間充質干細胞來源的外泌體的用圖
【技術領域】
[0001]本發明屬于藥物研發，細胞生物學、分子生物學領域。涉及間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)中活性成分外泌體(exosome)在制備治療眼科疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]目前已知間充質干細胞(MSC)在治療各種組織損傷以及免疫性疾病中發揮作用。我們也證明，MSC在包括視網膜缺血再灌注、糖尿病視網膜病變、葡萄膜視網膜炎、視網膜變性以及視網膜損傷等多種眼科疾病模型中具有治療作用。MSC可以從數種成人組織(包括骨髓、脂肪組織、臍帶血)分離，并離體擴充。然而，由于MSC細胞產品保存和運輸困難，存在移植存活率低及長期臨床應用可能存在致瘤隱患等不足使得其臨床應用受到限制，因此，尋找一種操作簡單、安全有效的基于MSC的非細胞療法顯得十分重要。
[0003]外泌體(exosome)是一種提取自細胞培養基上清的膜性囊泡，含有其來源細胞的胞膜和胞質蛋白成分，因此它較易與鄰近細胞的胞膜發生融合，進而將一個細胞的胞膜及胞質蛋白傳遞給另一個細胞，在不同細胞間進行信息傳遞。此外，許多細胞包括MSC分泌的外泌體還包含著能夠在細胞間進行轉移的RNA(mRNA及microRNAs)，通過在細胞間水平轉移方式激活靶細胞產生一些列生物學效應。因此，外泌體在細胞微環境中具有十分重要的作用。
[0004]Bruno等研究發現MSC可分泌一種直徑80nm_l μ m大小的非可溶性微泡，它對急性腎損傷具有修復作用。這些從MSC上清中分離出來的微泡在體外能夠促進腎小管上皮細胞的增殖及抗凋亡，將其標記后注射到急性腎損傷動物模型體內，可發現微泡在6h內即在腎損傷部位發生了聚集。2010年，新加坡學者發現MSC細胞分泌的exosome可以減少心臟再灌注損傷。MSC分泌的exosome直徑約50-100nm，經免疫共沉淀后發現，exosome表達0)81、⑶9、Alix等蛋白。他們將exosome注入小鼠心肌缺血/再灌注模型，發現可以減少梗塞面積。因此，MSC來源的exosome具有保護心臟的功能。臍帶血來源的MSC分泌的exosome也用于緩解肝纖維化。研究表明，臍帶血MSC-exosome可減少肝臟表面的纖維化，使之恢復較軟的質地，緩解肝臟炎癥。在CCL4誘導的肝纖維化模型中，可減少1、3型膠原沉積。這些研究表明，MSC可通過旁分泌外泌體在細胞間進行信息傳遞進而通過某種機制對受損組織進行修復，這一旁分泌機制為基于MSC的非細胞治療奠定了重要基礎。
[0005]本發明的目的是提供一種間充質干細胞來源的外泌體(exosome)在制備治療眼科疾病藥物中的新用途，為臨床治療眼科疾病開辟新途徑。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種間充質干細胞來源的外泌體(exosome)在制備治療眼科疾病藥物中的應用。
[0007]本發明采用的技術方案為:
[0008]本發明提供了一種間充質干細胞來源的外泌體(exosome)在制備治療眼科疾病藥物中的應用。
[0009]所述的間充質干細胞為人臍帶來源的間充質干細胞、人胎盤來源的間充質干細胞或人脂肪來源的間充質干細胞。優選地，所述的間充質干細胞為人臍帶來源的間充質干細胞或人胎盤來源的間充質干細胞。更優選地，所述的間充質干細胞為人臍帶來源的間充質干細胞。
[0010]所述的眼科疾病包括葡萄膜炎、視網膜脫離、視網膜變性、各種原因導致的視網膜損傷和炎癥。
[0011]本發明提及的間充質干細胞來源的外泌體，具有如下特征:直徑約為50-100nm，具有脂質膜，內包裹蛋白質和mRNA、micr0RNA等遺傳物質。⑵經蛋白分析含有⑶9、⑶81、Alix等蛋白分子，以及與間充質干細胞標記物一致的蛋白分子⑶44、⑶29。
[0012]本發明提及的間充質干細胞來源的外泌體(exosome)，由包括如下步驟的方法制備得到:
[0013](I)間充質干細胞的分離培養:
[0014]根據間充質干細胞來源不同，采用不同的分離培養方式:
[0015]①人臍帶間充質干細胞的分離培養:取無菌新生兒新鮮臍帶，經磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗后，剪成直徑約l_2mm的組織塊；經2型膠原酶和胰酶消化依次后，將上清液離心，取細胞沉淀放入培養瓶，使用含10%胎牛血清DMEM/F12培養基，5% C02、37°C飽和濕度培養；去除非貼壁細胞，在貼壁細胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養；
[0016]②人胎盤間充質干細胞的分離培養:剪取胎盤絨毛膜面l-2cm厚的組織，剪成l-2mm的碎塊，用磷酸鹽緩沖液漂洗至無色，用Dispase II型酶和4型膠原酶37°C水浴消化I小時，振蕩后靜置，液體自然分為三層，吸取中間層懸液于離心管中，加入磷酸鹽緩沖液混勻后離心，棄上清，取細胞沉淀放入培養瓶，使用含10%胎牛血清DMEM培養基，5% CO2,37°C飽和濕度培養；去除非貼壁細胞，在貼壁細胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養；
[0017]③人脂肪間充質干細胞的分離培養:無菌吸取脂肪抽提液，用磷酸鹽緩沖液沖洗數次。去除吸脂手術中所用藥物及血細胞，用I型膠原酶37°C消化I小時，間或攪拌；離心后棄去上層脂肪，混勻，用200目篩網過濾，將所獲得的細胞懸液離心，細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌，用10%胎牛血清的a-MEM培養液懸浮，轉移至培養瓶中，5% C02、37°C飽和濕度培養；在貼壁細胞80%融合后0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養；
[0018](2)間充質干細胞條件培養基的收集:取3-5代的間充質干細胞無血清培養48h ;收集培養上清液；0.22 μ m無菌膜過濾得到間充質干細胞條件培養基；
[0019](3) exosome分離純化包括:收集過濾的間充質干細胞條件培養基4°C，100g離心lOmin，收集上清；收集的上清液4°C，2000g離心20min，收集上清；收集的上清液4°C，1000g離心30min，收集上清；收集的上清液，I 1000g離心70min，棄上清，使用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀；再次IlOOOOg離心70min，棄上清，少量磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，0.22 μ m濾膜過濾除菌，得到間充質干細胞來源exosome。
[0020]將人臍帶間充質干細胞來源的exosome用于治療眼科疾病模型的效果評價:(I)視覺電生理檢查；(2)臨床觀察及評分；(3)視網膜病理切片觀察；(4)流式細胞術檢測。
[0021]所述的眼科疾病模型包括：小鼠視網膜損傷模型、大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎模型、小鼠視網膜脫離模型。可模擬的眼科疾病包括：葡萄膜炎、視網膜脫離、視網膜變性以及其他各種原因導致的視網膜損傷和炎癥。
[0022]利用人臍帶間充質干細胞來源的exosome作為藥物局部注射小鼠視網膜損傷模型、大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎模型、小鼠視網膜脫離模型，實驗證明，exosome具有神經營養以及免疫抑制作用，能減輕各種原因導致的視網膜損傷、減輕炎癥反應，從而改善視網膜功能，為臨床治療眼科疾病開辟新途徑。
[0023]本發明所具有的有益效果：
[0024]本發明提供了間充質干細胞來源的外泌體（exosome)在制備治療眼科疾病藥物中的應用。exosome具有神經營養以及免疫抑制作用，能減輕各種原因導致的視網膜損傷、減輕炎癥反應，從而改善視網膜功能，為臨床治療眼科疾病開辟新途徑。
【附圖說明】
[0025]圖1掃描電鏡下觀察exosome，可見exosome直徑約為50?100nm，有完整的脂質膜，小體中心呈低電子密度成分，圓形或橢圓形的膜性囊泡結