一種用于去除組織細胞的試劑盒和去細胞方法與流程

本發明涉及組織工程材料領域，更特別地，涉及一種用于去除組織細胞的試劑盒以及去細胞方法。

背景技術：

去細胞生物支架被廣泛用于組織工程與再生醫學中，目前應用于臨床和臨床前期研究的組織工程瓣膜支架材料亦主要為去細胞生物支架。然而免疫原性是阻礙異種去細胞生物支架應用于臨床的最大障礙。

CryoLife公司在臨床上推出了兩種去細胞瓣膜(SynerGraft)：CryoValve(同種異體去細胞主動脈瓣膜)和500/700(異種豬去細胞瓣膜)。CryoValve去細胞瓣膜自2000年已應用于超過5700例患者，近期臨床結果較為滿意。而同種異體主動脈瓣膜的最大不足是由于供體短缺而造成來源稀少。因此來源于豬或牛的異種組織因其來源廣泛且與人體組織成分和性能相似，常用于去細胞瓣膜的構建。然而，異種豬瓣制備的500/700去細胞瓣膜用于4例患兒的右室流出道重建術，3例患兒均在術后一年內死亡，死因與強烈的免疫排斥反應導致瓣膜衰敗相關。隨后，異種組織來源的去細胞瓣膜在臨床上的應用已寥寥無幾。由此可見，異種組織的免疫原性是阻礙異種組織去細胞生物支架進一步應用于臨床的關鍵難題。

異種組織的免疫原性主要來源于細胞，因此去細胞可降低異種組織的免疫原性。目前去細胞基質的制備方法主要包括物理方法如壓力法、凍融法，化學試劑如去污劑、有機溶劑，生物制劑如酶類等。多種去細胞方法均可完全地去除組織中的細胞成分，然而在這些方法處理的去細胞生物支架中仍可檢測到異種抗原如α-Gal、MHC I，這些抗原的存在最終導致去細胞生物支架植入體內后發生免疫排斥反應和迅速衰敗。單純地去除組織的細胞成分難以最大限度地降低其免疫原性，這提醒我們需另辟蹊徑。此外，目前應用的去細胞試劑和去細胞方法對瓣膜的結構和力學性能均造成不同程度的破壞，這些損傷可能會導致去細胞瓣膜植入體內后發生功能不全或迅速衰敗。

因此，需要一種新的去細胞生物支架的制備方法和試劑，其不僅能去除異種組織的免疫原性，而且能最大限度地保留細胞外基質成分與力學性能。

技術實現要素：

為解決以上問題，本發明提供了一種一種用于去除組織細胞的試劑盒，其由A液、B液和C液組成，其中所述A液為親水性去細胞溶液，為3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-propanesulfonate,CHAPS)為濃度5-50g/L并且磷酸三丁酯(tri(n-butyl)phosphate,TnBP)濃度為1-5mM的20-100mM的TRIS-HCl緩沖液；所述B液為CHAPS濃度為5-50g/L、TnBP濃度為1-5mM、脒基磺基甜菜堿(amidosulfobetaine 14,ASB-14)濃度為5-50g/L并且硫代甜菜堿10(sulfobetaine 3-10,SB 3-10)濃度為5-50g/L的20-100mM的TRIS-HCl緩沖液；并且所述C液為全能核酸酶溶液。

優選地，在所述A液中，所述CHAPS的濃度為20g/L，所述TnBP的濃度為2mM，所述TRIS-HCl的濃度為40mM，并且所述A液的pH值為7.8。

優選地，在所述B液中，所述CHAPS的濃度為20g/L，所述TnBP的濃度為2mM，所述ASB-14的濃度為10g/L，所述SB3-10的濃度為20g/L,所述TRIS-HCl的濃度為40mM，并且所述B液的pH值為7.8。

優選地，所述全能核酸酶溶液的溶劑為pH值為8.0的50mM Tris-HCl緩沖液，并且所述全能核酸酶的濃度為100unit/ml。

優選地，所述全能核酸酶溶液中還包含1mM的MgCl₂。

本發明還提供了一種用于去除組織細胞的去細胞方法，使用上述試劑盒處理所述組織，包括用所述A液、B液和C液依次浸泡所述組織的步驟。

進一步地，所述方法包括以下步驟：

S1：用所述A液處理所述組織；

S2：用無菌水漂洗經S1處理的所述組織；

S3：用所述B液處理經S2處理的所述組織；

S4：用PBS漂洗經S3處理的所述組織；

S5：用所述C液處理經S4處理的所述組織；

S6：用PBS漂洗經S5處理的所述組織，即得到去細胞的生物支架。

優選地，所述方法包括以下步驟：

S1：將所述組織浸沒于所述A液中，于室溫下持續振蕩24小時；

S2：用無菌水漂洗經S1處理的組織6次，每次10分鐘；

S3：將經S2處理的組織浸沒于所述B液中，于室溫下持續振蕩24小時；

S4：用PBS漂洗經S3處理的組織4次，每次6小時；

S5：將經S4處理的組織浸沒于所述C液中，于37℃下持續振蕩24小時；

S6：用PBS漂洗經S5處理的組織4次，每次6小時，即得到去細胞的生物支架。

優選地，所述組織為豬主動脈瓣膜。

本發明還提供了一種去細胞生物支架，其通過上述方法得到。

通過本發明所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有益效果。

(1)異種抗原主要是蛋白質，本發明利用蛋白溶解的原理，以連續水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法制備得到本發明的異種組織去細胞生物支架。其中，親水性去細胞溶液中包含CHAPS和TnBP，被用來溶解和去除異種組織中的水溶性抗原；而親脂性去細胞溶液除CHAPS和TnBP提供水溶性蛋白的溶解外，SB 3-10和ASB-14被用來去除異種組織中的脂溶性蛋白。全能核酸酶，能降解所有形式(包括單鏈、雙鏈、線性和環狀)的DNA和RNA而沒有蛋白裂解活性，在廣泛條件范圍具有很高的特異性。

(2)本發明采用連續水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除豬主動脈瓣膜的細胞成分，較好地保留了豬主動脈瓣膜結構和細胞外基質成分(膠原纖維、彈性纖維、糖胺聚糖)，對力學性能影響小，組織結構及力學性能接近正常組織。

(3)本發明采用連續水溶性蛋白溶解以及脂溶性蛋白溶解的方法可有效去除豬主動脈瓣膜中的異種抗原α-Gal和MHC I，其處理的瓣膜在體外能降低白細胞的激活。表明該方法可降低機體對去細胞瓣膜的免疫反應。此外，基于蛋白溶解的去細胞方法能夠不僅去除α-Gal，還能去除一些未知的非α-Gal異種抗原，從而改善去細胞生物支架的生物相容性。

(4)本發明獲得的去細胞生物支架具有良好的生物相容性，植入大鼠體內后發生了組織重塑，表現為植入物大量降解，原組織結構不明顯，較為規則的結締組織形成，組織中央可見肌細胞，且不易發生鈣化。

(5)本發明的異種組織去細胞生物支架制備周期短、費用低，并可制備成不同規格，優于以往異種去細胞基質，具有很好的臨床應用前景。

附圖說明

圖1為天然瓣膜和去細胞瓣膜DAPI染色的顯微照片；

圖2為是天然瓣膜和去細胞瓣膜組織學染色(HE、Masson、VVG染色)的顯微照片(F:Fibrosa纖維層；S:Spongiosa疏松層；V:Ventricularis心室層，箭頭指示彈性纖維)；

圖3為天然瓣膜和去細胞瓣膜的掃描電鏡照片；

圖4為天然瓣膜和去細胞瓣膜的含水量統計圖；

圖5為天然瓣膜和去細胞瓣膜的膠原蛋白含量統計圖；

圖6為天然瓣膜和去細胞瓣膜的彈性蛋白含量統計圖；

圖7為天然瓣膜和去細胞瓣膜的糖胺聚糖含量統計圖；

圖8為去細胞瓣膜的大體形態以及力學性能檢測時周向和徑向樣本制備示意圖；

圖9為天然瓣膜和去細胞瓣膜的極限拉伸應變；

圖10為天然瓣膜和去細胞瓣膜的極限抗張強度；

圖11為天然瓣膜和去細胞瓣膜的彈性模量；

圖12為免疫熒光檢測天然豬主動脈瓣膜和去細胞瓣膜上α-Gal表達的結果；

圖13為免疫熒光檢測天然豬主動脈瓣膜和去細胞瓣膜上MHC I表達的結果；

圖14為天然豬主動脈瓣膜和去細胞瓣膜刺激PMN彈性蛋白酶的分泌水平；

圖15為天然豬主動脈瓣膜和去細胞瓣膜刺激SC5b-9的分泌水平；

圖16為天然豬主動脈瓣膜和去細胞瓣膜植入大鼠體內6周后HE和Masson染色照片；

圖17為戊二醛固定瓣膜和去細胞瓣膜植入大鼠體內6周后植入物中浸潤的巨噬細胞免疫組化染色照片；

圖18為天然豬主動脈瓣膜、去細胞瓣膜和戊二醛固定瓣膜植入大鼠體內6周后鈣染色照片；

圖19為天然豬主動脈瓣膜、去細胞瓣膜和戊二醛固定瓣膜植入大鼠體內6周后鈣定量檢測統計圖。

具體實施方式

以下結合實例對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。

實施例1用于去細胞的試劑盒的制備

表1.A液(親水性去細胞溶液)的配置

按照上表的配方，將精準稱量的試劑加入干凈的廣口玻璃瓶中，搖床上振蕩0.5～1h，使試劑充分溶解，制備成親水性去細胞溶液(TnBP試劑因破壞性較強，最后加入，且現配現用)。

表2.B液(親脂性去細胞溶液)的配制

將精準稱量的試劑加入干凈的廣口玻璃瓶中，搖床上振蕩0.5～1h，使試劑充分溶解，制備成去細胞溶液(TnBP試劑因破壞性較強，最后加入，且現配現用)。

SB 3-10是一種兩性離子型硫代甜菜堿，對溶解細胞膜蛋白具有超強的能力。ASB-14是一種兩性離子型脒基磺基甜菜堿，它能促進多種脂溶性蛋白如紅細胞帶3蛋白的溶解。雖然SB 3-10和ASB-14均屬于具有長線性末端的甜菜堿類兩性離子去污劑，但它們溶解蛋白的質量與類型各具特點。SB3-10傾向于溶解不同類別的酸性蛋白，而ASB-14對中性和堿性蛋白具有強烈的溶解作用，可用于去除異種組織中的脂溶性蛋白。

C液為含有1mmol/L MgCl2和100units/ml全能核酸酶的TRIS-HCI緩沖液(50mmol/L，pH 8.0)。

實施例2使用實施例1的試劑盒進行去細胞處理

豬主動脈瓣膜的獲取：在屠宰場清潔條件下獲取豬心并置于含肝素的冷生理鹽水中快速轉運至實驗室。在豬死亡的1h內，無菌條件下裁剪豬主動脈瓣膜，置于4℃含抗生素(100U/ml青霉素,250mg/ml兩性霉素B和100mg/ml鏈霉素)的高糖DMEM培養基中12h。

去細胞步驟：豬主動脈瓣膜的去細胞過程在六孔板中進行，每孔的工作容量為4ml且最多放置3片瓣膜。以親水性去細胞溶液進行去細胞處理：將豬主動脈瓣置于含有20g/L CHAPS和2mmol/L TnBP的TRIS-HCI緩沖液(40mmol/L,pH 7.8)中，在室溫下持續震蕩去細胞處理24h。以無菌水漂洗6次，每次10分鐘。以親脂性去細胞溶液進行去細胞處理：再將其置于含有20g/L CHAPS、2mmol/L TnBP、10g/L ASB-14和20g/L SB 3-10的TRIS-HCI緩沖液(40mmol/L,pH 7.8)中，在室溫下繼續震蕩去細胞處理24h。以核酸酶繼續處理：先將去細胞瓣膜以PBS漂洗4次，每次6h。然后置于含有1mmol/L MgCl₂和100units/ml全能核酸酶的TRIS-HCI緩沖液(50mmol/L,pH8.0)中，在37℃持續震蕩下繼續處理24h；最后以PBS漂洗4次以去除殘余的試劑及細胞碎片，每次6h，后置于含抗生素的PBS中，4℃保存備用。

以下為通過上述方法得到的去細胞的豬主動脈瓣膜性能檢測

1.組織學檢測

組織學染色與掃描電鏡檢測瓣膜組織結構的變化。去細胞瓣膜(sequential hydrophile and lipophile solubilization,SHLS)和天然瓣膜(NATIVE)以4％多聚甲醛緩沖液固定24h后，梯度脫水，常規石蠟包埋，切片厚度5μm，以試劑盒常規染色。DAPI染色用于評價不同去細胞方法對細胞核的去除作用。如圖1所示，在天然豬主動脈瓣膜(NATIVE)中，可見大量呈藍色熒光的細胞核；在去細胞瓣膜(SHLS)中，未見任何細胞核的成分。HE、Masson以及VVG染色用來評價去細胞方法對瓣膜結構的影響：Masson染色主要用來觀察膠原纖維的變化、而VVG染色用來觀察彈性纖維的變化。去細胞瓣膜(SHLS)中，HE染色未見任何細胞核成分，瓣膜的三層結構與天然瓣膜(NATIVE)相仿，Masson染色顯示三層結構中的膠原纖維保存良好，VVG染色顯示心室層的彈性纖維輕度減少(圖2)。掃描電鏡檢測用來觀察瓣膜的微觀結構。去細胞瓣膜(SHLS)表面未見任何細胞成分，結構保留良好，膠原纖維排列較為整齊(圖3)。

2.細胞外基質成分含量檢測

含水量：取出各組瓣膜樣本(n＝6，n為檢測樣本的個數，以下n的含義相同)，以濾紙盡量吸干瓣膜表面的樣品保存液，稱取200mg待測組織，剪碎，置于-80℃冷凍1h，然后凍干36h。再次稱重，得到樣本的干重(dry weight,DW)，通過比較濕重與干重求各組樣本的含水量。去細胞瓣膜(SHLS)的含水量(93.33±1.46％)顯著高于天然瓣膜(NATIVE)的含水量(87.32±1.61％,p<0.05)。該結果表明去細胞處理會增加瓣膜的含水量(圖4)。

膠原蛋白含量：取稱各組瓣膜(n＝6)干重為200mg的待測組織，以6mmol/l鹽酸(1ml/10mg)在106℃下溶解24h；水解產物與氯胺T在20℃下反應20min；加入對二甲基氨基苯甲醛，60℃水浴15min；以分光光度計在550nm處測量吸光度值；以不同濃度羥脯氨酸標準品的結果繪制標準曲線，計算各組瓣膜的膠原蛋白含量。去細胞瓣膜(SHLS)的膠原蛋白含量(55.21±5.43％per DW)與天然瓣膜(NATIVE)的膠原蛋白含量(50.43±3.59％per DW)差異無統計學意義。該結果表明該去細胞處理對瓣膜的膠原蛋白含量無顯著影響(圖5)。

彈性蛋白含量：稱取各組瓣膜(n＝6)干重為200mg的待測樣品，以0.25mol/l草酸在100℃消化1h。冷卻，離心收集懸浮液。草酸重復消化提取3次，合并懸浮液。以彈性蛋白測定試劑盒測定瓣膜的彈性蛋白含量：去細胞瓣膜(SHLS)的彈性蛋白含量(8.00±0.79％per DW)顯著低于天然瓣膜(NATIVE)的彈性蛋白含量(9.16±0.46％per DW,p<0.05)(圖6)。

糖胺聚糖(GAGs)含量：稱取各組瓣膜(n＝6)干重為200mg的待測樣品，剪碎。加入木瓜蛋白酶溶液10ml，60℃溶解消化3h。待測樣品溶解后，以磷酸二氫鉀溶液定容至20ml，加入1,9二甲基亞甲藍染料各200ul。以分光光度計在540nm處測定各樣品的吸光度值。不同濃度的硫酸軟骨素標準品用于標準曲線的繪制，計算各待測樣品的GAGs含量。以糖胺聚糖測定試劑盒測定瓣膜的糖胺聚糖含量：去細胞瓣膜(SHLS)的糖胺聚糖含量(2.20±0.12％per DW)顯著低于天然瓣膜(NATIVE)的糖胺聚糖含量(2.46±0.12％per DW,p<0.05)(圖7)。

3.力學性能測試

應用單軸拉伸試驗進行天然瓣膜(NATIVE)和去細胞瓣膜(SHLS)(n＝6)力學性能的測定。將瓣膜在周向(circumferential direction)和徑向(radial direction)分別剪成15mm×5mm長條狀的樣本(圖5)，以電子游標卡尺測量每個樣本的標距、寬度及厚度。將樣本固定在力學檢測儀的樣本夾上，室溫下以5mm/min的速度勻速向兩端伸拉至樣本斷裂，測試過程中以PBS保持樣本濕潤，通過換能器記錄樣本的應力-應變曲線并計算極限抗張強度、極限拉伸應變以及彈性模量。結果顯示：去細胞瓣膜在周向(78.02±9.82mm/mm)和徑向(119.6±14.09mm/mm)的極限拉伸應變均顯著高于天然瓣膜在周向(52.13±5.57mm/mm)和徑向(96.95±6.23mm/mm)的極限拉伸應變(p<0.05)(圖9)。去細胞瓣膜在周向(7.43±0.70MPa)和徑向(1.45±0.25MPa)的極限抗張強度與天然瓣膜在周向(7.77±0.37MPa)和徑向(1.59±0.16MPa)的差異無統計學意義(圖10)。去細胞瓣膜在周向(19.13±3.61MPa)和徑向(2.17±0.39MPa)的彈性模量與天然瓣膜在周向(21.10±3.14MPa)和徑向(2.40±0.19MPa)的無顯著差異(圖11)。

4.體外異種抗原及免疫原性

去細胞瓣膜和天然瓣膜以4％多聚甲醛緩沖液固定24h后，梯度脫水，常規石蠟包埋，切片厚度5μm，以免疫熒光染色檢測去細胞瓣膜及天然瓣膜中異種抗原(α-Gal和MHC I)的表達：免疫熒光染色結果顯示天然豬主動脈瓣膜(NATIVE)中可檢測到大量攜帶紅色熒光的α-Gal與藍色熒光的細胞核。去細胞瓣膜(SHLS)中未見細胞核的存在，亦未檢測到α-Gal抗原的表達(圖12)。免疫熒光染色結果顯示天然豬主動脈瓣膜(NATIVE)中可檢測到大量攜帶綠色熒光的MHC I與藍色熒光的細胞核。在去細胞瓣膜(SHLS)中未見細胞核的存在，亦未檢測到MHC I的表達(圖13)。該結果提示去細胞方法可完全去除異種抗原α-Gal和MHC I。

天然豬主動脈瓣膜(NATIVE)和去細胞瓣膜(SHLS)分別與人血孵育進行體外免疫原性檢測。通過ELISA法分別檢測PMN彈性蛋白酶和SC5b-9評估白細胞和補體系統的激活。去細胞瓣膜的PMN彈性蛋白酶水平(116.7±23.11ng/ml)顯著低于天然瓣膜的PMN彈性蛋白酶水平(206.0±39.14ng/ml,p<0.05)(圖14)。SC5b-9是一個常用來評估炎癥反應時補體激活水平的指標。在去細胞瓣膜和天然瓣膜間，SC5b-9水平差異無統計學意義(圖15)。

5.去細胞瓣膜的組織相容性

應用大鼠腹壁缺損模型來評價去細胞瓣膜的組織相容性，以0.3％戊巴比妥鈉(10ml/kg)對SD大鼠進行腹腔麻醉。腹部備皮并以碘伏消毒。左腹旁正中做一長約1cm的縱行切口，蚊鉗鈍性分離皮下組織，暴露腹側腹壁。切除部分腹壁內外斜肌，保留腹膜、橫行肌筋膜完整，建立一個大小為1cm×1cm的腹壁缺損。然后應用各組的瓣膜對腹壁缺損進行修補：4-0Prolene不可吸收性縫合線將瓣膜的四個角分別固定于相鄰的腹壁肌肉，以利于取出植入物時區分邊界。盡可能使用較少縫線以免發生線結反應。皮膚切口以4-0可吸收縫線間斷縫合。術后動物在電熱毯上進行麻醉后恢復。每天觀察傷口是否有腫脹或感染并作記錄。分別于術后6周處死大鼠，取出植入物和毗鄰組織，用于組織學染色和鈣含量檢測。結果顯示去細胞瓣膜(SHLS)植入體內6周后，去細胞瓣膜表現為植入物大量降解，原組織結構基本消失，較為規則的細胞外基質形成，組織中央可見肌細胞(圖16)。免疫組化結果顯示去細胞瓣膜(SHLS)以抗炎型M2巨噬細胞(CD206+)浸潤為主，可促進植入物組織重塑(圖17)。對術后6周取出的植入物行硝酸銀染色，去細胞瓣膜(SHLS)中未見硝酸銀陽性染色結果(圖18)。以原子吸收法測定術后6周各組植入物中的鈣含量，結果提示去細胞瓣膜(SHLS)中的鈣離子含量(0.85±0.22μg/mg)，顯著低于天然瓣膜組(NATIVE)(5.92±1.33μg/mg)和戊二醛交聯瓣膜組(GA)(25.59±3.27μg/mg)(圖19)(p<0.05)。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。