的星形膠質細胞中。D-Cy5保持定位于兩個年齡的T小鼠的血管中。在T小鼠和MeCP2剔除小鼠中評定微神經膠質細胞形態。在MeCP2剔除小鼠(KO)中，微神經膠質細胞(Iba)在1周齡時在圍繞腦室的區中是變形蟲樣(amoevoid)。2周和5周齡的KO小鼠中的微神經膠質細胞具有較少并且較薄突起(processes)，并且在數周齡時具有較多突起，但與數周時的T微神經膠質細胞相比較連接較少。在T小鼠和有癥狀前與有癥狀的MeCP2剔除小鼠的大腦中測量發炎性概況(圖2A-2F)。在1、2、3、5和數周齡時，在T幼鼠和MeCP2剔除幼鼠的大腦中測量促炎性和抗炎性細胞激素的mRNA水平。呈現中值2ΔΔCT值，并且誤差條由四分位范圍上限和下限表示。(圖3A)發炎性概況隨時間的變化呈現為復合促炎性評分(包括TNFα、I-6和I-1β)與復合抗炎性評分(包括TGF-β、I-10和I-4)的比率。復合評分通過在既定基因分型中取得每一壽命的所有幼鼠在該壽命時的所有促炎性2ΔΔCT值或所有抗炎性2ΔΔCT值的中值來產生。(圖3B)MeCP2剔除小鼠的促炎性概況傾向于促炎性標記物在2周和數周時增加。然而，在2周、5周和數周齡時，與周齡和同窩匹配的T小鼠相比較，抗炎性mRNA表達(圖3C)在MeCP2剔除小鼠中展示顯著減少。這表明，MeCP2剔除小鼠中的神經發炎性過程由抗炎性表達的減少來驅動，而非由促炎性表達的增加來驅動。圖4是大腦中D-Cy5的量(μg/g)隨大腦損傷嚴重性(基于復合行為評分)而變化的圖。對吸收與損傷嚴重性的相關性的此展現提供診斷損傷程度的手段。實例2：在犬類模型中治療大腦損傷材料和方法用于低溫循環驟停的犬類動物模型中大腦損傷的樹枝狀聚合物大腦吸收和靶向療法由馬努基(Manoj)等人,美國化學學會·納米,2014,8(3),第2134-2147頁描述。在這些研究中使用具有乙二胺(EDA)核心的6級的伯羥基官能化PAMAM樹枝狀聚合物。制備結合物如上文所描述來制備結合物。犬類HCA模型和實驗設計所有實驗都是用由鮑姆加特納實驗室(Baumgartnerlaboratory)研發的HCA犬類模型。(雷德蒙德(Redmond)等人,胸外科年鑒(Ann.Thorac.Surg.)1995,59,579-584；雷德蒙德等人,胸與心血管外科(Thorac.Cardiovasc.Surg),1994,107,776-786)。此大動物模型利用人類與犬類之間的某些固有生理類似性來研發可容易轉譯的治療模型以解決與低溫循環驟停相關聯的神經損傷。因為這是大動物模型，所以人們能夠復制與在人類手術室中所經歷的具有驚人保真度的外科手術，并且能夠復制與最壞人類情況中所見類似的神經損傷程度。所有實驗使用經過適應的犬惡絲蟲陰性的6-12月齡雄性A類犬(大致30kg)(紐約州北羅斯的馬歇爾生物資源公司(MarshalBioresources,NorthRose,NY))。實驗由約翰·霍普金斯大學醫學院動物照護與使用委員會批準比較宮崎駿額遵守“實驗動物照護與使用指南”(1996,美國國家衛生研究院)。向犬投與美索比妥鈉(12mg/kgIV，分次給藥)，氣管內插管，并且維持異氟烷吸入麻醉(0.5％-2.0％)，100％氧氣和IV芬太尼(fentanyl)(150-200微克/劑量)和咪達唑侖(midazolam)(2.5毫克/劑量)。鼓室膜、食道和直腸探針監測整個實驗中的溫度。在起始CPB之前放置左股動脈導管以監測血壓并對動脈血液氣體進行取樣。連續地監測EKG。對右股動脈插管，并且導管前進到下行胸主動脈。靜脈導管從右股靜脈和右外頸靜脈前進到右心房。開始胸外CPB，并且使動物冷卻。60-100mL/kg/min的泵送流動維持60-80mmHg的平均動脈壓。一旦鼓室溫度達到18℃，中止泵送并且通過重力使血液排干到儲集器中。犬在標準血液稀釋和動脈血液氣體α-stat調節的情況下經歷2小時HCA。在HCA之后，重新開始CPB，并且歷經2小時時程使動物再升溫到37℃核心溫度。如果竇性節律未自發地返回，那么在32℃下對心臟進行除纖顫。取得連續血液氣體水平以確保恰當的pH并檢驗電解質濃度，并且使用動脈導管記錄連續血流動力學測量結果。在37℃下，使每一只狗脫離CPB并且去除導管。在插管時使犬從麻醉恢復，同時頻繁監測生命體征、動脈血液氣體和尿排出量。一些動物在此階段需要血流動力學支撐物和酸中毒修正以能夠成功脫離搭橋。一旦在血液動力學和臨床上穩定，對犬進行拔管并且將其轉移到其籠中以用于恢復和存活，其中以24小時間隔進行神經評定直到所需終點(在搭橋之后24或72小時)為止。樹枝狀聚合物投藥(用于生物分布研究)在低溫循環驟停之后24小時時以單次推注形式注射樹枝狀聚合物-熒光團結合物。并行用D-FITC靜脈內輸注(每動物140mg，大致5mg/kg)和D-Cy5的腦大池內(ICM，“進入大腦”)注射(每動物5mg，0.17mg/kg)來治療三只犬，并且在結合物投藥后48小時時安樂死。隨后在處死(投藥之后48小時)時測量組織吸收和生物分布。因為FITC和Cy5在其不同特征波長下加以分析，所以可以同時評定其生物分布。樹枝狀聚合物投藥(用于功效研究)在HCA前后靜脈內投與游離藥物(VPA和NAC)或樹枝狀聚合物-藥物結合物。游離藥物投與的劑量是基于我們用VPA實現神經保護的先前研究，并且是基于游離N-乙酰基半胱氨酸的文獻。先前研究已經報導，用NAC治療理在心跳驟停模型中具有保護性。樹枝狀聚合物-藥物結合物的劑量設定為游離藥物劑量的1/10(VPA)或1/30(NAC)，這是基于先前發現在此類劑量比率下在兔CP模型中的驚人神經保護。對于游離藥物，用100mg/kg的VPA和300mg/kg的NAC治療動物，其中一半劑量在驟停前靜脈內投與并且其余在驟停后投與。對于樹枝狀聚合物-藥物結合物，用含有10mg/kgNAC的D-NAC和/或具有10mg/kgVPA的D-VPA對犬進行靜脈內治療。在HCA之前以25％推注形式靜脈內投與D-VPA，繼而在HCA完成之后歷經2小時進行75％輸注。在HCA前以50％推注形式靜脈內投與D-NAC，并且在HCA完成之后歷經2小時進行50％輸注。這些療程與游離藥物所用的類似。安樂死通過放血對動物進行安樂死。在鎮靜和插管之后，動物經歷中胸骨切開術，并且使用22-French導管對升主動脈進行套管插入。起始CPB，改變下行主動脈夾持以確保大腦在60mmHg下灌注有12L冰冷生理鹽水(4℃)。橫切右心房附體，并且允許靜脈回流排干。在灌注之后立即采集大腦，分離半球，并且將一個半球固定在10％中性緩沖福爾馬林中(用于免疫組織化學評估和成像)，而將另一個半球切割成1cm冠狀面切片并且快速冷凍(用于生物分布量化)。熒光顯微鏡檢查用抗熒光衰減培養基(具有DAPI的ProLongGold，俄勒岡州尤金的分子探針公司(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR))安裝海馬區和小腦的低溫恒溫器切片。在對每一大腦區的所有樣品暴露時間相等的情況下，使用蔡司AxiolmagerM2獲得熒光影像。為了使圖像對比度和亮度最優，在每一組圖像內同等調節顯示器設定。神經評估每24小時對所有動物進行臨床神經評定直到處死為止。在本研究中所用的犬特異性行為等級在匹茲堡大學醫學院國際復蘇和研究中心得到驗證。所評估的神經功能存在五個組件：意識水平、呼吸道模式、顱側神經功能、運動和感覺功能以及行為。兩個研究員獨立地在0(正常)與100(嚴重損傷)之間對每一組分指定評分，并且這些評分經過平均和求和以獲得總評分，其可能值介于0(正常)到500(大腦死亡)范圍內。結果如在低溫循環心跳驟停誘導的大腦損傷的犬類模型中所展現的，對于遞送藥物跨越受傷BBB，G6PAMAM樹枝狀聚合物優于G4樹枝狀聚合物。G6樹枝狀聚合物在持續時間段內維持較高的大腦脊髓液(CSF)與血清比率。維持此類高CSF/血清比率是用于許多CNS藥物關鍵性障礙。參見圖5。受傷大腦中所見的高CSF水平是關鍵性新特征。基于展示G6樹枝狀聚合物由活化的微神經膠質細胞和受傷神經元內化的研究，樹枝狀聚合物的積聚依賴于損傷程度(參見圖4)(美國化學學會·納米.2014年3月25日:8(3):2134-47。)如圖5所示，G6樹枝狀聚合物在腦脊髓液(CSF)中分配較高，其中到24小時為止，GSF/血清比率比犬592和593高10％，并且在72小時時～4％-5％。在輸注時間期間和之后不久，取決于損傷程度，比率可變成高達40％。如圖6中所示，G6樹枝狀聚合物的大腦積聚是區依賴性的，其中最高積聚在海馬區中，接著是小腦和皮質，與損傷模式一致。在樹枝狀聚合物投藥后48小時時，在大腦的所有區中，G6樹枝狀聚合物都展示比G4樹枝狀聚合物顯著更高的大腦積聚(低于檢測限)。參見圖6。即使在投藥之后48小時時，G6樹枝狀聚合物在受傷區中的水平仍是G4樹枝狀聚合物在6小時較早時間時的許多倍。在海馬區中，G6樹枝狀聚合物在齒狀回中展示比CA1和CA3區中更高的積聚。在海馬區中，G6樹枝狀聚合物展示不同類型的細胞定位，其中主要由活化的微神經膠質細胞和受傷神經元吸收。如圖7所示，在第2次推注給藥后48小時時，G6樹枝狀聚合物主要積聚在腎臟皮質和肝臟中，表明腎和肝清除率對于從循環中去除樹枝狀聚合物都是重要的。與G4樹枝狀聚合物相比較，G6樹枝狀聚合物展示較低腎臟水平，與較高血清水平一致。結果展現，G4和G6樹枝狀聚合物在500倍更高劑量下都不具有毒性，并且經由腎臟完整清除。本文所描述的方法和材料的修改和變化對于所屬領域的技術人員將是顯而易知的，并且意圖涵蓋于權利要求書內。當前第1頁1 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