能在體實現自我重塑的生物人工血管的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程技術，具體是關于一種能在體實現自我重塑的生物人工血管。
【背景技術】
[0002]目前臨床上應用的人工血管多為滌綸制品和聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene,PTFE)等不可降解的聚合物材料。對于大血管的置換，這些人工血管在一定程度上滿足臨床需要。然而對于直徑小于6mm的小血管的置換，這種材料的人工血管主要通過在內表面涂層抗凝或者抑制血栓形成的藥物，可以在早期實現較好的通暢效果，然而在移植后期藥物逐漸釋放完畢后，很容易形成血栓最終導致血管的移植的失敗。隨著冠心病和糖尿病發病年齡的提前，進行血管置換的人群也逐漸趨于年輕化，要求移植的人工血管能長時程甚至終生的在體發揮功能，在數十年中不發生血栓和內膜增生等不良事件。因此如何實現生物人工血管的體內重塑和自我完全替代是目前研宄的主要方向。
[0003]內皮細胞具有抗血栓形成、抑制血小板聚集和平滑肌的病理性增生等重要作用，被認為是最終解決血管血栓形成及內膜增生的最有效方法。內皮祖細胞是內皮細胞的前體細胞，可以通過旁分泌促血管生成因子或者分化形成內皮細胞來促進組織工程血管的快速內皮化。因此內皮祖細胞捕獲的生物人工血管是目前的發展趨勢，被認為是第三代生物人工血管。科學家通過表征內皮祖細胞的特異性抗體促進組織工程血管的快速內皮化，在移植的早期取得了較好的通暢效果，然而在移植一個月時卻出現了不同程度的內膜增生。宄其原因，主要是組織工程血管局部的微環境不適合細胞的生存和功能的發揮。
[0004]孔隙率和孔徑與組織工程材料內的細胞的存活、增殖和分化緊密相關。較大的孔徑和孔隙率有利于材料內細胞與外界進行營養和氧氣的交換，文章報道形成血管維持充足的能量代謝物質交換的材料最小孔徑大約為30到40 um。然而較大的孔隙率和孔徑降低生物材料的結構穩定性。組織工程血管移植后需要經受血液很大的流體剪切力和沖刷力，不穩定的材料結構容易引起生物人工血管的堵塞、變形甚至破裂，造成很嚴重的后果。有人認為組織工程血管內層的孔徑應該小于24um，低于維持物質交換的最小孔徑。因此組織工程血管局部的微環境在外層毛細血管長入前是一個嚴重缺氧和營養匱乏的微環境，不利于生物人工血管的重塑。如何優化局部微環境和實現生物人工血管的重塑是目前研宄的難題，目前還未見能實現在體自我重塑的生物人工血管。
[0005]腺苷是在體內普遍存在的一種內源性核苷，被認為是一種十分有效的微環境優化分子。腺苷主要通過兩個途徑發揮生物學功能:第一直接進入細胞內，通過腺苷激酶途徑調控能量代謝，促進內皮祖細胞動員和保護細胞抵御外界的損傷；第二是通過與細胞表面的四個G蛋白偶聯受體結合，激活下游的信號通路發揮生物學功能，其中A2a受體的效應最為顯著，具有調控炎癥反應和促進內皮祖細胞歸巢的功能。構建一個能穩定釋放內源性腺苷的組織工程血管能達到優化局部微環境和實現生物人工血管重塑的目的。Klotho蛋白是一種抗衰老蛋白，具有保護細胞和調控磷代謝的功能；膠質細胞源性的神經營養因子(Glialcell-line derived neurotrophic factor，⑶NF)特異性保護多巴胺能神經元，促進損傷神經修復的功能。
【發明內容】
[0006]本發明的目的就在于克服上述現有技術中存在的不足，提供一種具有良好力學性能、能實現自我在體重塑的生物人工血管，能將生物人工血管轉換為一個能持續釋放腺苷的生物反應器，有效的優化局部微環境和促進其快速內皮化，用于臨床上修復血管缺損或血管搭橋。
[0007]為實現本發明的上述目的而采用的技術方案是這樣的，即一種能自我優化局部微環境和促進人工血管快速內皮化最終實現在體自我重塑的生物人工血管，由如下方法制備:
(1)血管支架復合材料的獲取:用異種或同種血管或皮膚組織提取生物膠原，然后去除生物膠原中的抗原，獲得良好生物相容性的生物膠原；
(2)編織血管:a、用電紡絲紡織方法將步驟(I)獲得的生物膠原和彈性材料復合，編織成血管支架；或b、采用3D打印的方法，用步驟(I)獲得的生物膠原、殼聚糖、粘連蛋白及彈性材料作為打印的基礎材料，打印出血管支架；或c、采用去除抗原后的同種或異種脫細胞血管，作為血管支架；
(3)血管的修飾:選用Klotho蛋白和/或⑶NF修飾所述血管支架，得到所需生物人工血管。①采用電紡絲紡織方法直接將Klotho蛋白和/或⑶NF編織到血管支架中，獲得生物人工血管；或②將Klotho蛋白和/或GDNF構建納米緩釋顆粒，采用化學交聯或者物理方法涂層到血管支架內表面，獲得生物人工血管；或③將Klotho蛋白和/或⑶NF加入3D打印的基礎材料中，打印獲得生物人工血管；
本發明獲取的人源性生物膠原已去除抗原性，可控降解，可原位成型。具有良好的生物相容性，較好的力學性能。膠原是血管細胞外基質主要成分，并可在生理條件下自組裝形成凝膠，以及可以與殼聚糖形成水凝膠。同時膠原的三維空間結構具有較好的強度，是組成血管的重要成分。用于構建生物人工血管的膠原，在保持三螺旋結構的同時去除其抗原點一尾肽。這種材料為天然生物材料，來源廣泛，無毒性，降解產物可被機體吸收，不對機體產生危害，制作簡便，易于塑形，并在功能適應性、組織相容性、理化性能、生物降解性、造價等方面優于人工合成材料。
[0008]本發明制備的生物人工血管具有良好的可降解性和生物相容性，進一步復合藥物Klotho蛋白或者GDNF等后，在捕獲內皮祖細胞的同時，將人工血管轉換為持續釋放腺苷的生物反應器，達到實現自我重塑的目的。
[0009]本發明還具有以下優點:一方面藥物自身可以捕獲循環中的內皮祖細胞實現早期快速內皮化，同時還能誘導浸潤的單核細胞或者歸巢的內皮祖細胞轉化成為持續釋放腺苷的細胞生物反應器，達到優化局部微環境和血管逐步重塑的目的；另一方面，采用基因預調控、電紡絲紡織或者3D打印的方法將藥物均勻的涂層到整個血管，能實現人工血管的緩釋，逐步的誘導人工血管在體的重塑和自我替代。
【具體實施方式】
[0010]下面結合實施例對本發明的內容作進一步說明。本發明中無特殊說明的材料和試劑均為市購產品。本發明中無特殊說明的方法和技術均為本領域常規使用的方法和技術。
[0011]1.血管支復合架材料的獲取:
1.1無菌條件下取新鮮異種或同種血管或皮膚組織，去除其上所附軟組織，無菌PBS沖洗，去除血栓凝塊，無菌包裝放入-80 °C保存。復溫于37°C用0.1 mo I/L PMSF溶液處理1-3小時，抗生素低滲及高滲緩沖液分別處理3-5小時，每I小時換液一次；組織以其質量4倍體積的