一種用于多模態診療一體化的納米體系及其制備方法與應用與流程

本發明涉及納米生物材料技術領域，具體涉及一種用于多模態診療一體化的納米體系及其制備方法與應用。

背景技術：

近些年來，熒光成像已經成為光學成像技術中的研究熱點之一，這是由于熒光成像具有靈敏度高、對細胞和生物組織無損傷等優點。其中，稀土摻雜上轉換發光納米材料作為一種新型的熒光材料引起了人們的廣泛關注，這是因為它通常是采用低能光激發(通常是近紅外光980nm、808nm)，發射出高能光(紅光、綠光、近紅外光800nm)，這些優點可以消除生物背景熒光干擾。雖然，近紅外激發的熒光成像從細胞到組織再到活體小動物都有很高的靈敏度，但畢竟其在組織中穿透深度是有限的，無法實現深層次組織和大動物的熒光成像。而磁共振成像(mri)能夠對組織進行三維成像，無穿透深度的限制，并且具有良好的空間分辨率。然而，mri成像的靈敏度不夠高，很難進行細胞和組織層次的成像。因此，將熒光成像和磁共振成像結合在一起，就可以同時實現成像的高靈敏度和高分辨率的結合。gd元素作為稀土元素的一種，既可以作為上轉換的基質材料，同時，由于gd具有7個未成對的f電子，具有很好的順磁性，被廣泛應用于t1加權磁共振成像。因此，開發具有近紅外熒光成像和mri雙模式成像探針將具有非常重要的意義。

在癌癥診療技術領域，基于抗癌藥物的化療是有效的治療手段之一。目前抗癌藥物輸送系統研究的熱點主要集中在新型介孔納米材料，但是由于這類納米材料合成重復性不好、結構可控性差、藥物負載率低、無靶向釋放等缺點，限制了其在生物領域的應用。因此，有必要去發展其他類型的藥物輸送系統。其中，由于聚乙二醇良好的水溶性和生物相容性，基于ph響應的聚乙二醇的抗癌藥物輸送系統的巨大應用前景不容忽視。然而單一的治療手段還不能滿足現在癌癥治療的需求，所以將光熱理療與化療相結合的協同雙模態治療手段，將大大提高癌癥治療的效果。但是，目前尚沒有合適的材料及技術，能夠實現這一要求。

技術實現要素：

本發明的目的在于，是針對現有技術中的不足，提供一種用于多模態診療一體化的原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系，實現多模式診斷和多模式治療一體化，即熒光成像、磁共振成像、抗癌藥物輸送和光熱理療的一體化。

本發明的目的還在于，還提供該用于多模態診療一體化的高效制備方法與應用。

本發明提供的納米金修飾的稀土上轉換納米體系，可以實現將多模式的成像用于癌癥疾病的診斷，并與多模式的治療結合在一起，從而發展多模態診斷、治療一體化，其對于癌癥的協同化療和光熱理療的技術推動作用是非常顯著的。

本發明的修飾材料采用了納米金晶體，在其他組分及制備工藝的配合下，使其不僅具有良好的生物相容性，并且具有較高的光熱轉換效率，成為了高效的光熱轉換劑，使其在原有的增強探針表面固定密度、及倍增效用之外，大幅提高了光熱轉換效果。

本發明的重點在于，采用配體交換的方法，用檸檬酸將具有核殼結構的油溶性上轉換發光納米粒子改性為水溶性，同時納米粒子表面修飾有檸檬酸配體修飾；在室溫下，通過原位晶體生長的方法，在其表面均勻生長納米金晶體，得到原位生長納米金修飾的上轉換發光納米粒子；最后，將含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇-鹽酸阿霉素鏈接到納米金表面，即得到同時具有化療和光熱理療協同作用的稀土上轉換納米體系。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種用于多模態診療一體化的納米體系的制備方法，采用原位生長納米金修飾的稀土上轉換方法，其包括如下步驟：

(1)預備表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子，用檸檬酸鈉將其改性，得到水溶性檸檬酸修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土上轉換發光納米粒子；具體預備表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子；預備檸檬酸鈉和二乙二醇原料，取檸檬酸鈉與二乙二醇進行分散混合；預備三氯甲烷和甲苯原料，取表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子加入到三氯甲烷和甲苯，進行分散混合；將上述兩種混合液混合分散，除去三氯甲烷和甲苯后，再維持2小時后，用乙醇和水離心洗滌產物，分散在高純水中，得到水溶性檸檬酸修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土上轉換發光納米粒子；

(2)預備高氯酸水(1wt％)原料，取高氯酸水(1wt％)加入到步驟(1)制得的水溶性檸檬酸修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土上轉換發光納米粒子進行分散混合；

(3)預備硼氫化鈉原料，取硼氫化鈉加入到步驟(2)制得的混合物進行分散混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液；

(4)預備硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素、氮-氮二甲基甲酰胺溶液，取硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行分散混合；

(5)預備磷酸，取磷酸加入到步驟(4)制得的混合物進行分散混合，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至pbs溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(6)取聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液；

(7)取第一分散液與第二分散液進行混合，經離心、洗滌和分散得到原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土上轉換納米體體系。

作為本發明進一步改進，所述步驟(2)至(3)具體還包括以下：

(2)預備高氯酸水(1wt％)原料，取體積比為1：1的高氯酸水(1wt％)加入到步驟(1)制得的水溶性檸檬酸修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土上轉換發光納米粒子進行混合，在室溫下避光攪拌2小時；

(3)預備500至600μl硼氫化鈉，取硼氫化鈉加入到步驟(2)制得的混合物進行混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液。

作為本發明進一步改進，所述步驟(4)至(6)具體包括以下：

(4)預備0.7至0.8g硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、0.02至0.03g鹽酸阿霉素、10ml氮-氮二甲基甲酰胺溶液，將硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行混合；

(5)預備10μl磷酸，取磷酸加入到步驟(7)制得的混合物進行分散混合，室溫下避光攪拌48h，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至pbs溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(6)取2.3至3mg聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液。

作為本發明進一步改進，所述表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子包括：nayf4：yb,er@nagdf4、nayf4：yb,tm@nagdf4、nayf4：yb,ho@nagdf4、以及nayf4：yb,er,tm@nagdf4中的一種或多種。

一種用于多模態診療一體化的納米體系，其是原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系，包括聚乙二醇鹽酸阿霉素前藥(sh-peg-dox)與原位生長納米金修飾的稀土上轉換發光納米粒子；所述聚乙二醇鹽酸阿霉素前藥(sh-peg-dox)由兩端含有硫醇和酰肼的聚乙二醇和鹽酸阿霉素制備而成；所述稀土上轉換納米粒子的表面包裹有惰性nagdf4層，并且表面包覆一層惰性nagdf4層的稀土上轉換發光納米粒子，表面還經過檸檬酸鈉改性，再在其表面原位生長納米金晶體。

作為本發明進一步改進，所述表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子包括：nayf4：yb,er@nagdf4、nayf4：yb,tm@nagdf4、nayf4：yb,ho@nagdf4、以及nayf4：yb,er,tm@nagdf4中的一種或多種。

一種用于多模態診療一體化的納米體系的應用，其特征在于，將其用作熒光成像或磁共振成像的造影劑。

一種用于多模態診療一體化的納米體系的應用，其特征在于，將其用于ph響應的藥物釋放。

一種用于多模態診療一體化的納米體系的應用，其特征在于，將其用于光熱成像。

一種用于多模態診療一體化的納米體系的應用，其特征在于，將其用于癌細胞的ph響應的藥物釋放和光熱理療雙模式治療。

本發明的優點在于：

(1)本發明提供的用于多模態診療一體化的納米體系的制備方法，采用原位生長納米金修飾的稀土上轉換方法制備納米體系，步驟少、制備過程高效、穩定、可重復性高；

(2)本發明利用檸檬酸和硼氫化鈉的還原性，得到原位生長納米金修飾的稀土上轉換發光納米粒子，該發光材料同時具有近紅外熒光成像和mri雙模式成像探針的雙重特點；

(3)本發明提高的原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系，其分散性好、生物相容性好、光熱轉化效率高；

(4)本發明提供的原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系的應用，因其具有熒光/磁共振多模式成像、抗癌藥物輸送和光熱理療的多功能應用，可以用來實現靶向診斷和多模式治療一體化。

為更清楚地闡述本發明的結構特征和效果，下面結合附圖與具體實施例來對其進行詳細說明。

附圖說明

圖1是本發明實施例1原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層的稀土鉺摻雜的上轉換納米體系的熒光光譜圖；

圖2是本發明實施例2原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層的稀土銩摻雜的上轉換納米體系的tem照片；

圖3是本發明實施例7原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層的稀土鉺/銩共摻雜的上轉換納米體系的磁共振成像圖片；

圖4是本發明實施例9原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層的稀土鈥摻雜的上轉換納米體系的熱成像照片。

圖5是本發明實施例10原位生長納米金修飾的上轉換納米體系的用于癌細胞的ph響應的藥物釋放和光熱理療雙模式治療的細胞存活率。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1

本實施例提供的一種用于多模態診療一體化的納米體系制備方法，是采用原位生長納米金修飾的稀土上轉換的方法制備，其包括以下步驟：

(1)預備粒徑在25至30nm表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鉺摻雜上轉換發光納米粒子；

(2)預備1.0g檸檬酸鈉和30ml二乙二醇，將檸檬酸鈉與二乙二醇進行混合，在氬氣中升溫至110℃，維持30min；

(3)預備三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步驟(1)中表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鉺摻雜上轉換發光納米粒子，將其加入到三氯甲烷和甲苯，進行分散混合；

(4)取步驟(3)制得的混合物與步驟(2)制得的混合物進行混合，在氬氣中升溫至130℃，混合維持1小時后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氬氣氛中升溫至170℃，保持2小時，反應結束后，用乙醇和水離心洗滌產物，分散在高純水中；

(5)預備高氯酸水(1wt％)原料，取體積比為1：1的高氯酸水(1wt％)加入到步驟(4)制得的混合物進行混合，在室溫下避光攪拌2小時；

(6)預備500μl硼氫化鈉，取硼氫化鈉加入到步驟(5)制得的混合物進行混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土鉺摻雜上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液(cit-ucnps@au)。

(7)預備0.7g硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、0.02g鹽酸阿霉素、10ml氮-氮二甲基甲酰胺溶液，將硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行混合；

(8)預備10μl磷酸，取磷酸加入到步驟(7)制得的混合物進行分散混合，室溫下避光攪拌48h，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(9)取2.5mg聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液。

(10)取第一分散液與第二分散液進行混合，經離心、洗滌和分散得到原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土鉺摻雜上轉換納米體體系(ucnps@au-dox)。

圖1是本發明實施例1所制得原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土鉺摻雜上轉換納米體系，在980nm激光激發下的熒光光譜圖，從圖中均可以觀察到位于540nm和654nm處的發射峰，對應于er³⁺的⁴s3/2/²h11/2→⁴h15/2和⁴f9/2→⁴i15/2躍遷，而980nm剛好位于生物組織的“光學窗口”，表明原位生長納米金修飾的上轉換納米體系仍然保持良好的上轉換熒光性能，非常適合于細胞和小動物活體成像。

實施例2：

本實施例提供的一種用于多模態診療一體化的納米體系制備方法，其與實施例1基本相同，其不同之處在于，其包括以下步驟：

(1)預備粒徑在25至30nm表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土銩摻雜上轉換發光納米粒子；

(2)預備1.0g檸檬酸鈉和30ml二乙二醇，將檸檬酸鈉與二乙二醇進行混合，在氬氣中升溫至110℃，維持30min；

(3)預備三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步驟(1)中表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土銩摻雜上轉換發光納米粒子，將其加入到三氯甲烷和甲苯進行分散混合；

(4)取步驟(3)制得的混合物與步驟(2)制得的混合物進行混合，在氬氣中升溫至130℃，混合維持1小時后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氬氣氛中升溫至170℃，保持2小時，反應結束后，用乙醇和水離心洗滌產物，分散在高純水中；

(5)預備高氯酸水(1wt％)原料，取體積比為1：1的高氯酸水(1wt％)加入到步驟(4)制得的混合物進行混合，在室溫下避光攪拌2小時；

(6)預備550μl硼氫化鈉，取硼氫化鈉加入到步驟(5)制得的混合物進行混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土銩摻雜上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液(cit-ucnps@au)。

(7)預備0.75g硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、0.025g鹽酸阿霉素、10ml氮-氮二甲基甲酰胺溶液，將硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行混合；

(8)預備10μl磷酸，取磷酸加入到步驟(7)制得的混合物進行分散混合，室溫下避光攪拌48h，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(9)取2.3mg聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液。

(10)取第一分散液與第二分散液進行混合，經離心、洗滌和分散得到原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土銩摻雜上轉換納米體體系(ucnps@au-dox)。

圖2是本發明實施例2中所得產品原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土銩摻雜上轉換納米體系的tem照片，從圖中可以看出上轉換納米粒子周圍均勻分布著納米金晶體，說明該方法可有有效地得到形貌良好、生長均勻的原位生長納米金修飾的稀土銩摻雜上轉換納米體系，納米材料平均粒徑約為30～50nm，因為小尺寸納米粒子更容易被細胞內吞，有利于在生物體內循環，這對于其用于生物成像和治療具有重要意義。

實施例3：

本實施例提供的一種用于多模態診療一體化的納米體系制備方法，其與實施例1及2基本相同，其不同之處在于，其包括以下步驟：

(1)預備粒徑在25至30nm表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鉺/銩共摻雜上轉換發光納米粒子；

(2)預備1.0g檸檬酸鈉和30ml二乙二醇，將檸檬酸鈉與二乙二醇進行混合，在氬氣中升溫至110℃，維持30min；

(3)預備三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步驟(1)中表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鉺/銩共摻雜上轉換發光納米粒子，將其加入到三氯甲烷和甲苯進行分散混合；

(4)取步驟(3)制得的混合物與步驟(2)制得的混合物進行混合，在氬氣中升溫至130℃，混合維持1小時后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氬氣氛中升溫至170℃，保持2小時，反應結束后，用乙醇和水離心洗滌產物，分散在高純水中；

(5)預備高氯酸水(1wt％)原料，取體積比為1：1的高氯酸水(1wt％)加入到步驟(4)制得的混合物進行混合，在室溫下避光攪拌2小時；

(6)預備600μl硼氫化鈉，取硼氫化鈉加入到步驟(5)制得的混合物進行混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土鉺/銩共摻雜上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液(cit-ucnps@au)。

(7)預備0.8g硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、0.02g鹽酸阿霉素、10ml氮-氮二甲基甲酰胺溶液，將硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行混合；

(8)預備10μl磷酸，取磷酸加入到步驟(7)制得的混合物進行分散混合，室溫下避光攪拌48h，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(9)取2.8mg聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液。

(10)取第一分散液與第二分散液進行混合，經離心、洗滌和分散得到原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土鉺/銩共摻雜上轉換納米體體系(ucnps@au-dox)。

實施例4：

本實施例提供的一種用于多模態診療一體化的納米體系制備方法，其與實施例1、2及3均基本相同，其不同之處在于，其包括以下步驟：

(1)預備粒徑在25至30nm表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鈥摻雜上轉換發光納米粒子；

(2)預備1.0g檸檬酸鈉和30ml二乙二醇，將檸檬酸鈉與二乙二醇進行混合，在氬氣中升溫至110℃，維持30min；

(3)預備三氯甲烷和甲苯原料，取50mg步驟(1)中表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土鈥摻雜上轉換發光納米粒子，將其加入到三氯甲烷和甲苯，進行分散混合；

(4)取步驟(3)制得的混合物與步驟(2)制得的混合物進行混合，在氬氣中升溫至130℃，混合維持1小時后，除去三氯甲烷和甲苯；再在氬氣氛中升溫至170℃，保持2小時，反應結束后，用乙醇和水離心洗滌產物，分散在高純水中；

(5)預備高氯酸水(1wt％)原料，取體積比為1：1的高氯酸水(1wt％)加入到步驟(4)制得的混合物進行混合，在室溫下避光攪拌2小時；

(6)預備550μl硼氫化鈉，取硼氫化鈉加入到步驟(5)制得的混合物進行混合，直至溶液至深紅色，在水溶性稀土鈥摻雜上轉換發光納米粒子表面原位生長小尺寸納米金晶體，離心、洗滌，分散在高純水中，形成第一分散液(cit-ucnps@au)。

(7)預備0.75g硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、0.03g鹽酸阿霉素、10ml氮-氮二甲基甲酰胺溶液，將硫醇聚乙二醇酰肼(mw：2000)、鹽酸阿霉素與氮-氮二甲基甲酰胺溶液進行混合；

(8)預備10μl磷酸，取磷酸加入到步驟(7)制得的混合物進行分散混合，室溫下避光攪拌48h，直至將產物在ph8.0的pbs緩沖液中透析至溶液不再變紅，經冷凍干燥，得到兩端含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇鹽酸阿霉素(sh-peg-dox)粉末；

(9)取3mg聚乙二醇鹽酸阿霉素sh-peg-dox粉末溶解于高純水中，形成第二分散液。

(10)取第一分散液與第二分散液進行混合，經離心、洗滌和分散得到原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土鈥摻雜上轉換納米體體系(ucnps@au-dox)。

實施例5：

本實施例提供的一種采用前述實施例1-4之一的方法制備的、用于多模態診療一體化的納米體系，其是原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系，其包括聚乙二醇鹽酸阿霉素前藥sh-peg-dox與原位生長納米金修飾的稀土上轉換發光納米粒子；所述聚乙二醇鹽酸阿霉素前藥sh-peg-dox由兩端含有硫醇和酰肼的聚乙二醇和鹽酸阿霉素制備而成；所述稀土上轉換納米粒子的表面包裹有惰性nagdf4層，并且表面包覆一層惰性nagdf4層的稀土上轉換發光納米粒子，表面還經過檸檬酸鈉改性后，在其表面原位生長而成的納米金晶體。

所述表面包裹有惰性nagdf4層的油溶性稀土上轉換發光納米粒子包括：nayf4：yb,er@nagdf4、nayf4：yb,tm@nagdf4、nayf4：yb,er,tm@nagdf4以及nayf4：yb,ho@nagdf4中的一種或多種。

實施例6：

本實施例提供一種將實施例1-4制得的、實施例5提供的用于多模態診療一體化的納米體系的應用，具體是將其用于熒光成像或磁共振成像的造影劑。

將該原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系作為造影劑，用于細胞熒光成像的方法，其包括以下步驟：

(1)預備實施例1原位生長的納米金修飾的包裹有惰性nagdf4層稀土鉺摻雜上轉換納米體體系，用培養基配制成含300～400μg/ml的原位生長的包裹有惰性nagdf4層納米金修飾鉺摻雜的稀土上轉換納米體系的溶液，形成第三分散液；

(2)將hela細胞在上述2ml培養基中培養0.5，1，2，4h；

(3)用磷酸緩沖液(pbs)沖洗細胞3次，將沒有被細胞吸收的納米材料洗去；

(4)將培養后的細胞在共聚焦顯微鏡上進行成像，成像過程使用0～500mw功率可調、連續波激發的穩態980nm激光器作為激發光源，收集到位于500～600nm、600～700nm的上轉換發射光，用488nm激光器作為光源，收集dox位于550-700nm的下轉換發射光。

實施例7：

本實施例提供一種將實施例1-4制得的、實施例5提供的用于多模態診療一體化的納米體系的應用，具體是將其用作制備熒光成像或磁共振成像的造影劑；該原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系用于磁共振成像的方法，其包括以下步驟：

(1)預備實施例3中原位生長納米金修飾的表面包裹有惰性nagdf4層稀土鉺/銩共摻雜上轉換納米體系，用pbs將其配制成0～4mg/ml，超聲5分鐘，分散均勻，形成第四分散液；

(2)取不同濃度的第四分散液，在磁共振儀上分別測其磁共振成像。

圖3是本發明實施例6所得原位生長納米金修飾的稀土鉺/銩共摻雜上轉換納米體系的磁共振成像圖，通過不同gd³⁺濃度對1/t1作圖并線性擬合后的到得到弛豫常數r1，證實了所得原位生長納米金修飾的稀土鉺/銩共摻雜上轉換納米體系可用于磁共振成像。

實施例8：

本實施例提供一種將實施例1-4制得的、實施例5提供的用于多模態診療一體化的納米體系的應用，具體將其用于ph響應的藥物釋放。

本實施例提供原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系用于ph響應的藥物釋放的方法，其包括以下步驟：

(1)預備實施例1原位生長納米金修飾的包裹有惰性nagdf4層稀土鉺摻雜的上轉換納米體系，不同ph值(ph4.5，6.0，7.4)的磷酸鹽緩沖溶液，3只透析管；

(2)將(1)中的納米體系用pbs配成3～4mg/ml，超聲5分鐘分散均勻，形成第五分散液；

(3)取相同濃度的第五分散液等量加入到3只透析管中，并置于不同ph的pbs緩沖溶液中，透析48h，前24h每隔2h取樣，通過檢測dox在480nm處的吸收值計算出藥物釋放量。

實施例9：

本實施例提供一種將實施例1-4制得的、實施例5提供的用于多模態診療一體化的納米體系的應用，是將其用于光熱成像。

本實施例提供原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系用于體外光熱成像的方法，其包括以下步驟：

(1)預備實施例4中的原位生長納米金修飾的包裹有惰性nagdf4層稀土鈥摻雜的上轉換納米體系，6只玻璃樣品瓶，連續激發的808nm激光器，高精度數顯溫度計，熱成像照相機；

(2)將(1)中的納米體系用pbs配成0-400μg/ml的溶液，超聲5分鐘分散均勻，形成第六分散液；

(3)分別取1ml不同濃度的第六分散液加入到6只玻璃樣品瓶中，并固定于鐵架臺上，用1.5w/cm²的808nm激光器連續照射第六分散液，并用高精度數顯溫度計每隔20s記錄下分散液的溫度，同時用熱成像照相機記錄下不同時間的第六分散液的熱成像照片。

圖4是本發明實施例8所得的用于協同化療和光熱理療的原位生長納米金修飾的稀土鈥摻雜上轉換納米體系用于光熱成像的照片，從圖中可以隨著第六分散液濃度的增大，溶液溫度升高的越高；同時，溶液的溫度也隨著照射時間延遲而升高，在8min之后，溶液的溫度已趨于穩定，超過42℃證實了該納米體系適用于癌細胞的光熱理療。

實施例10：

本實施例提供一種將實施例1-4制得的、實施例5提供的用于多模態診療一體化的納米體系的應用，是將其用于癌細胞的ph響應的藥物釋放和光熱理療雙模式治療。

本實施例提供的原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系用于癌細胞的ph響應的藥物釋放和光熱理療雙模式治療的方法，其包括以下步驟：

(1)預備實施例6中第三分散液，配制成25，50，100，200μg/ml的dmem培養基；預備實施例1中第一分散液，用dmem配制成25，50，100，200μg/ml的培養基，形成第七分散；預備與第三分散液dox濃度相當的純dox培養基，形成第八分散液；

(3)將hela細胞在上述培養基中分別培養4h；

(4)用pbs緩沖液沖洗細胞3次，將沒有被細胞吸收的納米材料洗去；

(5)將培養后的細胞在用1.5w/cm²的808nm激光器連續照射8min，間隔8min再照射一次，再在培養箱中，繼續培養24h。用cck-8法，測定細胞的存活率；同時，分別鈣黃綠素和碘化丙啶對活死細胞分別進行染色，用熒光顯微鏡分別在495nm激發下收集515nm的發射光，在528nm激發下收集617nm的激發光。

圖5是本發明實施例9所得與不同濃度的第三分散液、第七分散液和第八分散液培養過后的細胞存活率。從圖中，通過對照組，我們可以看出，當hela細胞與低濃度的第三分散液和第七分散液孵化時，其單獨藥物釋放帶來的化療作用比單獨光熱理療的效果要好，細胞存活率更低；而當hela細胞與高濃度的納米體系孵化時，單獨光熱理療的效果更好，細胞存活率更低。但是值得注意的是，不管是高濃度還是低濃度的樣品，光照下的第三分散液的細胞存活率均最低，說明該納米體系表現出良好的協同化療與光熱理療的治療效果。

本發明的重點在于，采用配體交換的方法，用檸檬酸將具有核殼結構的油溶性上轉換發光納米粒子改性為水溶性，同時納米粒子表面修飾有檸檬酸配體修飾；在室溫下，通過原位晶體生長的方法，在其表面均勻生長納米金顆粒，得到原位生長納米金修飾的上轉換發光納米粒子；最后，將含有腙鍵和硫醇的聚乙二醇-鹽酸阿霉素鏈接到納米金表面，即得到同時具有化療和光熱理療協同作用的稀土上轉換納米體系。

本發明提供的原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系，具有多模態診斷和多模式治療一體化的功能，同時具有上轉換發光成像、磁共振成像、ph響應抗癌藥物釋放和光熱理療的功能，且本發明提供的制備方法，具有工藝緊湊、高效、操作方便、結構易控、可重復性好等優勢；本發明提供的納米材料及應用，具有多種用途，并可以顯著提升診療效果，可以實現對于癌癥的協同化療和光熱理療。

本發明不限于上述實施方式，采用與其相同或相似方法所得的其他原位生長納米金修飾的稀土上轉換納米體系的方法，如不同稀土離子摻的上轉換納米晶(nayf4:yb,er；nagdf4:yb,er；nagdf4:yb,tm等)、用于改性油溶性上轉換納米粒子的不同有機配體、不同結構的抗癌藥物等均在本發明保護范圍內。