長非編碼rna h19與癌癥鉑類化療藥物耐藥相關性的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學和制藥領域，具體涉及長非編碼RNA H19與癌癥鉑類化療藥 物耐藥相關性。
【背景技術】
[0002] 卵巢癌死亡率仍居婦科腫瘤之首。盡管卵巢癌治療方案不斷改進，如手術切除范 圍的擴大、紫杉醇和鉑類藥物的聯合化療，但死亡率仍居高不下，據報道III期患者的五年生 存率僅為29%。究其原因，除了早期診斷困難外，化療耐藥是影響卵巢癌患者存活率的重要 因素。目前在卵巢癌化療方案中，鉑類藥物是臨床上首選藥物之一。雖然卵巢癌患者對以 鉑類為主的聯合化療首次有效率達到70% -80%，但大部分患者都會在今后的化療中產生 繼發性耐藥。因此如何預測耐藥，如何避免發生耐藥，以及如何逆轉耐藥和開發針對耐藥腫 瘤細胞的新藥等，不僅是當前研究的熱點，也將是今后卵巢癌研究中的長期任務。
[0003] 卵巢癌耐藥機制的深入理解是解決臨床耐藥問題的基礎，也是改善化療效果的關 鍵。已有的實驗結果顯示卵巢癌對鉑類藥物耐藥性產生的機制可能和以下因素有關：1) 腫瘤細胞對鉑類藥物的吸收減少、排出增強或藥物作用失效：北京協和醫院潘凌亞課題組 的研究發現，卵巢癌鉬類耐藥特異性標記蛋白Annexin A3通過降低細胞內鉬含量及鉬一 DNA結合量而導致細胞產生耐藥。2)DNA損傷修復系統相關：鉑類藥物引起的DNA損傷主 要通過核苷酸切除修復途徑，例如切除修復交叉互補基因 I(ERCCl)和ERCCl基因的表達 產物與DNA修復酶缺乏互補基因 F(XPF)形成緊密的異二聚體（ERCC1/XPF)基因等來矯 正。同時DNA同源修復途徑和DNA聚合酶相關基因也與鉑類藥物抗性有關，如乳腺癌1號 (BRCAl)，DNA聚合酶eta等。因此，DNA損傷修復系統在鉑類敏感細胞中往往是有缺陷的。 3)細胞凋亡途徑相關：細胞凋亡信號通路的異常和順鉑抗性有關。P53低表達或Mdm2高表 達使腫瘤細胞對順鉑不敏感。4)信號通路相關：鉑類耐藥機制也與相關信號通路有關，如 Cadherins/catenins和PTEN/PI3K/AKT等信號通路，PI3K抑制劑增加耐藥株對順鉑的敏 感性。5)miRNAs相關:miR-128在卵巢癌順鉑耐藥細胞株SK0V3/CP中低表達，在該細胞株 中過表達miR-128降低ABCC5和Bmi-I蛋白表達，也使得該細胞對順鉑的敏感性增加。雖 然我們對卵巢癌鉑類耐藥機制有了比較多的了解，但是離解決臨床耐藥問題還有一定的距 離，對其耐藥機制還需展開深入的研究。
[0004] 最近研究發現一些長片段非編碼RNA(long noncoding RNA, IncRNA)參與了腫瘤 細胞對DNA損傷時的應答。Huarte等研究發現IncRNAs在p53途徑中起重要作用，其中 lincRNA-p21在DNA損傷時作為p53的靶基因起作用；lincRNA-p21進一步與hnRNP-K互 相作用調控下游系統基因表達，從而影響細胞凋亡。另一個長片段非編碼RNA PANDA，也是 P53的靶基因，在DNA損傷時被誘導；PANDA進一步和轉錄因子NF-YA互作引起細胞周期停 滯。又如Cdc281ncRNA在逆境下能誘導⑶C28表達，而⑶C28表達量增加使細胞容易在逆 境消除后重新進入細胞周期等。由此可見，長片段非編碼RNA廣泛參與了 DNA損傷應答的 各個環節。而鉑類藥物主要與DNA交聯，誘發DNA損傷，從而引起系列生物學效應。因而， 長片段非編碼RNA有可能參與了卵巢癌鉑類耐藥的作用機理。但關于長片段非編碼RNA與 鉑類耐藥相關的研究至今還未見報道。
[0005] H19基因編碼一個2. 3kb的非編碼RNA分子，包含5個外顯子，是最早發現的 印跡基因之一。長非編碼RNA H19的序列（如SEQ ID NO: 1所示）可以從GeneBank數 據庫查閱獲知，其在NCBI數據庫，Nucleotide子庫中的登錄號為NR_002196. 2。已有研 究發現H19廣泛參與各種生理病理過程。H19的表達受上游2到4kb處的印記調控區 (imprintingcontrolregion，ICR)和上下游的增強子調控，印記調控區包括差異甲基化區 (differentiallymethylatedregion，DMR)和沉默元件（silencer element)，DMR 能結合 CTCF絕緣子蛋白。在母系遺傳的等位基因，DMR區結合CTCF，H19通過其上下游增強子激 活。而在父系遺傳的等位基因，DMR區被甲基化，H19轉錄被沉默元件抑制。雖然在細胞質 及細胞核內都能檢測到H19分子，但H19主要存在于細胞質內，其不僅參與了胚胎發育調 控，還以抑癌基因或癌基因角色參與多種腫瘤發生發展。國外學者發現長鏈非編碼H19在 多種腫瘤中異常表達，如膀胱癌等多種惡性腫瘤，并發現其具有原癌活性。但也有研究認為 H19具有抑癌活性，可以抑制腫瘤的惡性增殖、侵襲轉移和腫瘤新生血管的形成。因此，H19 參與腫瘤發生發展的機理可能是比較復雜的。另外，至今為止，H19參與卵巢癌順鉑耐藥的 情況以及具體作用機制尚未見諸報道。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于：通過研究長非編碼RNA H19與癌癥鉑類化療藥物 耐藥相關性，提供長非編碼RNA H19在制備治療或預防癌癥的藥物、用于診斷癌癥發生或預 測癌癥復發的試劑盒中的應用，以及提供長非編碼RNA H19在調控癌癥的鉑類化療藥物耐 藥性、預測、檢測或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性中的應用。
[0007] 本發明的一個方面在于提供能夠減少和/或抑制癌細胞中的長非編碼RNA H19表 達的藥劑在制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
[0008] 本發明的一個方面在于提供能夠減少和/或抑制癌細胞中的長非編碼RNA H19表 達的藥劑在制備降低癌癥的鉑類化療藥物耐藥性的藥物中的用途。
[0009] 例如：
[0010] 就本發明的上述用途，所述藥劑優選自：抑制所述長非編碼RNA H19表達的反義 RNA或特異切割所述長非編碼RNA H19的核酶。
[0011] 就本發明的上述用途，所述藥劑優選自：抑制所述長非編碼RNA H19表達的小分 子化學藥劑。
[0012] 在本發明上述用途的一些實施方案中，根據本發明的反義RNA，其包含能夠特異結 合所述長非編碼RNA H19或其互補序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，優選所述 反義RNA包含與H19的一個或多個部分互補的序列區域，更優選地所述反義RNA包含與全 長H19完全互補的DNA序列，優選地，所述反義核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最優 選地，所述反義RNA包含在能夠表達其的表達質粒，優選真核表達質粒中。
[0013] 在本發明上述用途的一些實施方案中，所述藥劑優選為對所述長非編碼RNA H19 進行定向干擾的慢病毒質粒。
[0014] 在本發明上述用途的一個實施方案中，優選構建所述慢病毒質粒所用的對所述長 非編碼RNA H19進行定向干擾的核苷酸序列如下：
[0015] 正義鏈如SEQ ID NO:6所示；
[0016] 反義鏈如SEQ ID NO:7所示。
[0017] 本發明的另一個方面在于提供能夠檢測長非編碼RNA H19表達的藥劑在制備用于 診斷癌癥發生或預測癌癥復發的診斷或預測試劑盒中的用途。
[0018] 本發明的另一個方面在于提供能夠檢測癌細胞中的長非編碼RNA H19表達的藥劑 在制備用于檢測癌細胞的鉑類化療藥物耐藥性或診斷癌癥患者的鉑類化療藥物耐藥性的 檢測或診斷試劑盒中的用途。即，一般地，可以檢測癌細胞株或從癌癥患者獲得的腫瘤活檢 組織中長非編碼RNA H19的表達量，并將所得的量與預定的閾值進行比較，由此預測或預后 所述癌細胞和癌癥患者是否具有鉑類化療藥物耐藥性。
[0019] 就本發明的上述用途，所述藥劑選自對所述長非編碼RNA H19具有檢測特異性的 核苷酸探針或PCR引物。
[0020] 在本發明上述用途的一個實施方案中，所述的對所述長非編碼RNA H19具有檢測 特異性的PCR引物的核苷酸序列優選如下：
[0021] 正義鏈如SEQ ID NO:2所示；
[0022] 反義鏈如SEQ ID NO:3所示。
[0023] 本發明的再一個方面在于提供一種藥物組合物，包含前述的能夠減少和/或抑制 癌細胞中的長非編碼RNA H19表達的藥劑或者前述的能夠檢測癌細胞中的長非編碼RNA H19表達的藥劑。
[0024] 在本發明的所有方面，如果適用的話，優選的是