兩種含氮雜環酯類化合物在制備抗腸道病毒71型藥物中的應用的制作方法

本發明屬于抗病毒藥物領域，具體涉及兩種含氮雜環酯類化合物在制備抗腸道病毒71型的藥物中的應用。

背景技術：

腸道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員，是引起嬰幼兒手足口病的最主要病原體之一，有時伴有嚴重的中樞神經系統并發癥，包括無菌性腦膜炎，腦炎，脊髓灰質炎樣麻痹，神經性心肺衰竭等，甚至導致死亡。自1974年首次報道以來，EV71感染性疾病已在世界范圍內多次爆發與流行，在亞太地區尤其是我國形勢嚴峻。鑒于手足口病的傳播流行給我國人民生命和健康帶來的極大危害，我國政府已于2008年將手足口病列為丙類傳染病納入管理，并制定一系列相關法律法規，嚴控手足口病的流行傳播。目前對于由EV71感染的疾病治療沒有特效藥物，相關的疫苗于2015年才上市，其預防效果還有待進一步調查。因此開發特異有效的抗EV71藥物勢在必行。

酯類化合物是一類重要的精細化工產品，廣泛應用于藥物、材料、食品、增塑劑、溶劑等化工行業。本申請人所在項目組自主合成了上述兩種具有新型結構的含氮雜環酯類化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公開了這幾種芳香酯化合物的制備方法。未對其生物學活性進行評價。

技術實現要素：

本發明的目的是提供含氮雜環酯類化合物在制備抗腸道病毒71型的藥物中的應用，所述的含氮雜環酯類化合物WY209、WY210，其結構式如下式：

本發明在細胞水平發現WY209、WY210可以強烈抑制EV71病毒引起的細胞病變效應，增強感染細胞的存活率，降低子代病毒產量，并且可以抑制病毒感染引起的細胞凋亡。

本發明的第二個目的是提供一種抗腸道病毒71型的藥物，包含有效劑量的作為活性成份的化合物WY209、WY210中的任意一種，或它們的鹽，和藥學上可以接受的載體。

進一步地，所述藥物制劑是顆粒劑、片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑或分散劑。

由此表明化合物WY209、WY210有制備抗EV71感染的特異治療藥物的潛力，具有臨床應用前景。

本發明的含氮雜環酯類化合物的制備，參照文獻Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具體以過渡金屬鈀為催化劑，在吡啶的鄰位誘導作用下，在芳環的鄰位用高價碘苯作用，進行芳酰氧基化，得到最終酯化產物。

本發明具有以下優點：

1、這些化合物合成原料價格低廉，易于購得；合成工藝簡單，經濟快速，易于大規模生產推廣。

2、從結構相似的化合物中尋找抗EV71藥物，易于通過構效關系探討確認其作用靶點，為進一步藥物開發提供有價值的導向作用。

附圖說明

圖1是化合物WY209和WY210對于EV71作用的RD細胞存活率的影響。

圖2是WY209和WY210對于EV71引起的RD細胞CPE的抑制效應。

圖3是WY209和WY210對于EV71引起的RD細胞凋亡的抑制作用。

圖4是WY210對于EV71子代病毒產量的抑制作用。

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。

在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。

【實施例1】對2種含氮雜環酯類化合物抗EV71活性進行評估

1、試驗方法：

1.1化合物對于宿主RD細胞的毒性

將RD細胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養箱培養長滿單層后，棄去細胞培養液，分別加含不同濃度測試化合物的細胞維持液繼續培養，48h后顯微鏡目測并分別記錄其細胞毒性，MTT法測定細胞存活率。SPSS 11.5軟件計算藥物對于細胞的半數中毒濃度(Median cyctoxic concentration，CC50)。細胞存活率＝(藥物組平均OD₄₉₂值/細胞對照組平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2化合物對于EV71的抑制活性

將RD細胞鋪板96孔板，在37℃，5％CO₂培養箱培養長滿單層后，棄去培養液，100TCID50的EV71病毒液感染細胞1h，加入不同濃度的測試化合物(利巴韋林作為陽性對照藥物)孵育細胞。待繼續培養約48h，病毒對照孔出現90％左右的CPE病變時，顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)。CPE的觀察記錄方法：無細胞病變記做-，25％以下細胞病變記做+，25％-50％細胞病變記做++，50％-75％細胞病變記做+++，75％以上細胞病變記為++++。

CPE觀察完畢后，利用MTT方法檢測藥物對EV71的抑制率。具體步驟為：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等體積的DMSO溶解沉淀。用酶標儀在492nm處讀取所對應的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式計算藥物對EV71的抑制率。用SPSS 11.5軟件計算藥物的半數有效濃度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3藥物的治療指數(SI)

SI＝CC50/EC50。治療指數越高，說明抗病毒潛力越大。

2、試驗結果

表1具有新型結構的酯類化合物細胞毒性及抗EV71活性

化合物細胞毒性及抗EV71活性測試結果如表1所示。濃度依賴的化合物對于EV71作用的RD細胞存活率的影響如圖1所示。本發明檢測到WY209和WY210對于EV71有強的抑制活性，優于陽性對照化合物利巴韋林。其中WY210有更好的抑制效果，WY209抗EV71活性有所下降，但毒性也明顯降低，所以兩種化合物有較高且相似的治療指數。化合物WY209和WY210抑制EV71引起的RD細胞CPE效應如圖2所示。EV71感染的RD細胞變圓，從細胞板壁脫離，WY209和WY210(40μg/mL)處理對于其病變效應有一定的抑制作用，WY210有強的抑制效果，可以幾乎完全抑制EV71引起的RD細胞病變效應，抑制率達94％。

【實施例2】WY209和WY210對于EV71引起的RD細胞凋亡的抑制作用

1、試驗方法

對數生長期的RD細胞鋪板24孔板，長滿單層后100TCID50EV71感染細胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY209和WY210的細胞維持液。大約48h后，收集細胞，運用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒在流式細胞儀上進行細胞凋亡的檢測。

2、試驗結果

實驗結果如圖3表明，40μg/mL WY209和WY210可以有效抑制EV71導致的細胞凋亡。在病毒對照組細胞凋亡率為85.96％(圖3-b)，正常未處理細胞凋亡率0.83％的情況下(圖3-a)，40μg/mL WY209和WY210處理的細胞凋亡率分別有19.17％和11.84％(圖3-c，d)，可見WY209和WY210可以有效保護EV71導致的細胞凋亡。

【實施例3】WY210對于EV71子代病毒產量的抑制作用

1、試驗方法

對數生長期的RD細胞鋪板24孔板，長滿單層后100TCID₅₀EV71感染細胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗滌三次，加入含40μg/mL WY210的細胞維持液。48h后收集細胞和上清培養液，-20℃和37℃三次凍融裂解后，TCID₅₀方法測定EV71病毒滴度。

2、試驗結果

如圖4所示，WY210處理的RD細胞相對于病毒對照組，其病毒滴度顯著下降，說明了化合物對于EV71子代病毒產量強烈的抑制作用。

綜上所述，具有新型結構的酯類化合物WY209和WY210具有較強的抑制EV71活性，其中WY210具有更佳的抑制效果，可以強烈抑制EV71病毒在RD細胞中的復制，有潛力制備一種臨床上有效對抗EV71感染的藥物。