連翹酯苷i的應用及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物用途領域，具體涉及植物提取物的應用和制備。
【背景技術】
[0002] 連翹酯苷是從木犀科連翹屬植物連翹中提取的有效成分，連翹酯苷具有抗微生 物、抗病毒、抗氧化等藥理作用。之前的研究發現連翹酯苷中幾乎全是連翹酯苷A在起作 用，但連翹酯苷A很難單獨穩定存在，因此習慣上，常把含有連翹酯苷A的連翹酯苷類有效 成分稱作連翹酯苷。連翹酯苷A的分子式為C29H36015，結構式如下：
[0003] 連翹酯苷I為棕色無定型粉末，高分辨質譜顯示連翹酯苷I分子式為C29H 36015，與 連翹酯苷A的分子式相同，并且其IR、IDNMR和MS譜與連翹酯苷A也十分相似，顯示連翹酯 苷I與連翹酯苷A是同分異構體，不同之處主要表現在咖啡酰基與葡萄糖基的連接位置不 同。結構式如下：
連翹酯苷A、連翹酯苷I在水溶液、光照、加熱情況下都會發生轉化，在甲醇溶液中會緩 慢轉化，在純乙酸乙酯溶液中較穩定。
[0004] 正是因為連翹酯苷I的不穩定，在制備或加工過程中容易發生轉化，因此連翹酯 苷I制備和保存比較困難，目前對于連翹酯苷I的研究還不多，因為對連翹酯苷I的具體抗 菌活性還不了解。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種連翹酯苷I的應用及其制備方法。
[0006] 所述連翹酯苷I在制備抑制合胞病毒藥物中的應用。
[0007] 為了實現上述技術方案將連翹酯苷I制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑。
[0008] 連翹酯苷I的用量為每天22. 5-90mg/kg。
[0009] -種連翹酯苷I的制備方法，是由以下步驟制成的： (1)、提取：取連翹葉，加10倍量水提取3次，每次1小時，得到連翹葉水提液； (2 )、純化：將步驟（1)所得連翹葉水提液通過大孔樹脂AB-8對連翹酯苷成分進行初步 純化，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脫，收集20%乙醇洗脫液； (3) 、去雜質：取步驟（2)所得20%乙醇洗脫部位，采用硅膠柱去雜質，用乙酸乙酯和無 水乙醇溶劑系統進行洗脫，得到各流份，取流份5-7 ; (4) 、液相色譜單體分離：對步驟（3)所得的流份5-7進行分離，得到目標化合物單體溶 液。
[0010] 作為優選，所述連翹酯苷I是由以下步驟制成的： (1)、提取：取連翹葉，加10倍量水提取3次，每次1小時，得到連翹葉水提液； (2 )、純化：將步驟（1)所得連翹葉水提液通過大孔樹脂AB-8對連翹酯苷成分進行初步 純化，樹脂與藥材量比為1:〇.8，上樣速率為川￥/11，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脫，收集 20%乙醇洗脫液； (3) 、去雜質：取步驟（2)所得20%乙醇洗脫部位，采用硅膠柱去雜質，用乙酸乙酯和無 水乙醇溶劑系統進行洗脫，以連翹酯苷I的含量計算，上樣量與硅膠用量為1:150,以乙酸 乙酯為流動相洗脫10倍柱體積，一倍柱體積洗脫液為1個流份，得到10個流份，收集流份 5-7 ； (4) 、液相色譜單體分離：對步驟（3)所得的流份5-7進行分離，流動相為甲醇：水 =40:60，檢測波長33〇11111，流速12〇1]117111；[11，進樣量：2 1]11^得到目標化合物單體溶液。 [0011] 為了選擇更佳的制備工藝，做了以下工藝研究： 一、提取工藝研究： 1、連翹葉中連翹酯苷I、A含量測定： 采用《中華人民共和國藥典》2010年版一部"連翹"項下含量測定方法對連翹葉中連翹 酯苷I、A進行含量測定，測定結果見表1，圖譜見圖1、2、3。
[0012] 結果表明，連翹葉中連翹酯苷I和連翹酯苷A的含量分別為0. 15%和2. 11%，其中 連翹酯苷A含量遠高于藥典中規定的連翹果實含量（0. 25%)。
[0013] 2、連翹葉提取溶劑考察： 采用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇對連翹葉提取溶劑進行考察。 結果發現：水提取液中連翹酯苷A轉化為連翹酯苷I和另一連翹酯苷類物質(命名為連翹酯 苷H)，所以連翹酯苷I的含量最高。30%乙醇提取液中連翹酯苷A略有轉化，50%、60%、70%、 80%乙醇提取液中連翹酯苷A轉化均不明顯。結論：以連翹酯苷I提取率為指標，優選水提 取。
[0014] 3、連翹葉提取正交試驗： 以連翹酯苷I提取率為指標，采用4因素3水平正交試驗法，考察提取時的溶劑用量、 提取時間和提取次數。根據正交試驗及驗證試驗結果得到最優工藝參數為：1〇倍量水提取 3次，每次1小時。
[0015] 4、連翹葉提取放大試驗： 根據正交實驗選擇的工藝對連翹葉進行提取：連翹葉約500 g用水提取，溶媒用量為 10倍，回流提取3次，每次1 h。經提取，提取液中連翹酯苷I和連翹酯苷A的含量分別為 0. 71%和0. 94%，提取率分別為48. 05%和44. 52%。經計算，提取液中含連翹酯苷I 3. 68 g， 連翹酯苷A 4.87 g。提取液圖譜見圖4。
[0016] _、大孔樹脂畐集工藝： 連翹酯苷成分的初步純化多采用大孔樹脂，其中AB-8大孔樹脂的吸附率及解析率均 最高，前期預試驗也證明AB-8大孔樹脂分離連翹酯苷效果好。
[0017] 連翹葉水提液直接過AB-8大孔樹脂柱，樹脂與藥材量比為1:0. 8(g/g)，上樣速率 為lBV/h，考察不同濃度乙醇的洗脫率，洗脫速率lBV/h，收集不同洗脫部分：水洗液部分、 20%乙醇洗脫部分、40%乙醇洗脫部分。各洗脫部分連翹酯苷I、A含量、洗脫率見表2,圖譜 見圖5、6。
[0018] 由表2可知，20%乙醇洗脫基本上能將大部分目標化合物洗脫出來。因此，后續工 藝暫以20%洗脫部分進行化合物分離。由圖6可知經大孔樹脂初步純化后，樣品中仍有許 多雜質，連翹酯苷I和連翹酯苷A的純度還很低，分別為16%和30%，因此需要再經過硅膠柱 分離除去雜質。
[0019] 三、硅膠柱分離工藝： 硅膠柱分離連翹酯苷成分多用乙酸乙酯和甲醇系統。為降低毒性，我們采用乙酸乙酯 和無水乙醇溶劑系統進行洗脫。
[0020] 連翹酯苷20%乙醇洗脫部位采用硅膠柱色譜分離，以連翹酯苷I的含量計算，上樣 量與硅膠用量為1:150 (g/g)。以乙酸乙酯為流動相洗脫10倍柱體積，一倍柱體積洗脫液 為1個流份，經過高效液相色譜檢測各流份的純度，收集只含有連翹酯苷I和連翹酯苷A兩 種成分的流份。結果表明流份5-7符合要求，編號為樣品1、2、3,三個樣品中兩個峰總含量 均在80-90%。樣品1、2、3的連翹酯苷I、A含量見表3,圖譜見圖7-9。
[0021] 四、制備液相分離： 采用漢邦制備液相色譜對硅膠柱分離到的樣品1、2、3進行單體分離。經過色譜條件摸 索，最終確定色譜條件如下：流動相為甲醇：水=40:60,檢測波長330 nm，流速120 mL/min， 進樣量：2 mL。制備過程采取套針循環進樣，如圖10所示： 經制備可得到連翹酯苷I和連翹酯苷A的單體溶液。
[0022] 為了研究連翹酯苷I的抗病毒作用，作了如下研究： 第一部分 一、研究內容 評價藥物體外安全性 測試連翹的2個樣品（A為純度90%的連翹酯苷I，B為純度90%的連翹酯苷I、連翹酯 苷A、連翹酯苷Η的混合物，下面的樣品A、B均同）。以MTT法評價受試樣品體外對細胞的 毒性，確定藥物的安全濃度范圍。采用Reed-Muench法計算藥物半數細胞毒性濃度（TC5。）。
[0023] 確認藥物體外抗多種呼吸道病毒的活性 以多種呼吸道病毒作為研究對象(具體病毒種類見表4,均為呼吸疾病國家重點實驗室 保存的標準毒株，或已作鑒定分型的臨床分離株)，按照病毒類別進行分組篩選，評價送試 樣品對呼吸道病毒的抑制作用，用Reed-Muench法計算半數抑制濃度（IC5。)。
[0024] 經廣譜篩選有效的抗病毒藥物，進一步明確體外抗病毒環節和特點 利用直接、治療及預防3種策略，以及單個感染復制周期模型，以細胞病變法，評價對 經體外藥效篩選有效毒株的抑制作用環節(吸附，脫殼或核釋放等)。
[0025] 第二部分實際完成情況 第一節連翹抗病毒活性的篩選 一、材料與方法 1、實驗