醫藥組成物作為制備抗凝血藥物的應用的制作方法

本發明有關于一種醫藥組成物作為制備抗凝血藥物的應用。
背景技術：
：凝血(coagulation，也被稱作clotting)為血液由液體轉變為膠體的過程。其潛在地導致血液凝固，停止血液自受損的血管流失，并接著進行修復。凝血的機制包括血小板的活化、附著、及聚集，伴隨著纖維蛋白的沉積和成熟。凝血在生物中被高度地保留。在所有哺乳動物中，凝血都包括細胞(血小板)和蛋白(凝血因子)成分。對人類的凝血系統的研究最為廣泛且最為人們所理解。凝血的疾病為導致流血(出血或瘀血)的疾病狀態或阻塞性凝血(血栓)。例如，血栓(包括靜脈栓塞及動脈栓塞)。特別是，靜脈栓塞包括像是深層靜脈栓塞(deepveinthrombosis)、肝門靜脈栓塞(portalveinthrombosis)、腎靜脈栓塞(renalveinthrombosis)、頸靜脈栓塞(jugularveinthrombosis)、巴德-希亞利癥候群(budd-chiarisyndrome)、潘-史癥候群(paget-schroetterdisease)、腦靜脈竇栓塞(cerebralvenoussinusthrombosis)、海綿竇栓塞(cavernoussinusthrombosis)、及動脈栓塞包括像是中風和心肌梗塞。近來，臨床上最常使用的抗凝血劑包括肝素(heparin)和香豆素(coumarin)。肝素活化抗凝血酶iii，其會依序抑制凝血因子xiia、xia、ixa、xa、和iia。香豆素為一種口服抗凝血劑，其會消耗維他命k。另一方面，敗血性休克(septicshock)是一種危及生命的細菌感染并發癥。嚴重敗血癥和敗血性休克為院中感染病患致死的主因之一。所謂的敗血癥是指全身性發炎狀態，稱為全身性發炎反應癥候群(systemicinflammatoryresponsesyndrome；sirs)，并且存在明顯的感染。因為凝血系統的大量活化，敗血性休克經常并發泛發性血管內血液凝固癥(disseminatedintravascularcoagulation；dic)。當人體本身也對敗血性休克提供治療，許多生物分子會參與在抗凝血途徑中，像是活化型蛋白質c。敗血性休克的主要癥狀包括發燒、寒顫、高呼吸頻率、以及意識不清/昏迷等，也包括升高或降低的體溫(超過或38.3℃低于36℃)、心跳超過每分鐘90下、呼吸頻率超過每分鐘20次、以及白血球細胞數量超過12,000/cu.mm或少于4,000/cu.mm。敗血癥更糟的情況可能會導致低血壓、低血液灌流、以及多重器官衰竭，可能包括尿流量降低(腎臟衰竭)、肝功能異常、以及黃疸。這種因為血流不足所造成的重要器官功能異常情形被稱為敗血性休克。在細菌感染的情況下，宿主免疫細胞的活化隨著細胞激素及非細胞激素媒介的釋放而發生，最有名的是腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、介白素1(il-1)、以及介白素6(il-6)。這些因子與全身性發炎反應的泛發性活化有所關聯。因此，具有血管擴張及內毒素性質的媒介(包括前列腺素、血栓素a2、以及一氧化氮)全身性地釋放。這樣的結果造成血管舒張及內皮損傷，進而導致低血壓及微血管滲漏。此外，細胞激素活化凝血途徑，導致微血管栓塞及末端器官缺血。對于敗血性休克的數種治療方法已有許多研究，包括類固醇、重組apc(活化型蛋白質c)、以及許多化學化合物。蛋白質c為主要的抗凝血化合物，其功能類似維他命k依賴性絲氨酸蛋白酶。蛋白質s作為蛋白質c的輔因子，對凝血因子v和viii去活化。蛋白質c和凝血酶結合至細胞表面蛋白凝血酶調節素后，蛋白質c被活化。活化型蛋白質c和作為輔因子的蛋白質s及磷脂質降解凝血因子v和viii，從而抑制凝血。根據bernardgretal.,2001，重組人類活化型蛋白質c具有抗血栓、抗發炎、及前纖維蛋白溶解性質。根據較早的報導，已知apc可保護動物和人類免于敗血性休克。然而，apc的影響仍待探索。naciras已證實apc的治療功效，避免由脂多糖(lps)所誘導的血壓下降，且在大鼠中改善血管高反應性及心肌功能。此功效與nf-κb、inos、及mmp-9降低的正調控相關(nacirasetal.,crit.caremed.2009january；37(l):246-55)。雖然有效，但是大量隨機的臨床試驗顯示患有敗血性休克的病患死亡率僅減少6.1％(從30.8％減少至24.7％)，且發揮功效的同時也伴隨著副作用存在(bernardg.r.etal.,nengljmed2001,8；344(10):699-709)。另外，于2011年10月25日，經大量研究后發現，市場上的elililly&co.生產的xigris(apc的商品名)對于敗血癥的治療不具有功效(“xigris(drotrecoginalfa(activated))因不具功效而于2012年自動下架”。新聞稿，倫敦，英國：europeanmedicinesagency.25october2011。2011年10月26日檢索并存取原始檔)。此外，美國專利號us.pat.no.4,388,318揭露一種以嘧啶并-嘧啶衍生物治療內毒素休克的方法。由于大腸桿菌(e.coli)內毒素可能透過中樞神經系統的自體血壓調節回路發揮其降血壓功效，所以施予嘧啶并-嘧啶衍生物將會對髓質心血管調節系統產生升血壓功效。美國專利號us.pat.no.6,011,066揭露一種用來治療敗血性休克的具有化學式c2h2r1r2r3nh2的胺類化合物及其化學結構，其中r1和r2為擇自于氫、烴、羧基、胺基、或碳數為1～8的烷基，且r3為擇自于氫、烴、羧基、苯基及經取代的苯基、丙烯酰胺、碳數為3～8的烷基胺、烷基氨基羧酸、或其有效量的鹽類、酯類、或溶劑合物。胺基化合物是經由口服或經腸胃外施予一個體。美國專利號us.pat.no.8,557,873揭露一種以異戊胺(ia)治療敗血性休克或內毒素血癥(endotoxemia)的方法。然而，其機制仍未知。如上所述，有各式各樣的疾病與凝血相關，且凝血系統的大量活化造成的泛發性血管內血液凝固癥(dic)影響敗血性休克。而且，凝血病變已被認為是心血管疾病的部分原因。因此，需要一種對于抑制凝血具有有效生物活性的治療方法。技術實現要素：本發明一實施例提供一種醫藥組成物作為制備抗凝血藥物的應用，其中該醫藥組成物包括式(i)化合物：或其異構物作為其母型、及其鹽類、酯類、或溶劑合物。為讓本發明的上述和其他目的、特征、和優點能更明顯易懂，下文特舉出較佳實施例，并配合所附附圖，作詳細說明如下：附圖說明圖1a顯示本發明的醫藥組成物的化學式。圖1b～1d顯示本發明的醫藥組成物的異構體的化學式。圖2a為根據本發明一些實施例顯示經異戊胺(ia、1000ppm、1ml)處理的小鼠在不同處理時間下的活化部份凝血酶時間(activepartialthromboplastintime；aptt)。圖2b為根據本發明一些實施例顯示經3小時異戊胺(ia)處理的小鼠在不同劑量下的活化部份凝血酶時間(aptt)。圖3a為根據本發明一些實施例顯示經異戊胺(ia、1000ppm、1ml)處理的小鼠在不同處理時間下的凝血酶原時間(prothrombintime；pt)。圖3b顯示為根據本發明一些實施例顯示經3小時異戊胺(ia)處理的小鼠在不同劑量下的凝血酶原時間(pt)。具體實施方式以下描述本發明的較佳實施例，此描述是為了說明本發明的一般原理，但不應被視為具有限制意義。本發明的保護范圍當視后附的權利要求書所界定者為準。適度飲酒透過內皮保護(endotheliumprotection)降低所有導致心血管事件的死亡率。特別是，飲用紅酒對于抗凝血有所益處。異戊胺(ia)，3-甲基-1-丁胺(3-methyl-1-butanamine)的同義詞，為一種無色液態的有機化合物，也是紅酒及葡萄汁中的成分之一。根據jofagriculture&foodchemistry,2011,59:8742-53，波特酒中ia的含量為約0.4ppm，而葡萄汁中ia的含量為約1.2ppm。因此，ia為可食用的。本發明顯示ia對于小鼠凝血的影響，其為心血管事件的導因之一。本發明一實施例提供一種醫藥組成物作為制備抗凝血藥物的應用，其中所述醫藥組成物包括式(i)化合物，或其異構物作為其母型、及其鹽類、酯類、或溶劑合物。于本發明另一實施例中，一種用于制備抗凝血藥物應用的醫藥組成物可包括式(i)化合物的異構物像是式(ii)、式(iii)、或式(iv)，及其鹽類、酯類、或溶劑合物。在本發明中，治療有效量的醫藥組成物代表足以降低、抑制、或避免個體中的血液凝固的量，其中所述血液凝固可經由內毒素、菌血癥、或其類似物誘導。在一實施例中，治療有效量的醫藥組成物可為至少5×10-5ml/kg體重的量。在一實施例中，治療有效量的醫藥組成物可為至少5×10-5至0.05ml/kg體重的量，例如：5×10-4ml/kg或5×10-3ml/kg，取決于處理時間和受影響的途徑(內在途徑或外在途徑)。在一實施例中，醫藥組成物可更包括醫藥上可接受的載體，像是磷酸緩沖液或無菌水。根據本發明一實施例，醫藥組成物可經由腸胃外施予至需要的個體，例如：以無菌液體劑型經由腹膜內(intraperitoneally)注射或血管內(intravascularly)注射施予至需要的個體中。醫藥組成物也可經由口服施予至需要的個體中，例如：以無菌液體劑型像是糖漿和懸浮液、或是以固體劑型像是膠囊、片劑、及粉末進行施予。在一實施例中，個體可為哺乳動物。在另一實施例中，個體可為老鼠。在另一實施例中，個體可為人類。以下描述的實施例顯示ia在不同劑量及處理時間下對于凝血的影響。應了解的是，下列實施例在此僅為了描述本發明的較佳樣態，其并非用以限制本發明。材料與方法異戊胺(ia)自默克(merk)(德國)購買250ml異戊胺(isoamylamine；m-820716)。以生理食鹽水將其稀釋為各種濃度，以用于腹腔注射。aptt與pt試劑自德靈公司(dadebehringcompany,siemenshealthcarediagnosticsproductsgmbh，馬爾堡，德國)購買aptt與pt試劑。動物自國家實驗動物中心(nationallaboratoryanimalcenter)(臺北，臺灣)購買5至6周大、體重約20克的c57bl/6jnarl公鼠。處理方法血液中的凝血系統是由內在(intrinsic)和外在(extrinsic)途徑構成。以活化部份凝血酶時間(aptt)分析內在途徑，并以凝血酶原時間(pt)分析外在途徑。接下來以各種不同的ia劑量進行腹腔注射，在不同的時期收取血漿，并進行aptt分析和pt分析。以stagost4凝血分析儀(start4,diagnosticastago，法國)進行aptt分析和pt分析。制備小鼠血漿對小鼠進行二氧化碳麻醉，利用心臟穿刺取得血液，并以1：9的比例混合3.2％檸檬酸鈉和血液。以2000g/rpm將血液離心10分鐘以取得小鼠血漿，并立即對其進行分析。活化部份凝血酶時間(aptt)分析以試劑盒(kit)提供的緩沖溶液為稀釋劑，將aptt試劑進行4倍稀釋并進行aptt分析。在aptt分析中，將0.1ml的血漿置于stagost4凝血分析儀的4個比色皿(barrettcuvette)中，維持在37℃持續1分鐘。接著，添加0.1ml的4倍稀釋aptt試劑及一個鋼球，并等待180秒。最后，添加0.1ml、25mm的氯化鈣(cacl2)溶液進行aptt測量。凝血酶原時間(pt)分析pt分析是在4倍稀釋的pt試劑中進行，其包括四份組成：一份pt試劑、一份25mm的氯化鈣(cacl2)溶液、以及兩份無菌水。在pt分析中，0.1ml的血漿分別置于4個比色皿(barrettecuvette)中，每一個比色皿有一個鋼球，且在stagost4凝血分析儀中維持37℃持續1分鐘。接著，添加0.2ml的稀釋pt試劑進行pt測量。實施例1：時間變化(aptt)為了探討經ia處理的小鼠的凝血系統中內在途徑的抗凝血功效，在不同的處理時間測量aptt。小鼠(n＝6)經腹膜內注射1ml、1000ppm(0.05ml/kg)的ia，在ia注射之后的1小時、2小時、3小時、和24小時進行采血。對10只小鼠注射空白樣本(vehicle)(n＝10)，并將其作為控制組。然后，測量每一組的aptt。測量結果顯示于表1-1及圖2a。圖2a為表1-1的圖式。表1-1：經ia處理的小鼠在不同處理時間下的aptt處理時間(小時)012324n106666aptt平均值(秒)26.330.832.033.734.8s.d.3.61.53.52.14.1*p-值---0.0040.008<0.0010.001*數據為與未經處理的組別(處理時間為0小時)比較的結果。s.d.＝標準偏差。如表1-1和圖2a所示，在ia注射之后的1小時，aptt時間延長，并且隨著處理時間的增加而逐漸延長。ia處理后的1小時所獲得的數據具有統計意義。相較于pt(未顯示于下方)，aptt對于ia注射較為敏感。aptt的趨勢p值<0.001。這樣的結果顯示在經ia處理的小鼠中，凝血時間隨著處理時間增加，表示ia導致的內在途徑具有抗凝血趨勢。實施例2：劑量效應(aptt)為了探討經ia處理的小鼠的凝血系統中內在途徑的抗凝血功效，也在不同的ia劑量下測量aptt。將1ml的各種ia劑量(1ppm、10ppm、100ppm、1,000ppm)分別以腹膜內注射至不同組別的小鼠(n＝6)中。3小時之后分離血漿。對10只小鼠注射空白樣本(n＝10)，并將其作為控制組。然后，測量每一組的aptt。測量結果顯示于表1-2及圖2b。圖2b為表1-2的圖式。表1-2：經ia處理的小鼠在不同劑量下的aptt注射劑量(ppm)01101001000n106666aptt平均值(秒)26.333.033.033.433.7s.d.3.64.44.52.32.1*p-值---0.0050.006<0.0010.001樣本是在ia腹腔注射后的3小時之后取得。*數據為與未經處理的組別(注射劑量為0ppm)比較的結果。s.d.＝標準偏差。如表1-2和圖2b所示，在注射1ppm、10ppm、100ppm、1000ppm的ia之后的1小時，aptt的時間延長。當處理1ppm(5×10-5ml/kg)或更多的ia之后所獲得的數據具有統計意義。趨勢p值為0.005。這樣的結果顯示ia有效地在經ia處理的小鼠中延長凝血時間，表示低至1ppm的ia可造成內在途徑的抗凝血功效。實施例3：時間變化(pt)此外，為了探討經ia處理的小鼠的凝血系統中外在途徑的抗凝血功效，在不同的處理時間測量pt。不同組別的小鼠(n＝6)分別經腹膜內注射1ml、1000ppm(0.05ml/kg)的ia，在ia注射后的1小時、2小時、3小時、和24小時進行采血。對10只小鼠注射空白樣本(n＝10)，并將其作為控制組。然后，測量每一組的pt。測量結果顯示于表2-1及圖3a。圖3a為表2-1的圖式。表2-1：經ia處理的小鼠在不同處理時間下的pt處理時間(小時)012324n106666pt平均值(秒)11.111.612.212.613.2s.d.0.71.01.11.20.5*p-值---0.1890.0290.006<0.001*數據為與未經處理的組別(處理時間為0小時)比較的結果。s.d.＝標準偏差。如表2-1和圖3a所示，在ia注射后的2小時，pt的時間延長，并且隨著處理時間增加而逐漸延長。ia處理后的2小時所獲得的數據具有統計意義。pt的趨勢p值<0.001。這樣的結果顯示在經ia處理的小鼠中，凝血時間隨著處理時間增加，表示在ia導致的外在途徑具有抗凝血趨勢。實施例4：劑量效應(pt)為了探討經ia處理的小鼠的凝血系統中外在途徑的抗凝血功效，也在不同的ia劑量下測量pt。將1ml的各種ia劑量(1ppm、10ppm、100ppm、1,000ppm)分別以腹膜內注射至不同組別的小鼠(n＝6)中。3小時之后分離血漿。對10只小鼠注射空白樣本(n＝10)，并將其作為控制組。然后，測量每一組的pt。測量結果顯示于表2-2及圖3b。圖3b為表2-2的圖式。表2-2：經ia處理的小鼠在不同劑量下的pt注射劑量(ppm)01101001000n106666pt平均值(秒)11.111.211.411.512.6s.d.0.70.40.70.61.2*p-值---0.7280.2930.2370.006樣本是在ia腹腔注射后的3小時之后取得。*數據為與未經處理的組別(注射劑量為0ppm)比較的結果。s.d.＝標準偏差。如表2-2和圖3b所示，在注射1000ppm的ia之后，pt的時間明顯延長。當處理1000ppm的ia之后所獲得的數據具有統計意義。pt的趨勢p值為0.307。這樣的結果顯示在經ia處理的小鼠中，ia的劑量高時，凝血時間增加，表示高劑量的ia可造成外在途徑的抗凝血功效。本發明顯示ia抑制了小鼠的凝血系統，包括內在途徑(aptt)以及外在途徑(pt)。以腹腔注射1ml、1000ppm(0.05ml/kg)的ia之后的2小時，pt受到抑制。然而，在劑量效應中，在腹腔注射的3小時之后，需要1ml、1000ppm(0.05ml/kg)的ia來抑制pt。aptt對于ia的抑制較為敏感。注射1ml、1000ppm的ia就能夠以1小時的處理時間抑制aptt。在劑量效應中，在腹腔注射的3小時之后，只需要1ml、1ppm的ia就能夠抑制aptt。上述數據顯示ia有效地在經處理的小鼠中延長aptt，而僅在高劑量的ia(像是1000ppm)處理下延長pt，暗示ia對于凝血的內在途徑相較于凝血的外在途徑具有較為顯著的功效。換句話說，凝血的內在途徑對于ia的抑制較為敏感。應注意的是，本發明的實驗數據顯示，當施予1ml、1000ppm(0.05ml/kg)的ia時，小鼠仍可維持其正常的生理狀態。balb/c小鼠(20克)可承受腹腔注射1ml、20,000ppm(0.1ml/kg)的ia。此外，本發明的發明人也發現，即使施予1ml、30,000ppm的ia，大鼠仍可維持其正常的生理狀態。換句話說，即使在高劑量下，ia也對哺乳動物無害。本發明的結果說明外在途徑的pt和內在途徑的aptt都隨著ia的處理時間增加而延長。并且，pt的增加在以腹腔注射施予1ml、1000ppm的ia之后的2小時具有統計意義，而aptt的增加在以腹腔注射施予1ml、1000ppm的ia之后的1小時具有統計意義。這些結果顯示式(i)醫藥組成物，亦即異戊胺(ia)，在哺乳動物像是大鼠和小鼠中具有抗凝血功效。因此，藉由施予異戊胺(ia)至需要的個體的抗凝血方法在未來的醫療研究及應用中具有相當高的價值。例如，透過施予異戊胺(ia)產生抗凝血，以避免血栓和栓塞形成。雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬
技術領域：
中普通技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作任意的更動與潤飾，因此本發明的保護范圍當視后附的權利要求書所界定者為準。當前第1頁12