含有一種細胞培養基的美容品或皮膚藥用組合物的制作方法

含有一種細胞培養基的美容品或皮膚藥用組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及含有一種細胞培養基的美容品或皮膚藥用組合物，特別是一種含有一種調理細胞培養基或其提取物的美容品或皮膚藥用組合物，所述的培養基能夠通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得。本發明也涉及調理細胞培養基改善皮膚動態平衡的用途。
【專利說明】含有一種細胞培養基的美容品或皮膚藥用組合物
[0001]本申請是申請號為200810092072.8，申請日為2008年2月25日，發明名稱為“含有一種細胞培養基的美容品或皮膚藥用組合物”的中國專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種調理(conditioned)培養基和它的用途，特別是改善皮膚或粘膜動態平衡。本發明因此涉及在美容品或皮膚科學領域的用途，但本發明也涉及在重建皮膚、制備方法領域和其因此可以被根據本發明的調理培養基或其提取物改良的性質。
【背景技術】
[0003]人類皮膚由兩層組成，稱為表層，上皮層，和深層，真皮層。
[0004]表皮主要是由三種類型的細胞構成的，即角質化細胞(主要的)、黑色素細胞和郎格罕氏(Langerhans )細胞。這些細胞類型中的每一個借助它固有的功能在人體內皮膚位置起到重要的作用，特別是保護人體對抗外來攻擊的作用。真皮為表皮提供牢固的支撐。它也是供養要素。它主要由成纖維細胞和細胞外基質組成，它本身主要是由膠原、彈性蛋白和基質構成。其中也可以找到白細胞、肥大細胞和組織巨噬細胞。最后，血管和神經纖維橫貫真皮層。
[0005]皮膚構成了一個屏障對抗外來攻擊，特別是:化學的、機械的和感染性的攻擊，和在這方面，在這里發生的對抗環境因素(氣候、紫外線、煙草、污染、傳染等等)和/或生物體內異物因素(例如，某藥劑)的若干防御反應。
[0006]因此，保持或重建它的多種功能的完整性和平衡是必要的，特別是細胞的更新和分化過程，或最佳濕度。一般性術語“皮膚動態平衡”指的是普通皮膚的功能和生理平衡的維持。
[0007]因此，需求一種維持這種皮膚動態平衡的具有新穎性的方法，特別是維持屏障功能，或對抗皮膚脫水或衰老的癥狀。
[0008]也需要一種改良的培養基，該培養基能夠使制備單細胞、多細胞或單層模型或以重建組織形式的模型成為可能，且特別是從皮膚細胞以制備角化細胞培養物、成纖維細胞、角化細胞/黑素細胞共同培養物或重建皮膚。
[0009]這些目的和其他的一些目的都通過“細胞”培養基或其提取物(也稱作調理培養基)的用途實現。
[0010]專利申請WO 02/098365 (高級組織科學)給出了調理培養基用于美容品或藥物應用的用途。調理培養基是通過培養人皮膚細胞獲得的，特別是成纖維細胞或角質化細胞。這些細胞被遺傳性的修飾以增加它們生長因子或培養基中抗氧化劑的產量，其通常包含可溶性膠原。
[0011]US2005/0249691描述了美容品或皮膚用組合物，包括與凝膠基質結合，用于皮膚或角質層細胞的培養基；組合物必須包含膠原、殼聚糖和氨基多糖。
[0012]US2006/0182701還描述了美容品或皮膚用組合物，包括用于皮膚細胞的培養基。其目的的是為組合物的施用的皮膚細胞提供一個培養基，所述培養基將允許皮膚細胞按其在體外被獲得的類似方式生長。
[0013]出人意料的，本發明發現，以完全不同于皮膚細胞的細胞調理的培養基可以被用于促進皮膚的或它的附屬物保持完好狀態，

【發明內容】

[0014]因此，本發明的目的是一種含有調理細胞培養基或其提取物的美容品或皮膚藥用組合物，所述的培養基能夠通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得。
[0015]有益的，細胞培養基，根據本發明還可以稱為調理培養基，可以通過接觸外周血細胞,或源于外周血細胞的細胞來獲得。這些細胞特別是白細胞，但也可以選自永生細胞株，來源于血細胞系，例如來自單核細胞；這些細胞非限定性的實施例是由LGCPromochem按照下列名稱出售的那些:
[0016]SC(ATCC:CRL-9855)
[0017]AML-193(ATCC:CRL-9589)
[0018]THP-1(ATCC:TIB-202).[0019]這些外周血細胞或它的派生物，例如白細胞可以，例如，在消化道細胞的培養基的培養物中。
[0020]優選的，這些白細胞主要包含淋巴細胞，但還可以包含其他外周血細胞例如單核細胞，其被與培養基接觸。
[0021]根據本發明一 個有益的實施例，消化道細胞培養物是三維培養物。
[0022]被用于實現本發明的消化道細胞可以來源于消化道的不同部分，例如食管、胃或腸。有益的，使用來源于腸道上皮的細胞；這種腸道上皮細胞是本領域技術員已知的。作為非限定性的實施例，腸來源的人細胞制備的稱為CaC02、HT29或T84。
[0023]相應的株被保藏在ATCC的培養物保藏中心，編號如下:
[0024]Caco2:ATCCN0.HTB-37
[0025]HT29:ATCCN0.HTB-38
[0026]T84:ATCCN0.CCL-248
[0027]對于本發明的目的的，術語“益生菌微生物”是用來意指一個活的微生物，其被使用足夠數量時，對它的宿主的健康具有積極的效果，“joint FA0/WH0 Expert Consultationon Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotic in FoodIncluding Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria (聯合 FA0/WH0 專家鑒定食物中益生菌對健康的價值和營養性質，包括具有活乳酸菌的奶粉)，2001年10月6日”，并且其可以特別改善腸道的微生物平衡。
[0028]益生菌可以用活細胞混懸液的形式引入細胞培養基，其濃度可以由本領域技術人員根據混合物其他成分的量來調整。作為啟示，可以使用包括大約IO4到109cfu/ml的接種物(cfu表示“集落形成單位”，即“能形成一個集落的單位”),優選至少105cfu/ml。益生菌接種物可以通常濃度為大約IO6到107cfu。
[0029]適合本發明的微生物可以特別選自子囊菌(ascomycetes)例如酵母(Saccharomyces)、耶羅威亞酵母(Yarrowia)、克盧費氏酵母屬(Kluyveromyces)、有抱圓酵母屬(Torulaspora)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、德巴利酵母屬(Debaromyces )、假絲酵母(Candida)、畢赤氏酵母(Pichia)、曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penici 11 ium)，和如下屬的細菌:雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、畸形菌體(Bacteroides)、梭菌屬(Fusobacterium)、蜜蜂球菌屬(Melissococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)λ 腸球菌(Enterococcus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、消化鏈球菌屬(Peptostrepococcus)、桿菌(Bacillus)、小球菌屬(Pediococcus)、微球菌(Micrococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、乳球菌屬(Oenococcus)或乳桿菌屬(Lactobacil Ius )，和其混合物。
[0030]作為最適合于本發明的子囊菌(ascomycetes)，特別的提及耶羅威亞酵母(Yarrowialipolitica)和乳酸克魯維斯酵母(Kluyveromyces Iactis)，以及有抱圓酵母屬(Torulaspora)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假絲酵母(Candida)和畢赤氏酵母(Pichia)，或者可替換的酵母，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酵母菌(boulardii)。
[0031]關于益生菌微生物，通常使用下列細菌和酵母屬:
[0032]—乳酸菌(lactic acid bacteria):其通過發酵糖產生乳酸。它們按照形態學被分為兩個群:
[0033]?乳桿菌類(Lactobacillus species):嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus (LC1，NCFB 1748));乳酸桿菌(amylovorus)、干酪乳桿菌(casei (Shirota))、鼠李糖乳桿菌(rhamnosus (strainGG))、短乳桿菌(brevis)、卷曲乳桿菌(crispatus)、德氏乳桿菌(delbrueckii (保加利亞亞種subsp bulgaricus，lactis))、發酵乳桿菌(fermentum)、瑞士乳桿菌 (helveticus)、雞乳桿菌(gal I inarum)、格氏乳酸桿菌(gasseri johnsonii)、副干酪乳桿菌(paracasei)、植物乳桿菌(plantarum)、羅伊氏乳桿菌(reuteri)、鼠李糖乳桿菌(rhamnosus)、唾液乳桿菌(salivarius))、消化乳桿菌(alimentarius)、彎曲乳桿菌(curvatus)、干酪乳桿菌干酪亞種(casei subsp.Casei)、清酒乳桿菌(sake)；
[0034]# Gocc1:腸球菌(Enterococcus)(糞腸球菌 faecalis、尿腸球菌 faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis (subspp Iactis或cremoris))、腸膜明串珠菌葡聚糖亞種(Leuconstoc mesenteroides subsp dextranicum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、嗜酸芽抱乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)、 Streptococcussalvarius subsp.Thermophilus、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)；
[0035]一雙歧桿菌或雙歧桿菌屬類:青春雙歧桿菌(adolescentis)、動物雙岐桿菌(animal is)、兩歧雙歧桿菌(bifidum)、短雙岐桿菌(breve)、乳雙歧桿菌(lactis)、長雙歧桿菌(longum)、嬰兒雙歧桿菌(infantis)、假小鏈雙歧桿菌(pseudocatenulatum)；
[0036]一其他生成孢子的細菌:桿菌(Bacillus) (Toyo菌cereus var toyo或枯草芽孢桿菌subtil is)、凝結芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、Escherichia coli strain nissle、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)。
[0037]特定的益生菌微生物實施例是青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescent is)、動物雙岐桿菌(Bifidobacterium animal is)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、假小鏈雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus (LCI，NCFB1748));食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei (Shirota))、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus (GG菌株))、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii (保加利亞亞種 subsp bulgaricus, lactis))、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、雞乳酸桿菌(Lactobacillus gal I inarum)、格氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri )，Lactobacillusjohnsonii λ 副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)λ 羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri )、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)λ 唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、消化乳桿菌(Lactobacillusalimentarius)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei subsp.casei)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sake)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、腸球菌(Enterococcus (類腸球菌 faecalis、尿腸球菌 faecium))、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis (subspp lactis或cremoris))、腸膜明串珠菌葡聚糖亞種(Leuconstoc mesenteroides subsp dextranicum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、嗜酸芽抱乳酸菌(Sporolactobacillus inulinus)、Streptococcussalvarius subsp.Thermophilus、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、酵母(Saccharomyces (cerevisiae 或其他的 boulardii))、桿菌 Bacillus (Toyoi 菌 cereusvar toyo或枯草芽孢桿菌subtil is)、凝結芽胞桿菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、Escherichia coli strain nissle 和費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii),和它們的混合物。
[0038]有益的，至少一 個益生菌微生物是選自乳酸菌(lactic acid bacteria)、雙歧桿菌(bifidobacteria)和酵母菌(Saccharomyces yeasts)的。
[0039]更特別的，它們是來源于乳酸菌群的益生菌微生物，例如尤其是乳桿菌屬和/或雙歧桿菌屬，特別乳桿菌屬。作為這些乳酸菌的例證，更特別的可提及Lactobacillusjohnsoni1、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)λ 副干酷乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、Lactobacillus casei 或兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙岐桿菌(Bifidobacterium breve)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、動物雙岐桿菌(Bifidobacterium animalis)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)或假小鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)，和它們的混合物。
[0040]最適合的種類是Lactobacillus johnsoni1、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)> 青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)和乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactisNCC2818)(也標識為Bb12ATCC27536 );還可以特別提及下列菌株，按照布達佩斯條約保藏在culturecollection of the Institut Pasteur (28rue du Docteur Roux, F_75024Pariscedexl5)的 30/06/92、12/01/99、15/04/99、15/04/99 和 07/06/05 =Lactobacillusjohnsonii(CNCM1-1225)、Lactobacillus paracasei(CNCM1-2116)、Bifidobacteriumadolescentis(CNCM1-2168)和 Bifidobacterium 1ngum(CNCM1-2 170)和Bifidobacterium lactis(CNCM1-3446)、和屬 Bifidobacterium longum(BB536)。Bifidobacterium IactisCNCM1-3446 株可以獲自 Hansen(Chr.HansenA/
S,10_12BoegeAlle, P.0.Box407, DK-2970Hoersholm, Denmark)。
[0041]用于與細胞接觸的細胞培養基是適合所使用的不同類型的細胞存活和/或培養的任何營養培養基。其通常包含碳和氮源、礦物質、維生素和/或痕量元素，例如氨基酸、糖、蛋白質和脂肪酸。
[0042]細胞可以在它們的來源組織之外培養。為此，它們將在接近于它們在組織中的自然條件的環境下培養。這些培養在它們的培養基中需要基本的因子。該環境應該具有確定的由礦物質和生物材料組成的組合物，被稱為培養基。所述培養基通常由專業的供應商提供，并且根據細胞類型具有特定的特征。培養基通常還包含適當數量的水、碳和氮源、磷酸鹽和硫酸鹽、礦物質、生長因子和維生素。
[0043]在這種類型的培養基種培養的細胞通常需要添加血清。所述血清具有復雜的組分，并至少為細胞提供激素、粘附因子和氨基酸。該血清可以，例如，全部或部分被本發明的調理培養基的添加所替代。事實上，調理培養基也可以另外被添加到培養基中，如同增濃。
[0044]本領域技術人員能容易的確定合適的培養基。非限定性的，可提及的有RPMI1640培養基、Dulbecco' sModified Eagle’s 培養基(DMEM)，、最小基本培養基(MEM)、M199、RPMI1640 或 Iscove’ s M odified Dulbecco's 培養基(EDMEM)、Ham’ sF_12、Ham’ sF-10、NCTC109 和 NCTC135。
[0045]這些培養基可以以通常被用于細胞培養的任何添加劑補充，例如，非限定性的，磷脂前體、非必需氨基酸、核酸、維生素、抗生素、酶輔助因子、無機鹽、胰島素、轉鐵蛋白、三碘甲腺原氨酸、乙醇胺、O-磷酸乙醇胺或生長因子例如神經生長因子或神經營養因子_3。
[0046]通常被用來補充細胞培養基的各種添加劑的濃度可以被本領域技術人員特別地根據被培養的細胞的類型確定和調整。
[0047]其他的培養基描述于Ham 和 McKeehan, “MethodsinEnzymology”，58:44-93，1979中，或于 Bottenstein 等，“Methods in Enzymology ”，58:94-109，1979，其內容在此引入
作為參考。
[0048]此外，還可以使用不同培養基的混合物，特別是上述培養基的，例如DMEM/HAMF12的混合物。這些培養基可以由特定生長因子補充，或例如血清，不過后一組分也可以不補充。
[0049]根據一個實施例，沒有膠原被添加到培養基中。
[0050]所述培養基可以是液體、半液體、凝膠或固體，優選至少部分是液體。
[0051]措詞“調理培養基的提取物”是用來特別意指通過透滲析、分餾法、相分離、凝膠過濾層析、親和色譜法、沉淀、濃縮、凍干法等方法得到的所述調理培養基的部份或亞化合物。
[0052]調理培養基可以從缺少血清和動物產品的培養基中產生。該調理培養基優選在存在人白細胞的情況下(并且特別是乳桿菌屬或雙歧桿菌屬類的益生菌存在下)由消化道細胞的刺激之后得到，具有益生菌。
[0053]有益的，被用于本發明組合物的培養基(或它的提取物)是穩定了的培養基，即，它已經經受了用于保存其在選擇的給定瞬間的狀態的操作，通常是在制備過程的最后，同時已經保存了它的固有性狀。特別的，該操作是用來使所述培養基變得無菌的，即，能夠抑制微生物生長，同時保存了其具有的生物學性質。培養基的穩定可以通過本領域技術人員已知的任何方法獲得，例如，滅菌過濾、高壓蒸汽滅菌、超高溫(UHT方法)、高壓滅菌、Y -輻射或冷凍。根據本發明的條件培養基通常包含IL-10，其不存在于起始培養基的任何組分中。IL-10的量可以根據條件培養基的制備情況改變，但通常相應的在與不同細胞型接觸之后回收的培養基中的濃度大于或等于20pg/ml。
[0054]預料不到的是該調理培養基具有對皮膚和/或體表(integument)有益的性質。
[0055]為此原因，本發明的目的也在于通過與如上所述的至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得的至少一種調理細胞培養基，或一種所述細胞培養基的提取物作為一種改善皮膚和/或體表動態平衡的制劑的美容品用途。
[0056]有益的是調理培養基可以通過進一步與外周血細胞或它的類似細胞特別是白細胞接觸獲得。
[0057]在本文的描述中，除非另作說明，術語“皮膚”是用來意指覆蓋人體的全部外層部分，即，皮膚、粘膜和頭皮。
[0058]術語“體表”指的是指甲、頭發和體毛，例如睫毛。
[0059]特別地，本發明涉及一種培養基或它的提取物用作改善皮膚或頭皮的屏障功能的制劑的用途。
[0060]根據本發明的另一方面，培養基或它的提取物是用作改善皮膚或頭皮濕度的制劑。
[0061]該培養基可以因此被特別用于對抗皮膚干燥癥狀，特別是干燥和敏感皮膚。
[0062]通常，敏感皮膚是通過皮膚的特殊反應界定。
[0063]這種皮膚反應通常通過不適癥狀表現反映出來的，這些不適癥狀是對于接觸到具有不同根源的觸發因素的個體的反應。這可以是在敏感皮膚表面應用美容品、食物攝取、或暴露在溫度急劇變化中、暴露在大氣污染中和/或暴露在紫外線或紅外線。相關因素諸如年齡和皮膚類型也存在。因此，敏感皮膚更通常是指基于美容品標準的皮膚分類的干性或油性皮膚。具有敏感皮膚的個體因此屬于具有易刺激或過敏的皮膚，或具有耐受力低的皮膚。
[0064]這些不適癥狀的表現，記載在下述接觸到具有不同根源的觸發因素的個體的記錄中的，是敏感皮膚的必要癥狀之一。它主要包括了觸物感痛性觸覺。術語“觸物感痛性觸覺”是指在一片皮膚上的感覺，如刺痛、癢、灼熱感、緊繃感等。這些主觀感受的癥狀大多通常缺少可見的化學性癥狀表現如發紅或脫皮，并且無論如何也不會出現水腫。當今公知的是這些皮膚易刺激反應和耐受力低的反應都特別是與上皮和真皮的神經末稍釋放的神經肽相關。[0065]在這些皮膚敏感的急性表現中，神經反應可能被觸發。它的長期結果可以導致炎癥反應和痛覺過敏反應持續，并因此導致該過程轉成慢性化。
[0066]不象記載的過敏皮膚那樣，敏感皮膚的反應表現并不是免疫反應過程的結果，SP，過敏反應的應答不僅發生在已經發生敏化的皮膚上。它的應答機制是術語“非特異性”。在這個方面，它是與皮膚病、濕疹和/或魚鱗癬癥的明顯炎癥和過敏反應區別開的。
[0067]在本發明的情況下，調理培養基具有阻斷和/或治療所述的敏感皮膚的作用，特別是當這種敏感皮膚與干性皮膚相關時。干性皮膚必然有緊繃和/或拉緊的感覺表現。它通常與皮膚濕度的下降和屏障功能的損傷相關，其通過微小的水分流失測量。
[0068]象上面特別指出的，敏感皮膚是不同于過敏皮膚的。它的反應表現不是免疫反應過程的結果，通常僅僅是觸物感痛性觸覺的反應，可能伴有發紅，但是沒有腫脹和水腫。
[0069]“敏感皮膚”可以特別使用工具評價皮膚的敏感反應來確定。第一個工具是基于他們的正確設計，基于干燥皮膚的必要特征性癥狀，即這些不適癥狀的存在是由典型的施用外物所導致。因此，乳酸“刺激試驗”是第一個建議測試的項目。試驗通過記錄志愿者在鼻翼施用10%乳酸后的刺激反應來完成。個體中表現出中等或強刺激反應者稱之“刺激者”，并被認為具有敏感皮膚。由于這種局部使用某種產品的皮膚的敏感性，這些個體被選用于測試“敏感皮膚”產品。更近以來，為了特定地刺激涉及不適癥狀和所謂的傷害感受器的外周神經末梢，最近的定義涉及敏感皮膚，最新的試驗已經被建議為精確使用其他造成不適的刺激劑，如辣椒素，特別是在申請EPl 374 913中的。為了本發明的目的，術語“敏感皮膚”覆蓋了易刺激和耐受力低的皮膚。
[0070]耐受力低的皮膚是那種對不同因素如美容品或皮膚藥用產品或肥皂反應的皮膚，反應通過灼熱感、緊繃感、刺痛感和/或發紅表現。
[0071]易刺激皮膚是那種通過瘙癢或通過刺痛表現的對不同因素如環境、感情、飲食、風、摩擦、刮胡須、高鈣成分 的硬化水，溫度變化、濕度或羊毛制品反應的皮膚。
[0072]這兩種類型的皮膚通常與皮膚的干燥相關聯，與干屑相關或無關，或與表現出紅斑的皮膚相關。然而，耐受力低的皮膚也可以是與痤瘡皮膚相關，或者甚至是與表現紅斑狼瘡的皮膚相關，與干屑相關或無關。
[0073]如上所述，皮膚的干燥通常與皮膚濕度的下降相關，通過角質儀(corneometryHf價，還與屏障功能的損傷相關，通過微小的水分流失測量。
[0074]干性皮膚必然有緊繃和/或拉緊的感覺表現。所述皮膚也應該有觸覺和表現出覆蓋有皮屑。當皮膚輕微干燥時，這些皮屑數量豐富，但是肉眼不可見。
[0075]這種皮膚干燥的原因可以是體質類型原因或后天形成類型的原因。
[0076]在這種后天形成的干性皮膚中，涉及的外部因素是具有決定性的，如暴露在化學試劑中，暴露在惡劣的氣候條件中，或者暴曬下，或者可替換的一定治療劑的治療(如類維生素A)。在這些外部影響下，皮膚隨后可以變得暫時和局部干燥。這可以涉及任何類型的皮膚。
[0077]這種非病理性的干性皮膚體質的情況中，干燥狀態的嚴重性取決于已經提到的外部因素。老年的皮膚(隨著年齡增長皮膚的新陳代謝出現通常的衰退為特征)、脆弱的皮膚(對外部因素非常敏感，并通常以紅斑和紅斑狼瘡為表現)和普通干燥病(很可能是遺傳原因并主要表現在面部、手側部和手背部)都屬于這種皮膚類型范疇。可以理解的是干性皮膚狀態是一種生理狀態，它獨立于任意的生理表現，符合正常皮膚標準，這種生理狀態的舒適度與表現需要通過美容品手段得到改善。
[0078]本發明的組合物、方法和用途因此被證明對于阻止和/或治療敏感的和/或干性皮膚是最為特別有效的，和更特別地對那些涉及的反應性、易刺激性和/或耐受性差、后天形成的干性皮膚和/或先天性干性皮膚。
[0079]本發明的目的也是調理培養基的用途或它的提取物的用途，為對抗衰老癥狀，不管是實際年齡上的衰老還是由光誘導的衰老。
[0080]隨著時間的流逝，固有衰老的非常典型的不同癥狀表現在皮膚上，特別是反映在皮膚結構和功能上的改變。其他的成因都是外部的(Yaar和Gilchrest，J InvestDermatol, 1998)。事實上,衰老可以由于環境因而加速，例如皮膚反復暴露在日曬中，和特別是在紫外線A和B輻射，皮膚反復暴露在污染中，特別是在柴油顆粒中，和皮膚反復暴露在香煙環境中。
[0081]大氣污染對皮膚結構(纖維、細胞、酶)的毒害作用，特別是油氣污染如二氧化硫、臭氧和氧化氮，特別涉及它們的對自由基的初始活性，它們是導致生物細胞損傷的氧化環境的根源。這種損傷導致皮膚衰老的加速。
[0082]皮膚衰老的表現特別在于起皺紋和直紋、皮膚松弛或張力下降。
[0083]本發明的其中一個目的是調理培養基或其提取物用于或用在組合物的制備中的用途，調理培養基、其提取物和/或組合物用于改善皮膚動態平衡和/或皮膚的屏障功能和/或皮膚、頭皮和/或皮膚體表的濕度。
[0084]本發明的目的也是改善皮膚動態平衡和/或屏障功能和/或皮膚濕度或頭皮濕度的美容方法，特征是至少一種細胞培養基或至少一種培養基提取物或含有相同組分的組合物施用到皮膚或頭皮上，所述培養基如上文記載的那樣，能夠通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得。
[0085]根據另一方面，發明涉及了至少一種細胞培養基或至少一種培養基提取物用于制備治療和/或阻斷肌膚緊張癥狀表現的組合物的用途，所述培養基能夠通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得，如上文限定的那樣。這樣的組合物可以是一種美容品或制藥用途的組合物，特別是一種皮科藥用制劑組合物。
[0086]組合物中的本發明的調理培養基或其提取物的用量可以被本領域技術人員調整以便獲得預期的效果。有效量可以因此通過常規技術手段確定，包括體外試驗和體內測試，特別是取決于使用的提取物的類型和選定的配方的類型。
[0087]通過指定，調理培養基活性物質的濃度相對于組合物的總重量可以在0.001%至50重量％之間，特別是少于或等于10%，這些量可以在沒有任何不利因素的前提下變化。
[0088]根據本發明的組合物還包含生理可接受的培養基，特別是一個美容品或藥學可接受的培養基。
[0089]對于本發明的目的，術語“美容品組合物或產品”是用來特別意指任何用于與人體的各種表面部分(表皮、頭發和體毛系統、指甲、口唇和外生殖器)、或牙齒或口腔粘膜接觸的物質或制劑，用于專門的或主要的，來清潔它們、來芳香它們、改變它們的外觀和/或矯正體味和/或保護他們或使它們維持在好的狀態(Cosmetic Guideline (美容品指南)76/768/EEC 修正版)。[0090]這些組合物通常具有一種能用在人體皮膚上使人愉快的氣味和外觀。
[0091 ] 優選的，本發明的組合物是被應用到皮膚或粘膜上的。
[0092]根據考慮到的使用的方法，其可以是任何通常使用的植物制劑的形式。
[0093]為了局部施用到皮膚或粘膜，特別地，組合物的形式可以是洗液或血清類型的水或油溶液或分散體、通過在水相中分散油類(0/W)或反之亦然(W/0)獲得的乳液類型的液體或半液體稠度的乳劑、或具有水或無水乳膏或凝膠類型的具有柔軟狀態的性質的混懸液或乳劑、或微囊或微粒、或離子的和/或非離子類型的泡狀的分散體、或泡沫。它們的形式也可以是用于控制釋放的微球或納米球或脂囊泡或高分子微泡或高分子修補劑和水凝膠。
[0094]根據一個有益的實施方案，所述組合物是皮膚美容品組合物，包含根據本發明的至少一種調理培養基或一種提取物在美容品或藥物可接受的載體中，比例按重量計為相對于組合物的總重量的至少0.001%，并優選從0.05%到3%。
[0095]這些組合物按照常用的方法制備。
[0096]根據本發明的組合物中各種組分的用量是按照本領域的常用量考慮使用的。其組分和用量優選不會影響調理培養基或它的提取物的活性，即降低所述活性。
[0097]在美容品領域，特別地，這些組合物組成用于臉、用于手、用于腳、用于大的組織皺裙或用于身體的清潔、保護、治療或護理乳膏(例如，日霜、晚霜、卸妝霜、粉底霜、防曬霜)，粉底液、卸妝乳、護膚乳或護理液、防曬乳、皮膚護理洗液、凝膠或泡沫，例如清潔洗液、人工曬黑洗液、沐浴組合物、包含殺菌劑的除臭組合物、或須后凝膠或洗液。
[0098]根據本發明的組合物也可以制備成固體形式，制成肥皂或潔膚皂。
[0099]組合物還可以包裝成氣霧劑組合物的形式，也包括擠壓輸送的推進劑。
[0100]根據本發明的組合物還可以是頭皮護理組合物，特別是洗發劑、頭發定型水、治療性洗液、定型膠或定型膏、生發洗液、防脫發洗液或凝膠、抗寄生蟲洗發劑、去頭屑洗發劑等
坐寸ο
[0101]組合物還可以用于口牙用途，例如牙膏。在這種情況下，組合物可以包含通常用于口腔用組合物的常規輔料和添加劑，特別地，和表面活性劑、增稠齊?、濕潤齊?、磨光劑例如二氧化硅、各種活性成分例如氟化物、特別是氟化鈉、和可選擇的甜味劑例如糖精鈉。
[0102]當組合物是乳劑時，油相的比例按重量計相對于組合物的總重量可以從大約5%到80重量％變化，和優選按重量計從大約5%到50%。用于乳劑形式的組合物的油、蠟、乳化劑和輔助乳化劑是選自美容品領域常規使用的種類。在組合物中，乳化劑和輔助乳化劑按重量計相對于組合物總重量以從0.3%到30%的比例存在，和優選按重量計從0.5%到20%。乳劑還可以包含脂囊泡。
[0103]當組合物是油性溶液或凝膠時，油相可以以超過組合物總重量90%的比例存在。
[0104]以已知的方式，美容品組合物還可以包含美容品領域常用的輔料，例如親水的或親脂性的膠凝劑、親水的或親脂性的添加劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、芳香劑、填料、遮蔽劑、氣味吸收劑和染料。這些各種輔料的用量是美容品領域的常用量，和，例如，范圍是從組合物總重量的大約0.01%到10%。依賴于它們的自然特性，這些輔料可以被被引入油相、弓丨入水相和/或引入脂質小球中。
[0105]作為可以被用于本發明的油或蠟，可提及到礦物油(液體石蠟)、植物油(牛油樹脂的液體部份、向日葵油)、動物油(全氫化角鯊烯)、合成油(普賽林)、硅油或蠟(環甲硅油)和氟代油(全氟聚醚)、蜂蠟、巴西棕櫚蠟或石蠟。脂肪醇和脂肪酸(硬脂酸)也可以被添加到這些油中。作為可以用于本發明的乳化劑，提及到的乳化劑可以是，例如，硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯60和由Gattefosse公司以Tefose? 63出售的PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯的混合物。
[0106]作為可用于本發明的溶劑，提及到低級醇，特別是乙醇和異丙醇、和丙二醇。
[0107]作為可用于本發明的親水膠凝劑，提及到羧基乙烯聚合物(Gaitemei.*)、丙烯酸
共聚物例如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚物、聚丙烯酰胺、多糖例如羥丙纖維素、天然的膠質和粘土，和作為親脂性的膠凝劑，提及到改良粘土例如有機皂土、金屬脂肪酸鹽例如硬脂酸鋁、疏水性二氧化硅、乙基纖維素和聚乙烯。
[0108]在根據本發明的皮膚美容品組合物中，調理培養基提取物可以聯合類視黃醇或皮
[0109]根據本發明的皮膚美容品組合物還可以包含惰性的或乃至藥效或美容活性的添加劑或這些添加劑的組合，且特別是:潤濕劑、脫色劑例如氫醌、壬二酸、咖啡酸或曲酸；軟化劑；潤濕劑例如甘油、PEG-400或尿素；抗衰老劑、抗皮脂溢劑或抗痤瘡劑，例如S-羧甲基半胱氨酸、S-苯甲基巰基乙胺、它們的鹽和它們的衍生物，或苯甲酰過氧化物；抗生素例如紅霉素和其酯、新霉素、氯潔霉素和其酯、四環素；抗真菌劑例如酮康唑或4，5-聚亞甲基-3-異噻唑；促進毛發再生的藥劑，例如米諾地爾(2，4- 二氨基-6-哌啶基嘧啶-3-氧化物)和其衍生物、二氮嗪(7-氯-3-甲基一 1，2，4-苯丙噻二嗪1，1- 二氧化物)和苯妥英(5，4-二苯基咪唑啉-2，4-二酮)；非甾體類抗炎劑、類胡蘿卜素，和特別的β —胡蘿卜素；牛皮癬治療劑例如蒽林和 其衍生物，和，最后的二十碳-5，8，11，14-四烯酸和二十碳-5，8，11-trynoic酸、其酯和酰胺。
[0110]抗衰老劑特別指的是抗糖化劑、NO-合酶抑制劑、或刺激表皮或真皮高分子的合成或阻斷它們的降解的制劑、或刺激成纖維細胞或角化細胞增殖和/或角化細胞分化的制劑。
[0111]術語“濕潤劑”傾向于指的是:
[0112]一或者一種用以維持角質層的濕度的呈現屏障功能的化合物，或一種閉合化合物。提到的可以有神經酰胺、鞘氨醇堿基化合物、卵磷脂、鞘糖脂、磷脂、膽固醇和它的衍生物、植物留醇(豆留醇、β —谷留醇、菜油留醇)、必需脂肪酸、1，2-甘油二酯、苯并二氫吡喃-4-酮、五環三萜烯如熊果酸、凡士林油和羊毛脂；
[0113]一或直接增加角質層含水量的化合物，如海藻糖和它的衍生物、透明質酸和它的衍生物、甘油、戊二醇、Pidolate鈉、絲氨酸、木糖醇、乳酸鈉、聚甘油基丙烯酸酯、依克多因與其衍生物、殼聚糖、低聚糖和多糖、環狀碳酸酯、N-月桂酰吡咯烷酮羧基酸和Ν-α -苯甲酰-L-精氨酸；
[0114]一或活化皮脂腺的化合物，如類固醇衍生物(包括DHEA)和維生素D與其衍生物。
[0115]這些化合物可以以本發明組合物總重量的0.001%到30%存在，并且優選是從
0.01% 到 20%ο
[0116]適用于本發明的NO-合酶抑制劑的例子包括，特別是葡萄屬(Vitisvinifera)植物的提取物,特別是Euromed公司銷售的名稱為無色花青素葡萄干上等品
(Leucocyanidines de raisins extra),或是 Indena 公司銷售的名稱為 LeuCOSeleCt?
的，或，最后，是Hansen公司銷售的名稱為Extrait de marc de raisin的；橄欖(oleaeuropaea)植物的提取物，優選自橄欖樹葉和特別是VINYALS公司銷售的為干提取物形式的，或 Biologia & Technologia 公司銷售的商品名為 Eurol BT ;和銀杏(Ginkgo biloba)植物提取物，優選是Beaufour公司銷售的該植物干燥的水提取物商品名為Ginkgo bilobaextrait standard。
[0117]在這些用于促進表皮高分子或阻斷它們的降解的活性劑中，提及的那些作用為:
[0118]一或者膠原合成，例如積雪草的提取物；積雪草苷與其衍生物；抗壞血酸或維生素C及其衍生物,如維生素C醣苷(Hayashibara公司銷售)；人工合成肽如iamin、Sederma公司銷售的商品名為“Biop印tideCL”的棕櫚酰三肽甘氨酸-組氨酸-賴氨酸；從植物中提取的肽類，如Coletic公司銷售的商品名為Phytokine?的大豆水解產物；大豆纖維提取物，如Silab公司銷售的名稱為“Raffermine”的；植物類激素如生長素和木脂素；特別是Sederma公司銷售的名稱為“Matrixyl”的棕櫚酰五肽賴氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-絲氨酸；二甲基氨基乙醇；柴胡(Bupleurum chinense rhizome)提取物，如Sederma公司以名稱“Pleurimincyl”和“Lipocare”銷售的；特別是用棕櫚酰基酰化的小麥蛋白水解物，如S印pic公司銷售名稱為“Lipacid PVB”的產品；輔酶QlO ;維生素A、二棕櫚酰羥基脯氨酸，特別是S印pic公司銷售名稱為“SepiliftDPHP"的產品，和含有異黃酮的紅三葉草(Trifolium Pratense)提取物。
[0119]—或者彈性蛋白合成,例如LSN公司銷售的商品名為CytovitillA'的Saccharomyces
cerivisiae的提取物；和Secma公司銷售的商品名為KtMp;KHicvD的alga Macrocystispyriferra的提取物；
[0120]一或者粘多糖合成，如牛奶通過變形乳桿菌(lactobacillus vulgaris)發酵得到的產品，為Brooks公司銷售的商品名為的' yogourth?的;Alban MUller公司銷售的商品名為 HSRV: 的褐色alga Padina pavonica ;以及 Saccharomyces cerivisiae 提取物特別從
Silab公司購得商品名為PjrmaIifIi*或從LSN公司購得商品名為Cytovithi%
[0121]—或者纖維粘連蛋白合成,如Seporga公司銷售的浮游生物Salina的提取物,其商品名為GP4(T:可獲得的酵母提取物可以特別地從Alban Muller公司購得，其商品名為
Drieline*: Sederma公司銷售的棕櫚酰五肽，其商品名為Matrkif5
[0122]一或者在表皮-真皮交界處存在的化合物合成(如膠原Vn和/或IV和/或昆布氨酸)，例如二棕櫚酰羥基脯氨酸，特別S印Pic公司銷售的商品名為“S印pilift DPHP”，或phytosteryl硫酸酯，如Vincience公司銷售的商品名為“Phytocohesine” ；
[0123]一或金屬蛋白酶抑制作用(基質金屬蛋白酶或MMP)，例如更特別地是MMP1，2，3或9。可以提及的是:類維生素A及其衍生物、寡肽和脂肽、脂氨基酸、Coletica公司銷
售的商品名為的CoHniilf的麥芽提取物；藍莓或迷迭香提取物；番茄紅素；異黃酮、它們的衍生物或含有它們的植物提取物，特別是指大豆提取物(IchimaruPharcos公司銷售的商品名為Havosleronc SlTl的產品)紅三葉草提取物(例如Saderma公司銷售的商品名為wSterocaisftI的產品)、亞麻提取物、虎耳草或香紫蘇提取物；姜黃素提取物;豨薟屬植物提取物(例如Saderma公司銷售的產品)；
[0124]一絲氨酸蛋白酶抑制作用，如白細胞彈性蛋白酶或組織蛋白酶G。可以提及的可以是:豆類種子的肽提取物(Pisum sativum)，購自LSN公司，商品名為Parcbstyf;類肝素；
和假二肽如{2-[乙酰基-(3-二氟甲基苯基)氨基]-3-甲基-丁酰氨}乙酸。
[0125]本發明組合物也可以含有防腐劑，如對羥基苯甲酸酯、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、UVA和UVB遮蓋劑和抗氧化劑，如α -生育酚、丁基羥基苯甲醚或丁基羥基甲苯。
[0126]本發明涉及的另一方面，涉及了至少一種細胞培養基的用于制備一種細胞和/或組織培養基用途或至少一種細胞培養基提取物的用途，如上述限定的，所述培養基通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得。本發明的調理培養基或其提取物可以因此在細胞培養系統中被用作輔助成分，特別是改善三維空間系統和獲得最佳培養條件用于淹沒系統或暴露系統中的培養。特別地，調理培養基和/或其提取物(和/或含有它們的組合物)可以被用于一種體外皮膚等同物的制備。
[0127]事實上，調理細胞培養基及其提取物可以優選被單獨使用或與常規培養基混合使用，用于體外培養細胞，特別是皮膚細胞如角化細胞。
[0128]這樣的培養系統已經特別被記載，例如在專利ΕΡ285471、ΕΡ789074或ΕΡ857971中，并包括在載體上的一個較多的或較少的分化的角質化細胞的三維培養物。培養物中也可以含有其他皮膚細胞類型，如黑素細胞、樹枝狀細胞或郎格罕氏細胞、成纖維細胞，但也含有神經細胞或內皮細胞。
[0129]載體可以由惰性載體組成，特別是多孔載體或半透性的載體。載體可以更特別地選自膠原基質、可選擇的含有成纖維細胞和/或粘多糖、去表皮的真皮，真皮等同物、透明質酸和/或膠原和/或纖維粘連蛋白(fibronectin)和/或纖維膜，和一種惰性載體。
[0130]本發明的目的也是一種制備組合物的方法，特別是美容品或皮膚學組合物，特別的可以通過包括第一階段的方法制備，在所述的第一階段中制備調理培養基，可選擇地制備所述調理培養基的提取物。
[0131 ] 這種方法至少包括下述步驟:
[0132]a)在第一營養培養基中的載體(特別是多孔載體)上培養來源于腸道上皮的細胞一段足夠獲得它們的分化的時間；
[0133]b)在覆蓋有外周血細胞或其衍生物(例如白細胞)的毯狀物的槽中制備第二細胞
培養基；
[0134]c)回收步驟a)結束時獲得的在載體(特別是多孔載體)上的分化細胞培養物，并轉移至步驟b)結束時獲得的第二培養基；
[0135]d)把在第二培養基中來源于腸道上皮的所述的分化細胞的培養物與至少包括益生菌的微生物培養物相接觸足夠的時間，以使細胞之間產生交互作用，所述益生菌可以是，例如，乳桿菌屬的(Lactobacillus species)和/或雙歧桿菌屬的(Bif idobacteriumspecies)；[0136]e)除去細胞培養物并回收第二細胞培養基，去除白細胞，以獲得調理培養基；
[0137]f)將調理培養基，或其提取物，合并到美容品或皮膚藥用組合物中。
[0138]優選的，步驟a)中的載體是多孔載體。
[0139]術語“多孔載體”是用來特別意指骨架上包括小孔的插入單元。
[0140]例如，孔徑大小可以是從0.001到10 μ m，優選大于或等于0.3 μ m。
[0141]作為非限定性的例子，因此適用于本發明的多孔插入單元的骨架可以包含選擇性地包括氨基多糖和/或成纖維細胞的多孔的膠原基質，透明質酸和/或膠原和/或粘連蛋白和/或纖維蛋白凝膠或薄膜、半滲透性的硝化纖維、尼龍、特氟隆、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯或聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜、半滲透性的 Anopore 無機膜、醋酸纖維薄膜、B1pore - CM?半透膜、半滲透性的聚酯薄膜和聚羥基乙酸薄膜。
[0142]在步驟a)中的接觸時間可以由本領域技術人員調整，但通常在幾小時和幾天之間，特別是在I天和35天之間，例如從18到22天，優選大約21天。細胞初始被以單層的形式放置，因而在步驟a)結束時，得到一個具有若干層分化細胞的三維體系。有益的，培養基將被有規律地更新，例如每2天，以使來源于腸道上皮的細胞，例如Caco2細胞，獲得最佳的分化。
[0143]在步驟b)中，外周血細胞或其衍生物，特別是白細胞形成了細胞的毯狀物；即腔室的表面基本上均勻的覆蓋了白細胞；它們可以是單層或多層的形式。
[0144]特別的，這些白細胞是收集自至少經過一個分離步驟(特別是離心分離)然后至少部分的去除單核細胞之后的血液樣品。隨后它們被懸浮在與它們的生存能力相適應的營養培養基中，特別是RPMI培養基。
[0145]通常，培養基可以由本領域技術人員根據他們的常識選擇，特別是從上述培養基中選擇。
[0146]舉例來說，適合用于本發明的腔室，可提及培養平板的孔，例如通常用于細胞培養的6-、12-、24-、48_孔或96-孔細胞培養板。
[0147]有益的，在步驟c)中的轉移之前，分化細胞培養物將要使用適合于白細胞生存能力的培養基洗。分化細胞和益生菌之間的接觸，在白細胞參與的情況下，將要進行允許建立交互作用的時間，即在不同細胞類型之間的化學或生物學的交換。
[0148]對于本發明，措辭“細胞的化學交換”是用來表示由分子代表的所有信號，所述分子從細胞中釋放并能夠影響遠處的另一個細胞的活性，所述的另一個細胞可以屬于或不屬于相同的細胞類型。非限定性的，所述分子可以，例如，是肽、蛋白質、脂質、糖、留類激素或兒茶酚胺。其可以通過分泌的形式釋放。
[0149]應該理解，這種交互作用可以在沒有直接物理性接觸的不同細胞類型之間發生；特別的，通過安排第一、來源于腸道上皮的細胞和，第二、可以是或不是放置在單獨腔室中的白細胞的細胞毯狀物，依靠將它們培養在其中的培養基開始彼此交換，沒有腸道細胞培養物的細胞能夠與其他細胞毯狀物的細胞直接接觸，例如在細胞體之間或通過細胞延伸的方法接觸。
[0150]有益的，益生菌微生物被在從頂端添加到腸道細胞培養物中。
[0151]適合建立這種交互作用的時段可以是幾個小時到幾天，通常至少6小時，優選至少10，特別的大于或等于16小時，但可以無限擴展。益生菌被，例如，與腸道細胞在包括白細胞的腔室中接觸6到36小時。
[0152]隨后，從所有細胞中分離回收出培養基，例如，在基底側水平采集獲得:這種培養基已經受到兩種細胞類型和它們的相互關系的影響。
[0153]如同在前面表明的,這樣回收的培養基，還稱為“調理培養基”，包含濃度大于或相等 20pg/ml 的 IL-10，特別是從 50 到 200pg/ml。
[0154]在作為成分被引入組合物，特別是根據本發明的美容品或藥學或皮膚美容品組合物之前，其隨后可以經受本領域技術人員本身公知的濃縮、提取和/或分餾步驟。
[0155]美容美容
[0156]本發明組合物被特別用于正常皮膚和/或粘膜和/或受影響的皮膚和/或粘膜的治療或預防治療，它可以是表現皮膚、體表和/或頭發疾病狀態的，例如特別是:
[0157]—干性皮膚或頭發，
[0158]一皮膚屏障功能的損傷，
[0159]—敏感皮膚或頭發，
[0160]一細胞外基質中具有改變的皮膚，
[0161]一涉及用抗菌劑或抗真菌劑治療的疾病，
[0162]一被激素干擾引起的 (油性皮膚)或涉及去頭屑的疾病癥狀。
[0163]進一步，組合物可以阻止或治療涉及年齡衰老的特定的損傷。
【具體實施方式】
[0164]本發明將在下述的實施例中更詳細的說明。
[0165]在這些實施例中，參考附圖，附圖顯示的是指標化合物滲透到不同條件下培養的重建皮膚中的條件。
[0166]實施例1:制各調理培養某
[0167]接近于人腸道上皮細胞的細胞，Caco2(在通道60和65之間)以2.5X105細胞/ml的濃度接種在25mm培養插入單元中(具有0.4 μ m的核孔，BectonDickinson, Basle, Switzerland)。這種插入單元被放置在培養皿(Nunc)中，并在37°C /10%C02 的 DMEM (包含谷氨酸胺和高濃度葡萄糖(Amimed, Allschwill, Switzerland))中培養18到22天，所述DMEM補充了非必需氨基酸(Gibco，BRL)、10mg/ml慶大霉素(GIBC0BRL)和 0.1% 的青霉素 / 鏈霉素(10000IU/ml 和 10000 μ g/ml) (GIBC0)。每 2 天更換一次培養基直到細胞完全分化(21天)。當Caco2細胞融合成一個單層時，使用多孔(multicell)-ERS電極(伏特計/歐姆計)不斷的測量經上皮的電阻大小。
[0168]此外，通過淋巴細胞的離心，從無關的正常供血者的周圍血液中分離來自于正常志愿者的血白細胞。細胞懸液(IO7細胞/ml)被放置在陪替氏培養皿中，在37°C培養I小時30分讓單核細胞粘附。因此，包含在非粘附細胞群中的白細胞，主要是T淋巴細胞，用它們的在有綿羊紅細胞存在的情況下形成玫瑰花形的性質被純化。隨后在存在NH4Cl (8.7mg/I)的情況下通過滲透性沖擊去除綿羊紅細胞。最終，白細胞懸液的存活力大于95%。
[0169]隨后這些白細胞被稀釋在包含20%去補體人AB血清(在56°C去補體30分鐘，Sigma, StLouis, Missouri, USA)的 RPMI1640 中。[0170]隨后可以制備Caco2/白細胞共培養模型。為此，Caco2細胞培養插入單元在RPMI1640培養基中洗兩次，并轉移到一個包含RPMI培養基的6 —孔培養平板中，其中孔已經提前涂有毯狀物的新近純化的白細胞(2X IO6細胞/ml)。因此，白細胞在基底層和Caco2細胞在頂端層。
[0171]根據如下所述的條件對具有益生菌的Caco2/白細胞(外周血白細胞)共培養物進行刺激:
[0172]如此，lX107cfu/ml的益生菌被從頂端加入。單獨的培養基作為陰性對照。在共培養物刺激6到36小時(37°C，10%C02)后，從基底側收集調理培養基。
[0173]Lactobacillusparacasei,特別是在 CNCM 以編號 N0.CNCM1-2116 保藏的菌株，被特別用作益生菌。
[0174]實施例2:屏障功能的效果
[0175]按照實施例1獲得的調理培養基，但在用IO8Cfu副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)刺激16小時后,與EpiskirT重建皮膚接觸6天,在該模型階段,模型繼續增殖。
皮膚的這種生成EpiskinK模型的屏障功能之后被研究。
[0176]草案
[0177]在D6接受Episkin試劑盒，然后根據五個條件在增殖階段培養直到D13。
[0178]1、常規的均jiskin?條件(條件A):用Episkin?.分化培養基從D6到D13處理。
[0179]Episkin 分化培養基是 RoguetR、CohenC、DossouKG、RougierA 所記載的:Episkin,用于體外評定局部施用化合物刺激性的重建的人類表皮(Toxicol in vitrol993:8:283 — 291)。
[0180]2、陰性對照(條件B):用30 %陰性對照培養基從D6到D13處理(調理培養基源自Caco2 / PBMC 培養 16 小時)。
[0181]3、陽性對照(條件C):用30%調理培養基Caco2 / PBMC+益生菌(副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei) CNCM1-2116+ 乳雙歧桿菌(Bifidobacterrium lactis)NCC2818 (也表示為 Bbl2ATCC27536))從 D6 到 D13 處理。
[0182]因此，試劑盒在D14被接收在培養基上。之后培養基用測試培養基替換(它的構成與分化培養基相同，僅用5% FCS替換10%胎牛血清(FCS))在培養箱中37°C下培養24小時。
[0183]之后，該測試培養基用1.5ml的PBS+0.25%(w/w)吐溫80替換，并在使用前在32°C下穩定I小時。fEpiskinH式劑盒以它們的單位使用。
[0184]條件A、B、C對于每一個Episkin,批次都在6孔中測試研究。
[0185]化合物2-硝基-對-亞苯基-二胺(染料)的滲透作用在不同的處理后被研究。
[0186]實驗條件
[0187]測試按照以下步驟執行:
[0188]i )配制劑:在含染料5mM (I部分)的配方和緩沖液，PH9.5 (I部分)間的混合物。
[0189]染料在配制劑中的最終濃度:lmM的初始原料。
[0190]
【權利要求】
1.用于改善皮膚或頭皮的皮膚動態平衡和/或屏障功能和/或濕度的美容方法，其特征在于:至少一種細胞培養基或至少一種培養基提取物被用在皮膚或頭皮上，所述培養基能夠通過與至少一種消化道細胞培養物和至少益生菌微生物接觸獲得，其中所述消化道細胞為腸道上皮細胞，且所述至少一種益生菌微生物選自乳桿菌屬和雙歧桿菌屬種。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的培養基可以通過另外與外周血細胞接觸獲得。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于:外周血細胞為白細胞。
4.前述權利要求中任意一項所述的方法，其特征在于:消化道細胞的培養物是三維培養物。
【文檔編號】A61Q19/10GK103462876SQ201310412365
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2008年2月25日 優先權日:2007年2月26日
【發明者】A.古尼切 申請人:萊雅公司