芬戈莫德的新用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及芬戈莫德的新用途。
【背景技術】
[0002] 糖尿病視網膜病變（DR)是的糖尿病微血管并發癥之一，且為導致工作年齡群致 盲的主要原因之一。炎癥反應在DR的發生及發展中起到重要作用。DR早期以血視網膜屏 障破壞為主要特征，晚期出現視網膜新生血管。目前，DR的治療主要為控制全身情況（包 括血糖、血脂及血壓），抗VEGF治療、全視網膜激光及玻離體切割術治療，但是這些方法均 是針對癥狀所采取的措施。尚無有效的方法可以從病因上治療DR。
[0003] 芬戈莫德（FTY720)是冬蟲夏草中提取的有效成分多球殼菌素去除手性中心、改 變側鏈而合成的新型免疫抑制劑。FTY720在體內經鞘氨醇激酶2磷酸化后，形成活性形式 FTY720-P。FTY720-P是鞘氨醇-1-磷酸（S1P)的結構類似物，可以作用于除S1P2以外的其 他4種S1P受體而發揮作用。
[0004] 現階段芬戈莫德主要具有如下應用：芬戈莫德為首個防止淋巴細胞從淋巴結中離 開的鞘氨醇1-磷酸鹽受體調節劑類藥，降低多發性硬化癥患者疾病復發的頻率，延緩多發 性硬化癥患者的病情惡化程度；它還可以保持淋巴結內特定的免疫細胞，防止它們作用于 中樞神經系統并造成損害，并且對淋巴細胞的保持力是可逆的，從而使患者在治療停止后 體內循環的淋巴細胞恢復到正常水平。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題在于提供芬戈莫德的新用途。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0007] 芬戈莫德具有減少DM大鼠視網膜炎性細胞浸潤、及細胞因子和粘附因子表達的 用途。
[0008] 芬戈莫德具有抑制NF-κB活化的用途。
[0009] 芬戈莫德對血視網膜屏障具有保護作用，減少血管滲透性并維持緊密連接蛋白的 表達。
[0010] 芬戈莫德在制備用于治療糖尿病視網膜病變的藥物中的用途。
[0011] 本發明的有益效果是：
[0012] 本發明提供了一種芬戈莫德（FTY720)的新用途，可減少DM大鼠視網膜炎性細胞 浸潤，及細胞因子和粘附因子表達；另外，FTY720還可以抑制NF-κB的活化；FTY720對血 視網膜屏障具有保護作用，減少血管滲透性并維持緊密連接蛋白的表達；FTY720可有效應 用于糖尿病視網膜病變的藥物制備。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明實施例中大鼠視網膜HE染色檢測視網膜組織病理學改變圖；
[0014] 圖2是本發明實施例中大鼠視網膜⑶45陽性的白細胞和⑶lib陽性的巨噬細胞 /活化的小膠質細胞浸潤圖；
[0015] 圖3是本發明實施例中大鼠視網膜炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達圖；
[0016] 圖4是本發明實施例中大鼠視網膜ICAM-1和VCAM-1表達情況。其中，Α為免疫 組織化學染色檢測視網膜ICAM-1和VCAM-1，B為視網膜ICAM-1和VCAM-1陽性細胞統計， C為視網膜ICAM-1和VCAM-1的mRNA相對表達量圖；
[0017] 圖5是本發明實施例中大鼠視網膜NF-κΒ表達量。其中，A為westernblot檢測 視網膜NF-κB蛋白表達量，B為視網膜NF-κB的mRNA相對表達量圖；
[0018] 圖6是本發明實施例中大鼠EB灌注檢測視網膜血管滲漏。其中，A為EB灌注視 網膜鋪片，B為視網膜EB滲漏定量圖；
[0019] 圖7是本發明實施例中大鼠視網膜緊密連接蛋白Z0-l、0ccludin和Claudin-5表 達情況。其中，A為免疫組織化學染色檢測視網膜Z0-1、Occludin和Claudin-5表達及分 布，B為westernblot檢測視網膜Z0-1、Occludin和Claudin-5表達，C為視網膜Z0-1、 Occludin和Claudin-5的mRNA相對表達量圖。
【具體實施方式】
[0020] 為了使本領域的技術人員更好的理解本發明的技術方案，下面結合附圖及具體實 施方式對本發明所述技術方案作進一步的詳細說明。
[0021] 實施例1
[0022] 1.大鼠糖尿病（diabeticmellitus，DM)模型的建立
[0023] 1. 1實驗動物的選取及飼養
[0024] 12-14周齡雄性Wistar大鼠80只，體重250-300g。全部大鼠飼養于標準化動物 中心無特定病原體動物（SPF)級動物房，采用標準顆粒飼料喂養，自由飲水攝食，室溫為 (22 ± 2) °C，相對濕度為40 % -60 %。適應性飼養3-5天后用于實驗。
[0025] 1. 2DM大鼠模型制作原理
[0026] 抗腫瘤藥物鏈脲佐菌素（streptozotocin,STZ)可以選擇性破壞大鼠胰島β細 胞，引起實驗性I型糖尿病。
[0027] 1. 3DM模型的制備及標準
[0028] 造模前稱重，一次性尾靜脈注射2%STZ，劑量為50mg/kg，48h后檢測空腹血糖，連 續3次大于16. 7mmol/L即為造模成功。
[0029] 2芬戈莫德（FTY720)對實驗動物的治療作用及藥理研究
[0030] 以上述制備的DM模型作為實驗對象驗證FTY720對其治療效果，并考察其藥理作 用機制。
[0031] 2.1實驗方法
[0032] 2. 1. 1DM大鼠的飼養條件
[0033] 飼養于標準化動物中心無特定病原體動物（SPF)級動物房，采用標準顆粒飼料喂 養，自由飲水攝食，室溫為（22 ± 2) °C，相對濕度為40 % -60 %。
[0034] 2. 1. 2給藥方式及具體途徑
[0035] 造模成功后，FTY720治療組大鼠每日灌胃給藥，劑量為0. 3mg/kg，連續3個月。由 于FTY720可溶于水，故采用雙蒸水溶解，并且未設置安慰劑組。
[0036] 2. 1. 3視網膜切片HE染色
[0037] 2. 1. 3. 1 取材
[0038] 造模成功后3個月，處死大鼠并完整取出眼球。
[0039] 2. 1. 3. 2石蠟切片制備
[0040] (1) 10%甲醛溶液+4%冰乙酸固定眼球，使組織、細胞蛋白質變性凝固；過夜，生 理鹽水沖洗眼球；
[0041] (2)脫水：將眼球依次浸入75%酒精、85%酒精、95%酒精1、95%酒精11、95%酒 精III、無水酒精I、無水酒精II、無水酒精III;
[0042] (3)透明：眼球依次浸入二甲苯I、II、III;
[0043] (4)浸蠟：將眼球浸入預熱的包埋盒中（含部分融化的石蠟），繼續加入融化的石 蠟至組織全部浸沒；
[0044] (5)冷卻：將包埋盒置入4°C冰箱中充分冷卻后取出；
[0045] (6)將包埋好的蠟塊，用石蠟機連續切片，厚度為5μm，制成石蠟切片。
[0046] 2. 1.3. 3HE染色
[0047] (1)石蠟切片脫蠟至水：順序依次為，二甲苯浸洗2次共5min，100%、95%、90%、 80%、70%乙醇浸洗31^1^5，自來水洗滌1〇11^11 ;
[0048] (2)蘇木精染色5min，自來水洗lmin;
[0049] (3) 1 %鹽酸酒精分化30s，自來水洗lmin，PBS返藍30s，自來水洗lmin;
[0050] (4)伊紅染色2min;自來水洗3min;
[0051] (5)梯度酒精脫水，二甲苯透明；
[0052] (6)中性樹脂膠封片，光鏡下觀察并拍照。
[0053] 2. 1. 4視網膜免疫熒光染色
[0054] 2. 1. 4. 1取材及冰凍切片制備
[0055](1)造模成功后3個月處死大鼠，完整取出眼球；
[0056] (2)立即將大鼠眼球于液氮中冷凍10-15秒后，用你0CT包埋；
[0057](3)立即將0CT包埋的大鼠眼球于-80°C超低溫冰箱中冷凍，15分鐘后取出；
[0058] (4)將冷凍包埋好的組織用冰凍切片機連續切片，厚度為5μm，制成冰凍切片，切 片暫時冷凍于-20°C備用。
[0059] 2. 1. 4. 2免疫熒光染色
[0060] (1)冰凍切片室溫復溫30min;
[0061] ⑵冰丙酮固定8min后，冰PBS洗3次X5min;
[0062] (3) 3 % 的BSA室溫封閉 30min;
[0063] (4)分別滴加一抗CD45、CDllb、CD3 (均3%BSA稀釋，稀釋比例為1:200)，4°C孵 育過夜，冰PBS洗3次X5min;
[0064] (5)滴加驢抗大鼠熒光二抗（3%BSA稀釋，稀釋比例為1:400)，室溫避光孵育lh， 冰PBS洗 3 次X5min;
[0065](6)采用含DAPI封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照。
[0066]2.1.5視網膜免疫組織化學染色
[0067] 2.L5· 1取材及石蠟切片制備
[0068] 同 2. 1. 3. 1. 1 和 2. 1. 3. 1. 2.
[0069] 2. 1. 5. 2免疫組織化學染色
[0070] (1)石蠟切片置于65°C烤箱烘烤2小時，取出后冷卻至室溫；
[0071] (2)二甲苯脫臘（二甲苯11〇11^11-二甲苯111〇1^11)，梯度酒精水化（100%乙醇 I5min- 100 % 乙醇II5min- 95 % 乙醇lOmin- 80 % 乙醇lOmin)，自來水洗lmin，蒸饋 水洗lmin;
[0072] (3)切片浸入PH= 6. 4檸檬酸鹽緩沖液，微波加熱，高火加熱lOmin后，低火加熱 lOmin，從微波爐取出后冷卻至室溫，浸入蒸餾水洗5min;
[0073] (4)將切片置于3%H202,水平震蕩5min，蒸餾水洗5min
[0074] (5)加入5%BSA封閉液，室溫孵育lh，甩掉封閉液，勿洗；
[0075] (6)每塊組織滴加 30ul-抗Z〇-l(稀釋比 1 :100)、occludin(稀釋比 1 :100)、 claudin-5(稀釋比 1 :100)、ICAM-1(稀釋比 1:100)、VCAM-1(稀釋比 1:200)置于濕盒中 4°C孵育過夜，0. 1 %PBS水平震蕩洗3次，5min/次；
[0076] (7)滴加30ul生物素標記的二抗（山羊抗兔或山羊抗小鼠）（稀釋比1 :200)，室 溫下孵育lh，0. 1 %PBS水平震蕩洗3次，5min/次；
[0077] (8)滴30ul辣根過氧化物酶-生物素偶聯的三抗，室溫下孵育2h，0. 1 %PBS水平 震蕩洗3次，5min/次；
[0078] (