一種磁性納米診療劑及其制備方法和應用與流程

本發明屬于納米診療劑技術領域，涉及一種磁性納米診療劑及其制備方法和應用。

背景技術：

目前，對于重大疾病，僅通過一種成像手段來確定病變部位、病變程度或者僅用一種方式進行治療已經非常局限，而能夠通過多種方式來共同成像和多種模式共同治療就成為發展的趨勢。

光聲成像的靈敏度高，而且穿透力較強，但是由于激光的穿透能力有限，對于深層組織仍然存在一定的局限性；核磁成像的穿透力很強，且空間分辨率高，可成像的質量與被測對象的狀態關系很大，略微的運動就會造成運動偽影，這樣就會影響圖像的清晰度，進而影響對病情的分析，造成誤判。如果能夠將這兩種常用的成像方式結合起來，共同分析，將會使病情的分析更加準確。

光熱治療作為一種操作簡單、毒副作用小的新型治療手段，以近紅外激光為外部刺激，具有近紅外吸收的材料為熱源進行治療。由于能量集中，受到干擾較少，穿透性較強，組織損傷小等特點而具有良好的發展前景。在交變磁場存在的條件下，磁性納米粒子將由于磁矢量旋轉和顆粒本身的物理旋轉而產生熱量。同時，由于磁場幾乎沒有阻礙的穿透性，磁熱治療在治療組織深處的病灶時具有更強的優勢。如果將這兩種熱療結合起來，將擴大納米診療劑的應用范圍。

根據顯影增強類型，目前使用的核磁共振造影劑分為兩類：陽性造影劑和陰性造影劑。它們分別通過增強局部區域的1/T₁或1/T₂弛豫效率來達到圖像信號增強和畫面變亮或畫面變暗的效果。多數造影劑由重金屬構成，它們的長期毒性令人擔憂。例如，核磁共振造影劑釓-二乙烯三胺五乙酸(Gd-DTPA)，雖然已經被批準用于臨床，但由于其螯合的釓離子容易釋出，造成毒性，而且不具有長循環和靶向的效果，使得其應用受到限制。而四氧化三鐵的安全性非常高，100mg/Kg時沒有毒副作用，即使到達600mg/Kg，也沒有致命毒性(Lee N,Hyeon T.Designed synthesis of uniformly sized iron oxide nanoparticles for efficient magnetic resonance imaging contrast agents.Chemical Society Reviews.2012；41:2575-89)。聚吡咯納米粒子由于良好的穩定性，優異的導電性和生物相容性，被廣泛應用于生物醫藥領域。而較強的近紅外吸收使目前關于聚吡咯納米粒子在光聲成像造影劑和光熱治療方面的報道日益增多。

透明質酸(HA)是一種具有良好水溶性的天然高分子，大量存在于脊椎動物和細菌中，如人關節組織的細胞外基質，關節滑液，皮膚真皮及眼睛的玻璃體內等。HA也是一種線性多聚糖分子，單體是由糖苷鍵鏈接(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰-D-葡糖胺構成的二糖單元；根據二糖單元的數目不同，相對分子量基本在1×10⁵～5×10⁶Da之間。而不同分子量的HA在生物體內有著不同的功能，如當相對分子量大于2×10⁶時，HA具有很好的黏彈性、抑制炎性反應和潤滑等功能；相對分子質量為(1～2)×10⁶時，具有良好的保濕性和延緩藥物釋放作用；而分子量小于8×10⁴時，具有抗腫瘤、促進血管生成和免疫調節等作用，可以用于腫瘤靶向治療、促進血管修復與生成以及用于機體創傷修復。

CN104436193A公開了一種葉酸偶聯的金納米棒/聚吡咯/四氧化三鐵多功能復合納米診療劑的制備方法，用金納米棒、聚吡咯和四氧化三鐵組成的復合納米粒子作為基體，采用層層自組裝的方法，分別選用聚陽離子電解質殼聚糖和聚陰離子電解質含藻酸鈉對復合納米粒表面進行修飾，使其表面含有氨基，在通過與葉酸的羧基進行連接，制備得到多功能復合納米診療劑。然而該發明的制備方法復雜，需要進行多步表面修飾才能取得復合納米診療劑，并且成本較高。

因此，在本領域中，期望得到一種制備方法簡單，并且具有成像以及光熱和磁熱綜合治療效果的多模式納米診療劑。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種磁性納米診療劑及其制備方法和應用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種磁性納米診療劑，所述磁性納米診療劑包括四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子和吸附在所述聚吡咯納米粒子表面的透明質酸。

本發明利用四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子和透明質酸可以得到在水溶液中性質穩定、具有良好靶向性和T₂弛豫增強效果和光聲成像效果的納米診療劑，其具有光熱和磁熱治療的綜合效果，適合用作多模式診療劑。

優選地，所述四氧化三鐵納米粒子為殼聚糖季銨鹽包裹四氧化三鐵形成的納米粒子，所述殼聚糖季銨鹽具有式(I)所述結構：

其中n為17～290的整數，n的取值示例性的可以是32、33、34、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310或320等，若殼聚糖季銨鹽的分子量過小，即聚合程度較低時，會降低溶液的黏度，不能起到阻隔四氧化三鐵晶體生長的作用，不能制備出合適的四氧化三鐵納米粒子；若殼聚糖季銨鹽的分子量過大，尤其是聚合單元n＞320時，由于過強的正電荷將使其在生理環境中不穩定，還會造成粘稠度過大，影響最終磁性納米診療劑的磁熱效應；也會由于殼聚糖季銨鹽的分子量過大或過小而影響本發明的磁性納米診療劑的粒徑均一性。

優選地，所述磁性納米診療劑的粒徑為60～150nm，例如62nm、65nm、68nm、70nm、73nm、75nm、78nm、80nm、85nm、88nm、90nm、95nm、98nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm或150nm，如果粒徑大于150nm，多功能納米診療劑的穩定性將會下降；如果粒徑小于60nm，多功能納米診療劑的熱療效果將會減弱。

優選地，所述磁性納米診療劑的水合粒徑為100～300nm，例如100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、220nm、240nm、260nm、280nm或300nm，如果水合粒徑大于300nm，磁性納米診療劑的穩定性將會下降；如果粒徑小于100nm，磁性納米診療劑的熱療效果將會減弱。

優選地，磁性納米診療劑中所述四氧化三鐵納米粒子中鐵原子與所述聚吡咯的質量比為(52～92):100，例如52:100、55:100、58:100、60:100、65:100、68:100、70:100、73:100、75:100、78:100、80:100、84:100、88:100、90:100或92:100。限定二者的質量比是為了保證磁性納米診療劑同時具有較好的成像和治療效果。如果鐵原子比例過高(即四氧化三鐵比例過高)，將會使納米診療劑的光熱治療和光聲成像效果下降。反之，如果聚吡咯比例過高，則將會影響納米診療劑的磁熱治療和核磁成像效果。

第二方面，本發明提供了如第一方面所述的磁性納米診療劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備四氧化三鐵納米粒子，將四氧化三鐵納米粒子分散在分散溶液中，得到反應體系A；

(2)向反應體系A中加入吡咯單體，得到穩定的反應體系B；

(3)向反應體系B中加入氧化劑溶液，在冰浴中攪拌反應，磁傾析并洗滌得到四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子(Fe₃O₄@PPr)溶液體系；

(4)將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系加入至透明質酸水溶液中，離心并洗滌得到所述磁性納米診療劑。

在本發明所述制備方法中，所述四氧化三鐵納米粒子的制備方法包括以下步驟：

①將殼聚糖季銨鹽溶于去離子水，通入保護性氣體，升溫后，保溫得到反應體系a；

②將三價鐵鹽和二價鐵鹽溶于強酸溶液中，得溶液b；

③將溶液b注入反應體系a中，調節pH至堿性，回流得到反應體系c；

④冷卻反應體系c至室溫，透析后得到所述四氧化三鐵納米粒子。

優選地，步驟①所述反應體系a中殼聚糖季銨鹽的濃度為30～50g/L，例如可以為30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L等。

優選地，步驟①所述保護性氣體優選氮氣和/或氬氣，優選氮氣。

優選地，步驟①中持續通入保護性氣體20～40min，例如23min、25min、28min、30min、33min、35min、38min或40min。

優選地，步驟①所述保溫溫度優選為90～110℃，例如可以是90℃、92℃、94℃、96℃、98℃、100℃、102℃、104℃、106℃、108℃或110℃等。合適的溫度范圍內能得到粒徑均一的四氧化三鐵納米顆粒，否則會造成粒徑不均一，影響最終磁性納米診療劑的穩定性及其性能的發揮。

優選地，步驟②所述三價鐵鹽與二價鐵鹽的摩爾比為2:(1～2)，例如2:1、2:1.1、2:1.2、2:1.3、2:1.4、2:1.5、2:1.6、2:1.7、2:1.8、2:1.9或2:2。

優選地，步驟②所述三價鐵鹽為FeCl₃·6H₂O，二價鐵鹽為FeCl₂·4H₂O。

優選地，步驟②所述強酸溶液中，強酸的濃度為0.8～2moL/L，例如0.8moL/L、0.9moL/L、1moL/L、1.1moL/L、1.2moL/L、1.5moL/L、1.8moL/L或2moL/L。

優選地，相對于100mg三價鐵鹽，步驟②所述強酸溶液的用量為1-4mL，例如1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。

優選地，步驟③中所述調節pH所用試劑為氨水，進一步優選質量分數為25～28％的氨水，例如25％、26％、27％或28％。

優選地，步驟③中所述調節pH至堿性為調節pH至8～11，例如可以是8、8.3、8.5、8.8、9、9.2、9.4、9.6、9.8、9.9、10、10.5或11等。

優選地，步驟③所述回流的時間為20～60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等。

優選地，步驟④所述透析為用去離子水進行透析。

優選地，所述透析的溫度為20～35℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等；所述透析的時間為12-72h，例如可以是12h、15h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、40h、44h、48h、50h、55h、58h、64h或72h。

優選地，步驟(1)所述分散溶液為聚乙烯醇溶液。

優選地，所述聚乙烯醇溶液的質量體積濃度為1～4％，例如1％、1.3％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.3％、3.5％、3.8％或4％。所述濃度即為反應時所加入的聚乙烯醇的濃度，濃度過大或過小會造成最終形成的納米診療劑的粒徑過大或過小，從而影響其成像和治療效果。

優選地，步驟(2)中所述吡咯單體與步驟(1)中所述四氧化三鐵納米粒子中四氧化三鐵的質量比為1:(0.4～1.3)，例如1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2或1:1.3；如果四氧化三鐵比例過高，將會使納米診療劑的光熱治療和光聲成像效果下降。反之，如果四氧化三鐵比例過低，則將會影響納米診療劑的磁熱治療和核磁成像效果。

優選地，步驟(2)所述向反應體系A中加入吡咯單體后進行超聲并攪拌，得到穩定的反應體系B。

優選地，所述超聲為水浴超聲，所述超聲的時間為10～50min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。

優選地，所述攪拌的時間為10～50min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min或50min。

優選地，所述超聲和攪拌在室溫下進行。

優選地，步驟(3)所述氧化劑與步驟(2)所述吡咯單體的質量比為(5～10):1，例如5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。如果氧化劑的比例過低，將使吡咯聚合不完全。

優選地，步驟(3)所述氧化劑為三氯化鐵、過硫酸銨或碘中的任意一種或至少兩種的組合。

優選地，步驟(3)所述反應的時間為4～12h，例如5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、10h、11h或12h。

優選地，步驟(3)所述洗滌利用50～70℃去離子水進行，例如50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃的去離子水。使用50～70℃的熱水進行洗滌可以去除多余的聚乙烯醇和其他試劑。

優選地，步驟(3)所述洗滌進行1～3次。

優選地，步驟(3)經過洗滌得到四氧化三鐵摻雜的聚吡咯納米粒子后，用去離子水復溶，保存于4℃。復溶后保存在4℃可使納米粒子免于染菌，保存時間更長。

優選地，步驟(4)所述透明質酸水溶液的濃度為2～5mg/mL，例如2.3mg/mL、2.5mg/mL、2.8mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、3.8mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或4.8mg/mL。如果透明質酸濃度太低，將不能起到很好的分散效果，而如果透明質酸濃度太高，將使后續的離心純化麻煩。

優選地，步驟(4)所述加入的方式為滴加。

優選地，步驟(4)所述將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系加入至透明質酸水溶液中是在超聲下進行的。

優選地，所述超聲為探頭超聲，功率為45～180W，例如可以是45W、50W、60W、70W、80W、90W、100W、110W、120W、135W、145W、160W、170W、或180W；時間為3～15min，例如可以是3min、5min、7min、9min、11min、13min或15min。如果超聲功率太小，時間太短，納米粒子分散不好。

優選地，步驟(4)所述離心的轉速為10000～15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm。

優選地，步驟(4)所述離心的時間為10～30min，例如10min、13min、15min、18min、20min、23min、25min、28min或30min。

優選地，步驟(4)所述洗滌利用25℃的去離子水進行，洗滌3-5次，目的是去除多余的透明質酸。

優選地，將步驟(4)經過洗滌得到磁性納米診療劑后，用去離子水復溶，保存于4℃。復溶后保存在4℃可使磁性納米診療劑免于長菌，保存時間更長。

在本發明中，吡咯單體在帶正電荷的四氧化三鐵納米粒子存在的聚乙烯醇水溶液中均勻分散后，在氧化劑的作用下進行原位聚合反應形成Fe₃O₄@PPr納米粒子；用Fe₃O₄@PPr納米粒子表面的正電荷吸附透明質酸作為水溶性的穩定劑和靶向劑，得到穩定性好，靶向性強，增強T₂弛豫效果和光聲成像效果，并具有良好光熱和磁熱效果的診療劑。

四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米載體吸附了透明質酸后，由于透明質酸帶有羧基，使得整個納米粒子表面電荷為負電荷。負電荷能夠增加納米粒子在血液中的穩定性，并具有長循環的效果。

另一方面，本發明提供了如上所述的磁性納米診療劑在制備成像劑中的應用。所述磁性納米診療劑用于核磁共振成像或光聲成像，具有T₂弛豫增強效果和光聲成像效果，是制備多模式成像劑的理想納米診療劑。

另一方面，本發明提供了如上所述的磁性納米診療劑在制備腫瘤靶向治療藥物中的應用。本發明所述的磁性納米診療劑具有很好的靶向作用以及光熱和磁熱的治療效果，可以用于腫瘤的診斷、靶向治療以及病變分析等。

相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

本發明的納米診療劑粒徑小，具有良好的穿透性且粒徑均一，易于純化，粒子表面為負電荷，沒有明顯的細胞毒性，生物相容性良好，具有較好的長循環效果，且長期毒性較低；有突出的T₂弛豫增強效果，T₂弛豫時間倒數在低濃度范圍內隨鐵濃度變化的線性關系均良好，具有光聲成像能力，是制備多模式成像的理想納米診療劑，該納米診療劑的光熱和磁熱治療效果明顯。并且其制備方法簡單，條件溫和，成本較低，易于推廣和應用。

附圖說明

圖1為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的透射電鏡圖，其中A圖中標尺為0.5μm，B圖中標尺為20nm。

圖2A為實施例1得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子Fe₃O₄@PPr的水合粒徑分布圖。

圖2B為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的水合粒徑分布圖。

圖3A為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的紫外-可見-近紅外吸收光譜。

圖3B為磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA在不同濃度下的與紫外-可見-近紅外吸收光譜。

圖4為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的升溫曲線圖。

圖5為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的磁化率隨外加磁場的變化圖。

圖6為實施例1得到的納米粒子Fe₃O₄@PPr和Fe₃O₄@PPr@HA的穩定性測試結果圖。

圖7A為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的T₂弛豫時間倒數隨鐵原子濃度變化的線性關系圖。

圖7B為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA在不同鐵原子濃度下的T₂加權成像圖。

圖8A為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的光聲成像信號強度與該磁性納米診療劑的濃度關系圖。

圖8B為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的光聲成像圖。

圖9為結晶紫染色法測試的MDA-MB-231細胞經過PBS緩沖液和磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA(Fe離子濃度范圍在0-20μg/ml)處理24小時后的細胞活力柱狀圖。

圖10A為當激光功率為4W cm^-2時，隨納米材料濃度的增加，光熱治療后人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的存活率圖。

圖10B為當材料濃度為200μg/mL時，隨著激光功率的增加，光熱治療后人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的存活率圖。

圖10C為本發明實施例1制備的磁性納米診療劑在高頻磁場作用下對人乳腺癌細胞MDA-MB-231存活率的影響結果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。

以下實施例中測量粒徑所用的儀器為動態光散射儀(Malvern,Zetasizer NanoZS)；觀測粒子形態用透射電鏡(FEI,Tecnai G2 20S-TWIN，200kV)；鐵濃度采用電感耦合光譜測定(Perkin Elmer,PE8000)；材料的紫外吸收采用紫外分光光度計(Perkin Elmer,Lambda 850)；材料的升溫能力使用高頻電磁感應加熱設備(Shuangping,SPG-10AB-II)和近紅外成像儀(FLIR Systems Inc,TG165)測定；材料的飽和磁化率使用物性測量儀(Quantum Design,PPMS-9)測定；DAPT藥物的載帶以及釋放使用高效液相色譜HPLC(Waters,2796-2996)檢測；細胞相關指標使用倒置顯微鏡(Olympus,IX71)和流式細胞儀(BD,FACSCalibur)測定。

實施例1

在本實施例中，磁性納米診療劑由以下方法制備，具體包括以下步驟：

(1)①將2g的分子量為100,000Da的式(I)所示殼聚糖季銨鹽溶于50mL去離子水中，放置于三口燒瓶中，反應體系通氮氣30min，油浴升溫至102℃，得到反應體系a；

②取0.1459g的FeCl₃·6H₂O與0.071g的FeCl₂·4H₂O溶于2mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液中，得到溶液B；

③將溶液b注入到步驟(1)中的反應體系a，緩慢滴加濃氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流40min，得反應體系c；

④等步驟(3)中的反應體系c冷卻至室溫后，將所有反應液移至透析袋中，用去離子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到四氧化三鐵納米粒子；

⑤將得到的四氧化三鐵納米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反應體系A；

(2)在反應體系A中加入5μL吡咯單體，先超聲30min，再攪拌30min后得到反應體系B；

(3)在反應體系B中逐滴加入三氯化鐵溶液(1mL，44.4mg/mL)，冰浴中攪拌反應4小時，磁傾析并用80℃去離子水洗滌三次得到四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子(Fe₃O₄@PPr)溶液體系；

(4)將15mg透明質酸溶于5ml去離子水中得到透明質酸水溶液，將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系(1mL，2mg/mL)在90W的超聲功率下，滴加至透明質酸水溶液中，12000rpm離心20min并并用去離子水洗滌三次得到所述磁性納米診療劑(Fe₃O₄@PPr@HA)。

通過透射電鏡觀察，利用本法制備的納米診療劑的粒子為球形，水合粒徑的峰值為169nm左右，通過ICP-OES測得鐵原子與聚吡咯的質量比為73:100。

取實施例1制備的多功能納米診療劑進行形貌分析，觀察所制備的納米粒子Fe₃O₄@PPr@HA的透射電鏡圖1可以看出，納米粒子為均一的球形。

隨后，對實施例1制備的納米粒子Fe₃O₄@PPr和磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的水合粒徑分布進行測試，結果如圖2A和圖2B所示。由圖2A可以看出，納米粒子Fe₃O₄@PPr的水合粒徑的多分散指數較小，表示水合粒徑分布均一，平均粒徑為145.3nm，Zeta電位在32±5.82mV，納米粒子表面的正電荷有利于下一步吸附透明質酸；圖2B是納米粒子Fe₃O₄@PPr@HA的水合粒徑分布圖，從圖中可以看出納米粒子粒徑均一，平均粒徑為169.39nm，Zeta電位在-33.2±4.87mV，表面的負電荷則說明透明質酸被成功的吸附在納米粒子表面。

圖3A為實施例1制備的納米粒子Fe₃O₄@PPr@HA的紫外-可見-近紅外吸收光譜，從圖中可以看出納米粒子在近紅外區(700-900nm)是寬吸收，這使得該納米診療劑能夠有很強的光熱轉換效應，而圖3B則說明納米粒子的吸收光譜與其濃度呈正相關。

圖4為實施例1制備的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA在0.8W/cm²的808nm激光照射下的升溫曲線圖，可以看出，磁性納米診療劑在小功率激光和低濃度下，就有很強的升溫能力。

圖5為磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的磁化率曲線，該圖說明所合成的納米診療劑是超順磁納米粒子。

從圖6所示的穩定性測試結果可以看出，透明質酸的加入非常有利于磁性納米診療劑在生理條件下的穩定性。

隨后，對實施例1制備的多功能納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA進行核磁成像測試，測試在納米診療劑納米體系中鐵原子濃度為0.0mM、0.07mM、0.14mM、0.28mM和0.56mM下T₂弛豫時間的倒數與鐵原子的濃度的線性關系以及在所述濃度下的T₂加權成像情況，如圖7A所示，納米診療劑的T₂弛豫時間的倒數與納米診療劑的納米體系中鐵原子的濃度有很好的線性關系，且從圖7B的成像圖中可以看出材料具有較好的成像效果。

圖8A為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA的光聲成像信號強度與濃度的關系圖，從圖中可以看出，在一定濃度范圍內，兩者基本呈線性關系；圖8B為實施例1得到的磁性納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA隨著使用濃度的增加，光聲成像的信號強度在增加。因此該材料可以用作體內光聲成像的納米診療劑。

實施例2

在本實施例中，磁性納米診療劑由以下方法制備，具體包括以下步驟：

(1)①將2g的分子量為100,000Da的式(I)所示殼聚糖季銨鹽溶于50mL去離子水中，放置于三口燒瓶中，反應體系通氮氣30min，油浴升溫至102℃，得到反應體系a；

②取0.1459g的FeCl₃·6H₂O與0.071g的FeCl₂·4H₂O溶于2mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液中，得到溶液b；

③將溶液b注入到步驟(1)中的反應體系a，緩慢滴加濃氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流40min，得反應體系c；

④等步驟(3)中的反應體系c冷卻至室溫后，將所有反應液移至透析袋中，用去離子水在20℃～35℃透析72h后，即可得到四氧化三鐵納米粒子；

⑤將得到的四氧化三鐵納米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反應體系A；

(2)在反應體系A中加入2.5μL吡咯單體，先超聲30min，再攪拌30min后得到反應體系B；

(3)在反應體系B中逐滴加入三氯化鐵溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中攪拌反應8小時，磁傾析并用80℃去離子水洗滌三次得到四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子(Fe₃O₄@PPr)；

(4)將15mg透明質酸溶于5ml去離子水中得到透明質酸水溶液，將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系(1mL，2mg/mL)在120W的超聲功率下，滴加至透明質酸水溶液中，12000rpm離心20min并并用去離子水洗滌三次得到所述磁性納米診療劑(Fe₃O₄@PPr@HA)。

通過透射電鏡觀察，利用本法制備的納米診療劑的粒子為球形，水合粒徑的峰值為145nm左右，通過ICP-OES測得鐵原子與聚吡咯的質量比為84:100。

實施例3

在本實施例中，磁性納米診療劑由以下方法制備，具體包括以下步驟：

(1)①將1.5g的分子量為100,000Da的式(I)所示殼聚糖季銨鹽溶于50mL去離子水中，放置于三口燒瓶中，反應體系通氮氣20min，油浴升溫至110℃，得到反應體系a；

②取0.1459g的FeCl₃·6H₂O與0.1075g的FeCl₂·4H₂O溶于4mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液中，得到溶液b；

③將溶液b注入到步驟(1)中的反應體系a，緩慢滴加濃氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流30min，得反應體系c；

④等步驟(3)中的反應體系c冷卻至室溫后，將所有反應液移至透析袋中，用去離子水在20℃～35℃透析24h后，即可得到四氧化三鐵納米粒子；

⑤將得到的四氧化三鐵納米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反應體系A；

(2)在反應體系A中加入2.7μL吡咯單體，先超聲50min，再攪拌20min后得到反應體系B；

(3)在反應體系B中逐滴加入三氯化鐵溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中攪拌反應8小時，磁傾析并用80℃去離子水洗滌三次得到四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子(Fe₃O₄@PPr)；

(4)將10mg透明質酸溶于5ml去離子水中得到透明質酸水溶液，將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系(1mL，2mg/mL)在120W的超聲功率下，滴加至透明質酸水溶液中，15000rpm離心10min并并用去離子水洗滌三次得到所述磁性納米診療劑(Fe₃O₄@PPr@HA)。

通過透射電鏡觀察，利用本法制備的納米藥物復合體的粒子為球形，水合粒徑的峰值為120nm左右，通過ICP-OES測得鐵原子與聚吡咯的質量比為75:100。

實施例4

在本實施例中，磁性納米診療劑由以下方法制備，具體包括以下步驟：

(1)①將2.5g的分子量為100,000Da的式(I)所示殼聚糖季銨鹽溶于50mL去離子水中，放置于三口燒瓶中，反應體系通氮氣20min，油浴升溫至90℃，得到反應體系a；

②取0.1459g的FeCl₃·6H₂O與0.1075g的FeCl₂·4H₂O溶于3mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液中，得到溶液b；

③將溶液b注入到步驟(1)中的反應體系a，緩慢滴加濃氨水15mL，至pH＝10；在80～120℃下回流60min，得反應體系c；

④等步驟(3)中的反應體系c冷卻至室溫后，將所有反應液移至透析袋中，用去離子水在20℃～35℃透析48h后，即可得到四氧化三鐵納米粒子；

⑤將得到的四氧化三鐵納米粒子([Fe]＝2.5mg)分散在2％(w/v)的聚乙烯醇溶液中，得到反應體系A；

(2)在反應體系A中加入2.7μL吡咯單體，先超聲50min，再攪拌20min后得到反應體系B；

(3)在反應體系B中逐滴加入三氯化鐵溶液(1mL，36mg/mL)，冰浴中攪拌反應8小時，磁傾析并用80℃去離子水洗滌三次得到四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子(Fe₃O₄@PPr)；

(4)將10mg透明質酸溶于5ml去離子水中得到透明質酸水溶液，將步驟(3)得到的四氧化三鐵納米粒子摻雜的聚吡咯納米粒子溶液體系(1mL，2mg/mL)在120W的超聲功率下，滴加至透明質酸水溶液中，12000rpm離心20min并并用去離子水洗滌三次得到所述磁性納米診療劑(Fe₃O₄@PPr@HA)。

通過透射電鏡觀察，利用本法制備的納米藥物復合體的粒子為球形，水合粒徑的峰值為120nm左右，通過ICP-OES測得鐵原子與聚吡咯的質量比為75:100。

實施例5

在本實施例中，考察本發明的納米診療劑的生物相容性，具體方法如下：

以MDA-MB-231細胞為模型，通過結晶紫染色法測定MDA-MB-231細胞的存活率以檢測實施例1制備的磁性納米診療劑(Fe₃O₄@PPr@HA)的細胞毒性。將MDA-MB-231細胞接種到96孔板中，接種密度為每孔5×10³個細胞。在CO₂培養箱中培養12h后，加入不同Fe離子濃度的Fe₃O₄@PPr@HA(濃度分別取0μg/mL、0.31μg/mL、0.62μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，繼續培養24h后，棄去培養上清，用PBS洗3次，然后用4％的福爾馬林固定液固定20min，棄去固定液后，加入0.1％的結晶紫溶液，染色30min后，棄去染色液，用蒸餾水洗滌至多余的結晶紫溶液沖洗干凈。置于空氣中干燥后，加入10％的乙酸，振搖1h后，在酶標儀上測定波長595nm處的吸光度值。從圖9可以看出，第一列為對照組，即未加入納米粒子，細胞活力為100％，與對照組相比，實施例1制備的磁性納米診療劑從0.31μg/mL到20μg/mL實驗濃度范圍內對MDA-MB-231細胞的細胞量沒有顯著性影響，其細胞活力均在100％左右范圍小幅度波動，說明沒有明顯的細胞毒性，這表明本發明的磁性納米診療劑在該濃度范圍內具有良好的生物相容性。利用實施例2-4制備得到的磁性納米診療劑進行上述實驗同樣能夠得到相同的結論。

實施例6

在本實施例中，考察本發明的磁性納米診療劑的激光和高頻磁場熱療效果，方法如下：

將MDA-MB-231細胞接種到12孔板中，接種密度為每孔1×10⁴個細胞。在CO₂培養箱中培養12h后，加入不同濃度的Fe₃O₄@PPr@HA(濃度分別取0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，繼續培養24h后，棄去培養上清，用PBS洗3次后，使用激光照射3min或使用高頻磁場處理15min后，通過LIVE-DEAD試劑盒(Invitrogen公司)對細胞染色，死細胞為紅色，活細胞為綠色，檢測MDA-MB-231細胞的存活率，通過固定激光功率(例如固定在4W/cm²)來考察Fe₃O₄@PPr@HA對細胞的殺傷力隨著濃度變化的情況，通過固定Fe₃O₄@PPr@HA濃度(例如固定在200μg/mL)來考察所用激光功率的變化對細胞的存活率的影響。

由圖10A所示的檢測結果發現，當所使用激光的功率是4W/cm²時，Fe₃O₄@PPr@HA對細胞的殺傷力隨著濃度的增加而增大，在200μg/mL時，細胞的存活率僅為8％。由圖10B可知，當所用材料的濃度全部為200μg/mL時，隨著激光功率的增加，細胞的存活率在下降，在激光功率為8W cm^-2時，細胞存活率僅有4％。這些結果說明，本發明制備的納米診療劑Fe₃O₄@PPr@HA對乳腺癌細胞MDA-MB-231的殺傷具有濃度和激光功率依賴性。

從圖10C可以看出，單獨使用本發明的納米診療劑或高頻磁場(635kHz，30A，圖中簡寫為ACMF)對細胞都沒有殺傷力，而當材料濃度為200μg/mL，在高頻磁場(635kHz，30A)中處理15min后，細胞的存活率為28％。由此可以說明材料可以作為光熱治療劑和交變磁場過高熱治療劑。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的磁性納米診療劑及其制備方法和應用，但本發明并不局限于上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。