間充質干細胞分泌的外泌體在制備防治丙型肝炎病毒藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體地說，是間充質干細胞（mesenchymalstemcell, MSC)中的外泌體提取制備的方法及其在防治丙型肝炎病毒中的應用。
【背景技術】
[0002] 間充質干細胞（mesenchymalstemcells,MSCs)是具有治療效果的一種前 體祖細胞（JungY,BauerG,NoltaJA.Concisereview:Inducedpluripotentstem cell-derivedmesenchymalstemcells:progresstowardsafeclinicalproducts. Stemcells. 2012;30:42-47)。報道顯示，它能緩解炎癥，調節免疫反應及促進組織再生 (ShiΜ,ZhangZ,Xu民，etal.Humanmesenchymalstemcelltransfusionissafeand improvesliverfunctioninacute-on-chronicliverfailurepatients.Stemcells translationalmedicine. 2012 :1:725-731)D目前，MSC作為治療方法已經進入兩個2/3期 和四個3期臨床試驗中。人腑帶間充質干細胞是通過非侵入手段從人腑帶組織中獲得的， 具有可長期傳代特性的MSC(QienW,LiuJ，Manuchehrabadi化etal.Umbilicalcordand bonemarrowmesenchymalstemcellseedingonmacroporouscalciumphosphatefor boneregenerationinratcranialdefects.Biomaterials. 2013 ;34:9917-9925)。人骨 髓、外周血分離的MSC也是通過醫療過程中，從剩余的醫療樣本中所提取的細胞。
[0003] 近期研究顯示，MSC的許多功能都是通過旁分泌的外泌體發揮作用化ordelas L,民ebmannV，LudwigAK,etal.MSC-derivedexosomes:anoveltooltotreat therapy-refractorygraft-versus-hostdisease.Leukemia. 2014 ;28:970-973)。夕h泌 體是由脂質雙分子膜構成的50-100nm的小囊泡，其中含有與其來源和功能密切相關的蛋 白質、脂質及核酸，其中核酸WmicroRNA為主。外泌體可通過與細胞膜融合的方式，將生 物學活性物質從供體細胞傳遞至受體細胞，發揮其生物學功能（Mesenchymalstemcell exosome:anovelstemcel1-basedtherapyforcardiovasculardisease.民egenerative medicine. 2011 :6:481-492)。因其外有細胞來源的脂質膜包裹，其內的生物學成分的 穩定性及活性得到較好的保護。近幾年研究顯示，外泌體既可攜帶感染性物質，也能傳 遞保護性分子化alamvokiΜ，DuΤ，RoizmanΒ.Cellsinfectedwithherpessimplex viruslexporttouninfectedcellsexosomescontainingSTING，viralmRNAs，and microRNAs.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStates ofAmerica. 2014:111:E4991_4996;MadisonMN,JonesPH,OkeomaCM.Exosomesin humansemenrestrictHlV-ltransmissionbyvaginalcellsandblockintravaginal replicationofLP-BM5murineAIDSviruscomplex.Virology. 2015 ;482:189-201)。但 關于間充質干細胞分泌外泌體的抗丙型肝炎病毒的作用，目前還未見報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供W間充質干細胞分泌的外泌體的制備方法，及其在防治丙型 肝炎中的應用。
[0005] 本專利將利用間充質干細胞來源的外泌體的特有的microRNA表達水平，提供其 在肝炎藥物研發、保肝食品和保健品中的應用，為microRNA的祀向治療提供新的思路。
[0006] 本發明的第一方面，提供了W廝帶、骨髓W及外周血間充質干細胞分泌的外泌體。
[0007] 其中間充質干細胞，可選自新鮮廝帶、骨髓W及外周血培養的人間充質干細胞，詳 細步驟參照實施例1。也可W通過美國ScienCell公司購得。
[0008] 本發明的第二方面，提供了上述間充質干細胞分泌的外泌體的制備方法。步驟如 下：
[0009]A.廝帶、骨髓W及外周血間充質干細胞的分離及傳代培養；
[0010] B.條件培養基的儲備，所述的條件培養基，為將去除血清的干細胞培養基加入間 充質干細胞，48-96h的培養上清液；
[0011]C.外泌體的提取、濃縮與純化。
[0012] 其中，步驟A較優的是：取新生兒的新鮮廝帶，經DMEM反復沖洗后，浸泡于含有 1 %青霉素、鏈霉素的L-DMEM中；10分鐘后，將組織取出并用組織剪剪成約1mm的組織塊； 將組織塊放入含有10%胎牛血清的L-DMEM培養基中，5% 0)2、37°C、95%濕度條件下進行 培養；約1周后可見廝帶間充質干細胞爬出生長，將組織塊去除，W0. 25%膜蛋白酶消化細 胞進行傳代培養。或將獲得的新鮮骨髓或者外周血樣本通過Ficoll梯度離屯、去除單核細 胞，隨后將細胞重懸于10%胎牛血清的α-最小必需培養基中，5%C02、37°C、95%濕度條 件下進行培養；兩天后更換培養基將未貼壁的細胞去除，并傳代培養。
[0013] 步驟B較優的是：將去除外泌體的干細胞培養基（制備方法請參照實施例1)加入 培養的間充質干細胞中，收取48-9化培養上清液，即為條件培養基。可將培養上清液暫時 凍存于-80°C冰箱，待收集至一定體積后（> 150ml)用來提取外泌體；
[0014] 步驟C較優的是：條件培養基于4°C300g，lOmin離屯、除去細胞碎片；條件培養基 依次在4°C、500g、lOmin及4°C、2000g、lOmin條件下離屯、去除死細胞及細胞碎片等雜質；隨 后培養基通過0. 22μm濾膜過濾；將過濾后的液體在4°C、105Xg、ISOmin進行超速離屯、，得 到含有間充質干細胞分泌的外泌體沉淀，加入200μ1PBS洗涂；再次4°C、105Xg、120min 超速離屯、，即得濃縮、純化的外泌體。
[0015] 本發明的第Ξ方面提供了上述間充質干細胞來源的外泌體在制備防治丙型肝炎 病毒藥物中的應用。
[0016] 進一步地，本發明提供了間充質干細胞分泌的外泌體在制備保肝或預防丙型肝炎 病毒感染的食品或保健品中的應用。
[0017] 將本發明所述的間充質干細胞分泌的外泌體用于體外抗丙型肝炎病毒（HCV)感 染，詳細步驟參照實施例2。
[0018] 本發明經實驗證明，間充質干細胞分泌的外泌體具有顯著的抗HCV感染，明顯下 調HCVRNA水平，為臨床治療丙型肝炎開辟新的途徑。
[0019] 本發明的優點在于：
[0020] 本發明為間充質干細胞分泌的外泌體提供了一種制備抗HCV藥物的用途。通過體 外建立的細胞培養來源的丙型肝炎病毒（HCVcc)，及易感祀細胞人肝癌Η址7細胞，對間充 質干細胞分泌的外泌體的抗HCV活性進行了體外實驗。結果顯示，間充質干細胞來源的外 泌體具有顯著的抗HCV活性，能顯著抑制病毒RNA水平。進一步實驗數據提示，此外泌體的 抗病毒活性主要是通過其包裹的高表達的4種具有抗HCV活性的microRNAs化et-7tmiR-1 45，miR-199aandmiR-221)起效的，可用于制備抗HCV的藥物。本發明不僅為間充質干細 胞分泌的外泌體提供了新的用途，也為尋找新型抗HCV藥物提供了來源；
【附圖說明】
[0021] 圖1間充質干細胞分泌的外泌體的Nanosi曲t鑒定圖，白色箭頭代表外泌體顆粒。 A為鑒定樣品中顆粒直徑的大小，B為鑒定樣品中顆粒散射圖。
[0022] 圖2間充質干細胞分泌的外泌體的Western Blot檢測CD81、CD63的圖。
[002引圖3實時定量PCR檢測間充質干細胞分泌的外泌體對肥Vcc感染祀細胞后胞內HCVRNA表達的影響。
[0024] 圖4免疫巧光檢測間充質干細胞分泌的外泌體對HCVcc感染祀細胞后胞內病毒 NS5A蛋白表達的影響。
[002引圖5間充質干細胞分泌的外泌體與化h7細胞解育后，細胞內具有抗肥V活性的miRNA的表達水平。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例和附圖，對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。
[0027] 本發明所用試劑和原料均市售可得或可按文獻方法制備。下列實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照工具書（著[美]J.莎姆布魯克，黃培堂譯，《分子克隆實驗指 南》，科學出版社）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028] 實施例1:間充質干細胞分泌的外泌體提取純化及鑒定
[0029] -、去外泌體血清培養基的制備
[0030] 將胎牛血清在4°C、150000g、12小時離屯、，W去除血清中的外泌體。將不含外泌體 的血清配成干細胞培養基。
[0031] 二、間充質干細胞分泌的外泌體的提取及純化
[0032] 在間充質干細胞的培養基更換為之前制備的去外泌體血清培養基，收取48-9化 培養上清液，可暫凍存于-80°C冰箱保存。待條件培養基收集到一定體積（約> 150ml)后 于4°C300g，lOmin離屯、除去細胞碎片；條件培養基依次在4°C、500g、10min及4°C、2000g、 lOmin條件下離屯、去除死細胞及細胞碎片等雜質；隨后培養基通過0. 22μπι濾膜過濾；將過 濾后的液體在4°C、105Χg、ISOmin進行超速離屯、，得到含有間充質干細胞分泌的外泌體沉 淀，加入200μ1PBS洗涂；再次4°C、105Xg、120min超速離屯、，即得濃縮、純化的外泌體。其 可長期保存于-80°C冰箱。
[003引立、間充質干細胞分泌外泌體的鑒定
[0034] 1)Nanosi曲t:取50微升樣品注射入專用管道（圖1)。A顯示了樣品顆粒峰值為 119nm，符合外泌體具有代表性的大小巧圖顯示了鑒定樣品中顆粒散射圖，箭頭標