一種基于外泌體的促人骨髓間充質干細胞增殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，主要涉及早代的人臍帶間充質干細胞外泌體在促進人骨髓間充質干細胞生長中的應用，也即一種促進人骨髓間充質干細胞生長的方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，經誘導后可分化為多種組織和細胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反應，是再生醫學中一種較為理想的種子細胞(參見文獻:Dominici，M.，Le Blanc, K., Mueller, 1., Slaper-Cortenbach, 1., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating,A., Prockop, D., and Horwitz, E.(2006)Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells.The Internat1nal Society for Cellular Therapyposit1n statement.Cytotherapy.8, 315-317)。人骨髓間充質干細胞(human bonemesenchymal stem cells, hBMSCs)在可以通過體外擴增的方式培養，但在體外培養中，隨著培養代數的增加，hBMSCs逐漸顯示出衰老的特征，即生長速度逐漸變慢，并逐漸喪失向各胚層分化的能力，細胞形態也由長梭形變得扁平粗大，繼而失去臨床應用價值(參考文獻:Sethe S, Scutt A, Stolzing A.Aging of mesenchymal stem cells [J].Ageing ResRev, 2006,5(1):91-116)。每次從骨髓原代培養，能夠用于細胞治療的hBMSCs數量非常有限。
[0003]在實驗室中通常在培養基中添加了胎牛血清(FBS)成分來促進骨髓間充質干細胞生長，但是該方法增加了收獲細胞攜帶病原體、異種抗原的可能性，并常導致批間不穩定性產生。美國FDA明確禁止將FBS培養的細胞用于細胞治療。因此，尋找新的可應用于臨床細胞治療的hBMSCs培養基添加物具有重要價值。
[0004]臍帶間充質干細胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,hUMSCs)作為另一種組織來源的間充質干細胞，與hBMSCs相比，hUMSCs具有更強的增殖能力和分化潛能(參考文獻:ffeiss, M.L., Medicetty, S., Bledsoe, A.R., Rachakatla, R.S., Choi, M., Merchav, S., Luo, Y., Rao, M.S., Velagaleti, G., and Troyer, D.(2006)Human umbilical cordmatrix stem cells:preliminary characterizat1n and effect of transplantat1n ina rodent model of Parkinson’s disease.Stem cells.24，781-792)。因此，本發明人設想，采用人臍帶間充質干細胞分泌的成分作為添加物，促進人骨髓間充質干細胞的生長，提高最終細胞得率和質量。
[0005]外泌體是近年來發現的一種干細胞分泌的重要成分。外泌體是一種直徑在30-100nm之間的脂質雙分子囊泡，可攜帶細胞特異性表達的核酸、脂質、蛋白質等。外泌體通過細胞胞吐的方式分泌，當外泌體在外環境中與靶細胞接觸后，可以通過胞膜融合的方式將生物分子傳遞給革E細胞(參考文獻:Simpson RJ，Lira Jff, Moritz RL，et.Exosomes:proteomic insights and diagnostic potential[J].Expert Rev Proteomics，2009，6 (3):267-283)。外泌體作為干細胞分泌物中的重要成分此前有過相關報道，但用于促進細胞體外增殖的報道僅有一例:申請號CN201410705462.3，公開號為CN104382827A的中國專利申請人羊膜間充質干細胞外泌體的用途公開了羊膜間充質干細胞外泌體通過抗氧化應激、抗光老化作用促進HDF細胞的生長的應用方法。但是鑒于不同來源甚至不同培養方式的干細胞分泌的外泌體成分顯著不同，不同細胞的培養基配方、生長依賴條件截然不同，無法將其報道的羊膜間充質干細胞外泌體促進HDF細胞生長作用簡單類推至其他來源外泌體促進其他類型細胞的作用。因此，干細胞分泌的外泌體能否用于體外促BMSCs增殖生長，目前沒有任何文獻及專利進行公開報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供人臍帶間充質干細胞外泌體在制備促進人骨髓間充質干細胞生長試劑中的應用，本發明的另一目的在于提供一種促進骨髓間充質干細胞生長的方法，本發明的第三目的在于提供人臍帶間充質干細胞外泌體的提取方法。
[0007]經過本發明人的研究，發現人臍帶間充質干細胞分泌的外泌體成分具有促BMSCs生長作用，主要體現為細胞周期S期的比例的增加和細胞倍增時間減少。本發明人將標準化制備后的人間充質干細胞外泌體作為人骨髓間充質干細胞培養基的添加成分，促進人骨髓間充質干細胞增殖和質量提升，相關研究尚未有文獻及相關專利涉及。
[0008]本發明提供了人臍帶間充質干細胞外泌體在促進人骨髓間充質干細胞增殖中的作用，可縮短細胞倍增時間，增加細胞周期S期的比例。
[0009]本發明提到的人臍帶間充質干細胞外泌體由早代(二代以內)的臍帶間充質干細胞分泌，并通過一定的步驟提取，可以以液態在冰箱中長期保存(_20°C以下)并保持活性。使用時將外泌體添加入人BMSCs培養基，使外泌體在培養基中的終濃度為20 μ g/ml即可。
[0010]本發明的第一方面在于提供人臍帶間充質干細胞外泌體在制備促進人骨髓間充質干細胞生長試劑中的應用。
[0011]本發明所述的人臍帶間充質干細胞外泌體由早代(第一代或第二代)的臍帶間充質干細胞分泌的。
[0012]所述的分泌方法，可以參考文獻:Rani，S.，Ryan,A.E.，Griffin, M.D.，andRitter,T.(2015)Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles:TowardCell-free Therapeutic Applicat1ns.Molecular therapy: the journal of theAmerican Society of Gene Therapy.23，812-823。
[0013]在本發明的一個優選實施例中，本發明所述的人臍帶間充質干細胞外泌體，是通過以下方法制備得到的:
[0014](1)采用第二代臍帶間充質干細胞置于10cm培養皿中，加入10ml間充質干細胞培養基(可采用商品化培養基或自行配置培養基)，37 °C、5 % C02飽和濕度培養24h后收集上清;
[0015]所述的人臍帶間充質干細胞培養基，優選配方為:含質量百分比5%UltraGR0(達科為公司)和含質量百分比0.032%醫用肝素鈉的α -MEM基礎培養基(gibco公司)。(2)將收集的臍帶間充質干細胞上清25ml于4°C，1 OOOXg離心lOmin，以去除死細胞等雜質，然后將去除雜質的上清于4°C，1 0000Xg離心20min以去除細胞碎片，然后將去除雜質的上清移至超速離心管，于4°C，120000X g離心60min，去除上清，加入400 μ 1 PBS收集底部沉淀，最后通過0.22 μ m無菌濾膜過濾，分裝后放于-80°c保存，并用BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白質濃度測定；
[0016](3)通過透射電鏡觀察外泌體形態和western blot方法檢測外泌體標志蛋白⑶9和CD63的表達情況，來對臍帶間充質干細胞外泌體進行鑒定。
[0017]所述的促進人骨髓間充質干細胞生長試劑，包含人臍帶間充質干細胞外泌體，還包含人骨髓間充質干細胞生長的常規培養基。
[0018]較優的，將本發明的臍帶間充質干細胞分泌的外泌體用于人骨髓間充質干細胞共培養，即將人臍帶間充質干細胞外泌體加入人骨髓間充質干細胞生長的常規培養基中。
[0019]在本發明的一個優選實施例中，使用時將上述人臍帶間充質干細胞來源外泌體以終濃度10-20 μ g/ml (優選20 μ g/ml)添加入人BMSCs培養基即可。
[0020]所述的人BMSCs培養基為，含質量百分比5% UltraGRO(達科為公司)和含質量百分比0.032%醫用肝素鈉的α -MEM基礎培養基(gibco公司)。
[0021]所述人臍帶間充質干細胞來源外泌體以終濃度20 μ g/ml添加入人BMSCs培養基的具體步驟為:
[0022]在α -MEM基礎培養基中按比例依次加入質量百分比5%的UltraGRO和質量百分比0.032%的醫用肝素鈉，再以20 μ g/ml的終濃度按比例加入人臍帶間充質干細胞來源外泌體，最后將培養基放置于4°C保存，使用保質期為一個月。
[0023]本發明的第二方面在于提供一種促進骨髓間充質干細胞生長的方法。
[0024](1)制備培養基:將上述人臍帶間充質干細胞來源外泌體以終濃度10-20 μ g/ml (優選20 μ g/ml)添加入人BMSCs培養基。
[0025](2)將人骨髓間充質干細胞(骨髓原代培養，骨髓來源于長征醫院骨科，制備方法參考文獻:Majumdar, Μ.K.，Banks, V.，Peluso, D.P.，and Morris, E.A.(2000)Isolat1n, characterizat1n, and chondrogenic potential of humanbone marrow-derived multipotential stromal cells.Journal of cellularphys1logy.185，98-106)按每孔1 000個細胞的濃度接種到96孔板，然后加入定量蛋白濃度后人臍帶間充質干細胞外泌體，即加入上述步驟(1)得到的加入人臍帶間充質干細胞來源外泌體的人BMSCs培養基，并設置空白對照組。
[0026](3)培養條件:將細胞放置于37°C、5% C02飽和濕度二氧化碳培養箱，過6h、12h、24h、36h后細胞計數，繪制細胞生長曲線。如附圖3所示，加入人臍帶間充質干細胞外泌體后，細胞生長速度變快。
[0027]本發明的第三方面在于提供人臍帶間充質干細胞外泌體的制備方法，所述的制備方法優選如下:
[0028](1)采用第二代臍帶間充質干細胞置于10cm培養皿中，加入10ml間充質干細胞培養基(可采用商品化培養基或自行配置培養基)，37°C、5% C02飽和濕度培養24h后后收集上清。
[0029](2)將收集的臍帶間充質干細胞上清25ml于4°C，1 OOOXg離心lOmin，以去除死細胞等雜質，然后將去除雜質的上清于4°C，1 0000Xg離心20min以去除細胞碎片，然后將去除雜質的上清移至超速離心管，于4°C，120000 Xg離心60min，去除上清，加入400 μ 1PBS收集底部沉淀，最后通過0.22 μ m無菌濾膜過濾，分裝后放于_80°C保存，并用BCA蛋白質定量試劑盒進行蛋白質濃度測定。
[0030](3)通過透射電鏡觀察外泌體形態和western blot方法檢測外泌體標志蛋白⑶9和CD63的表達情況，來對臍帶間充質干細胞外泌體進行鑒定。
[0031]本