基于酶循環的α－甲基酰基輔酶A消旋酶的檢定法的制作方法

專利名稱：基于酶循環的α－甲基酰基輔酶A消旋酶的檢定法的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及α-甲基酰基-輔酶A消旋酶檢測。特別是，本發明提供用于檢定樣品中的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法和試劑盒。
背景技術：
α-甲基酰基-輔酶A消旋酶(AMACR)是一種充分表征的酶，其在膳食的支鏈脂肪酸和C27-膽汁酸中間體的過氧化物酶體β-氧化中起關鍵作用。Ferdinandusse等，J.Lipid Res.411890-1896(2000)。AMACR催化(R)-α-甲基-支鏈脂肪酰基-輔酶A酯到它們的(S)-立體異構體的轉化。Cuebas等，Biochem.J.363801-807(2002)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)。將AMACR從人的肝臟作為47-kDa單體分離出并且主要位于過氧化物酶體中，在線粒體中檢測到少量。Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.222313-23(1994)。從人的肝臟分離出的AMACR的等電點是pH6.1，并且所述酶在pH7和pH8之間是最佳活性的。已經證明AMACR的升高表達是幾種類型癌癥的生物標志物，所述癌癥諸如前列腺的、結腸直腸的、卵巢的、乳房的、膀胱的、肺的、腎細胞癌、淋巴瘤、和黑素瘤。Rubin等，JAMA 2871662-1670(2002)；Luo等，Cancer Res.622220-2226(2002)；Sreekumar等，J Natl.Cancer Inst.96834-843(2004)。研究也顯示α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的酶活性在前列腺的癌癥組織樣品中升高。Kumar-Sinha等，Am.J.Pathol.164787-93(2004)。PCT WO 02/27324和美國專利公布2002/0123081描述了，通過測量AMACR的表達或活性，用于識別患有發展中的前列腺癌癥或處于所述癌癥危險中的患者和患有由于前列腺癌癥轉移至另一個組織而產生的發展中的癌癥或處于所述癌癥危險中的患者的方法。已經報道了用于檢定AMACR的酶活性的數種方法。Schmitz等(Eur.J.Biochem.222313-23(1994))描述了用于AMACR酶活性的輻射測量的檢定，其中將2-甲基[2-(3)H]酰基-輔酶A用作底物。Veldhoven等(Biochem.Biophys.Acta 134762-68(1997))描述了用于AMACR的備選酶檢定法，其中將AMACR與2R-甲基-十五烷酰-輔酶A結合。將反應產物，2S-異構體，用過量加入的氧化酶(姥鮫烷酰基輔酶A氧化酶)去飽和，導致過氧化氫的產生，在適合的氫供體的存在下通過過氧化物酶監控。然而，還需要可靠的和靈敏的用于檢定樣品中AMACR酶活性的方法(例如，用于診斷癌癥)。
發明簡述本發明提供用于檢定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A接觸而產生(2S)-2-甲基酰基-CoA；b)在(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體存在下，將來自步驟a)的如果產生的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A，由此產生第一電子受體的還原形式；在反式-2，3-脫氫-輔酶A轉化酶和還原形式的第二電子受體存在下，將所述反式-2，3-脫氫-輔酶A轉化回(2S)-2-甲基酰基-輔酶A而形成循環反應體系，由此產生第二電子受體的氧化形式；其中所述第一電子受體和第二是不同的；和c)評定所述循環反應體系中第一電子受體還原或氧化形式或第二電子受體還原或氧化形式的濃度變化，由此確定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的存在、不存在和/或數量。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈的酰基-輔酶A，酰基的鏈長從C(4)至C(30)，從C((8))至C(25)，或從C(10)至C(25)。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-姥鮫烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基輔酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羥基-5β-膽甾烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，首先將(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體加入樣品中，并然后將所述樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶、和還原形式的第二電子受體接觸。在一些實施方案中，將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、和氧化形式的第一電子受體接觸。在其它實施方案中，將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、氧化形式的第一電子受體、反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶、和氧化形式的第二電子受體接觸。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是不同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶，并且第一電子受體是O2。在一些實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是相同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是酰基-輔酶A脫氫酶。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶。第一電子受體的氧化形式可以選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組，并且第二電子受體的還原形式可以選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。第一電子受體的還原或氧化形式或者第二電子受體的還原或氧化形式在所述循環反應體系中的濃度變化可以通過光度測量法評定。本發明的方法還可以包含將第一電子受體的氧化或還原形式或者第二電子受體的還原或氧化形式偶聯到產生顏色的試劑的步驟用于評定所述第一電子受體還原或氧化形式或者第二電子受體還原或氧化形式的濃度變化，其中通過比色法評定第一電子受體的氧化或還原形式或者第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化。可以通過本發明的方法檢定的樣品包括生物樣品。在一些實施方案中，所述生物樣品是生物流體，諸如血液、血清、血漿、和尿。在一些實施方案中，所述生物樣品選自由前列腺、結腸、胎盤、乳房、膀胱、肺、腎、淋巴細胞組成的組。本發明的可以用于個體癌癥的預后和/或診斷。在一些實施方案中，所述癌癥選自由前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤組成的組。在一些實施方案中，通過檢定血樣(諸如全血、血漿、和血清)中的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶活性，本發明的方法用于個體中前列腺癌的預后和/或診斷。在一些實施方案中，所述方法還包含將來自所述個體的樣品中的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的量與預定值比較的步驟，由此α-甲基酰基-輔酶A消旋酶量的增加顯示所述個體有癌癥或者處于癌癥形成的危險中。在一些實施方案中，所述癌癥選自由前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤組成的組。本發明也提供用于檢定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的試劑盒，所述試劑盒包含(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、氧化形式的第一電子受體、在氧化形式的第一電子受體存在下催化(2S)-2-甲基酰基-輔酶A至反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A的轉化的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、還原形式的第二電子受體、和在還原形式的第二電子受體存在下催化反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A至(2S)-2-甲基酰基-輔酶A的轉化的反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶，其中所述第一電子受體和第二電子受體是不同的。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈的酰基-輔酶A，其具有酰基鏈長從C(4)至C(30)，從C(8)至C(25)，或從C(10)至C(25)。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-姥鮫烷酰(pristanoyl)-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基輔酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羥基-5β-膽甾烷酰(cholestanoyl)-輔酶A。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是不同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶，并且第一電子受體是O2。在一些實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-去氫酰基-輔酶A轉化酶是相同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是酰基-輔酶A脫氫酶或反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且第一電子受體的氧化形式選自由NAD、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組，并且第二電子受體的還原形式選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。所述試劑盒還可以包含指示用于癌癥的預后和/或診斷的說明書，所述癌癥包括，而不是限于，前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤。
發明詳述本發明提供用于檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶活性的方法。在所述檢定中，將含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶或推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A接觸。如果樣品中存在酶活性的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶，則(2R)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成(2S)-2-甲基酰基-輔酶A。所述方法然后利用(2S)-2-甲基酰基-輔酶A和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A之間的循環反應體系而產生對應于α-甲基酰基-輔酶A消旋酶酶活性的可檢測信號。描述于此的方法可以用于診斷癌癥。例如，所述方法可以在不用活組織檢查的情況下利用血樣用于診斷前列腺癌。為了公開清楚，而不是作為限制，將發明詳述分成下面的分部。
A.定義除非另外限定，在這里使用的全部技術的和科學的術語具有如本發明所屬領域普通技術人員通常理解的相同含義。將這里提到的全部專利、申請、公開的申請及其它公布通過參考全部結合。如果本節中陳述的定義與通過參考結合于此的專利、申請、公開的申請及其它公布中陳述的定義相反或以其它方式不一致，則本節中陳述的定義勝過通過參考結合于此的定義。如這里所用，“一種(a)”或“一種(an)”是指“至少一種”或“一種或多種”。如這里所用，“α-甲基酰基-輔酶A消旋酶”或“AMACR”(EC5.1.99.4)指催化(2S)-2-甲基酰基-輔酶A和(2R)-2-甲基酰基-輔酶A之間轉化的酶。它意欲包括基本上不改變它的活性的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的衍生物、變體、和類似物。α-甲基酰基-輔酶A消旋酶可以從任何來源獲得，諸如人、小鼠、牛、大鼠、果蠅等。如這里所用，“(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶”是指在氧化形式的電子受體存在下從(2S)-2-甲基酰基-輔酶A催化反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A形成的酶。它意欲包括基本上不改變它的活性的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶的衍生物、變體、和類似物。如這里所用，“(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶”是指在還原形式的電子受體存在下從(2S)-2-甲基酰基-輔酶A催化反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A形成的酶。它意欲包括基本上不改變它的活性的反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶的衍生物、變體、和類似物。如這里所用的術語“評定”意欲包括在獲得反應體系中存在的分析物的量或濃度絕對值的意義上，以及在獲得所述反應體系中指示分析物水平的指標、比例、百分比、可見的或其它值的意義上的定量和定性測定。評定可以是直接或間接的并且實際檢出的化學物種當然不必是所述分析物本身然而例如可以是其衍生物或某些進一步的物質。如這里所用，“樣品”指可以含有分析物檢定所需分析物的任何東西。樣品可以是生物樣品，諸如生物流體或生物組織。生物流體的實例包括尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰液、腦脊液、淚液、粘液、羊水等。生物組織是細胞的團聚體，通常為特別的種類和它們的胞間物質，其形成人、動物、植物、細菌、真菌或病毒結構的一種結構材料，包括連接物、上皮、肌肉和神經組織。生物組織的實例也包括器官、腫瘤、淋巴結、動脈和個體細胞(s)。如這里所用，“血樣”包括全血、血清、和血漿。如這里所用，“血清”指在除去血纖蛋白凝塊和血細胞以后獲得的血液的流體部分，與循環血液中的血漿不同。如這里所用，“血漿”指血液的流體、非細胞的部分，與凝固后獲得的血清不同。如這里所用，“流體”指可以流動的任何組合物。因而流體包括以半固體、糊劑、溶液、水混合物、凝膠、洗劑、乳膏及其它這樣組合物形式的組合物。如這里所用，“疾病或病癥”指生物中的病理性病癥，從例如感染或遺傳缺陷而產生，并且其特征在于可識別的癥狀。如這里所用，“接觸”是指使兩種或更多組分在一起。可以通過將全部所述組分混合在流體或半流體混合物中實現“接觸”。當在固體表面諸如固體組織截面或底物上使一種或多種組分接觸到一種或多種其它組分時，也可以實現“接觸”。如這里所用，“循環反應體系”指將(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A并且從反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化回(2S)-2-甲基酰基-輔酶A的過程。
B.檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法本發明提供用于檢定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A接觸而產生(2S)-2-甲基酰基-輔酶A；b)在(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體存在下，將如果產生的來自步驟a)的所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A，由此產生第一電子受體的還原形式；在反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶和還原形式的第二電子受體存在下，將所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化回(2S)-2-甲基酰基-輔酶A而形成循環反應體系，由此產生第二電子受體的氧化形式；其中第一電子受體和第二電子受體是不同的；和c)評定所述循環反應體系中第一電子受體的還原或氧化形式或者第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化，由此確定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的存在、不存在和/或量。在一些實施方案中，步驟c)中產生的可檢測信號是所述循環反應體系中第一電子受體的還原或氧化形式或者第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化。在一些實施方案中，所述樣品是血樣(諸如全血、血清、和血漿)。
步驟a)通過α-甲基酰基輔酶A消旋酶將(2R)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成(2S)-2-甲基酰基-輔酶A本發明中用于檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法基于通過α-甲基酰基-輔酶A消旋酶催化的酶活性。α-甲基酰基-輔酶A外消旋酶催化將(2R)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成(2S)-2-甲基酰基-輔酶A的反應。因此，可以通過測定這些反應中產生的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A確定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的存在或不存在和數量。因而，本發明的步驟a)的例舉性反應流程是(2R)-2-甲基酰基-輔酶A→(2S)-2-甲基酰基-輔酶A(1)可以使用任何(2R)-2-甲基酰基-輔酶A，它是要檢定的α-甲基酰基輔酶A消旋酶的底物。所述酰基可以衍生自任何脂肪酸。所述酰基可以是支鏈的酰基(例如，脂肪酰基)，鏈長為至少C(4)，至少C(6)，至少C(8)，至少C(10)或更多。例如，所述鏈長可以是C(4)至C(30)，C(4)至C(16)，C(8)至C(25)，C(8)至C(18)，C(10)至C(25)，或C(12)至C(25)。所述酰基可以包括芳族化合物(例如，布洛芬)和膽汁酸中間體，諸如三羥基糞甾烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-姥鮫烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R，6R，10)-三甲基十一烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R，6)-二甲基庚酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-甲基-十五烷酰-輔酶A。在一些實施方案中，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羥基-5β-膽固烷酰-輔酶A。步驟a)中的(2R)-2-甲基酰基-輔酶A可以是適于α-甲基酰基-輔酶A消旋酶反應的任何濃度并且取決于樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的活性。例如，(2R)-2-甲基酰基-輔酶A的濃度是約0.01mM至約100mM；約0.05mM至約50mM，約0.5mM至約10mM，或約1mM至約5mM。所述酶反應一般在適于所述酶反應完成的條件(諸如緩沖液和溫度)中進行。可以使用適于α-甲基酰基-輔酶A消旋酶酶反應的本領域已知的任何緩沖液。例如，所述緩沖液可以是pH為約6至約8的磷酸鹽緩沖液；pH為約7至約9的Tris-HCl緩沖液，或pH為約6至約9的Good’s緩沖液。例如，所述反應可以在約30℃至37℃的溫度進行5、10、15、30、或60min。可以在下一步驟前終止所述反應。可以利用本發明檢定含有或推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的任何樣品，在一些實施方案中，所述樣品是血液(包括全血、血清和血漿)或尿，在一些實施方案中，所述樣品是組織樣品(例如，前列腺、結腸、胎盤、乳房、膀胱、肺、腎、和淋巴細胞)。在一些實施方案中，在所述檢定進行前，將所述組織樣品進行勻漿化而獲得粗組織勻漿。在一些實施方案中，在所述檢定進行前預加工所述樣品。例舉性的加工步驟包括離心、萃取/洗滌、細胞溶解作用、凍/融、和聲波降解法。也可以在所述檢定前稀釋所述樣品。
步驟b)(2S)-2-甲基酰基-輔酶A/反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A循環反應體系本發明的步驟b)在第一電子受體(它的氧化形式)存在下通過(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶的作用將(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A，然后在第二電子受體(它的還原形式)存在下通過反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶的作用從反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A回到(2S)-2-甲基酰基-輔酶A。第一電子受體和第二電子受體是不同的電子受體。因而步驟b)形成循環反應體系，產生還原形式的第一電子受體的增加和氧化形式的第一電子受體的減少，和氧化形式的第二電子受體的增加和還原形式的第二電子受體的減少。可以測量特定形式的電子受體的增加或特定形式的電子受體的減少。在一些實施方案中，積累特定形式的電子受體并評定所述積累。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-去氫酰基-輔酶A轉化酶是不同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶不與第二電子受體交叉反應或者以比結合到第一電子受體更低的親合性結合到第二電子受體，和/或反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶不與第一電子受體交叉反應或者以比結合到第一電子受體更低的親合性結合到第一電子受體。可以使用任何(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶，所述酶在氧化形式的電子受體存在下催化來自(2S)-2-甲基酰基-輔酶A的反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A的形成。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶(EC 1.3.1.8)。例如，可以使用任何酰基-輔酶A脫氫酶(EC1.3.1.8)，所述酶具有下列GenBank檢索號B70719(結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))的氨基酸序列，或者由下列所描述Cvetanovic等(Biochemical J.22749-56(1985))，Dommes等(Eur.J.Biochem.125335-341(1982))，和Seubert等(Biochim.Biophys.Acta164498-517(1968))。在其它實施方案中，(2s)-2-甲基酰基-輔酶a轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)。例如，可以使用具有下列GenBank檢索號的氨基酸序列的酰基-輔酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)，T52121(擬南芥(Arabidopsisthaliana))、T52120(擬南芥(Arabidopsis thaliana))、I38095(智人(Homosapiens))、S64224(啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae))、A54942(智人(Homosapiens))、OXRTA2(褐家鼠(Rattus norveqicus))、OXRTA1(褐家鼠(Rattusnorveqicus))、OXCKX5(熱帶假絲酵母(candida tropicalis))。在另一個實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶(EC 1.3.1.38)。例如，可以使用任何反式-2-烯酰基-還原酶(EC 1.3.1.38)，所述酶具有下列GenBank檢索號S72400(Streptomyces collinus)的氨基酸序列，或者由Mizugaki等(J.Biochem.921649-1654(1982))和Prasad等(Arch.Biochem.Biophys.237535-544(1985))所描述。可以使用任何(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶，所述酶在還原形式的電子受體存在下催化來自反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A的(2s)-2-甲基酰基-輔酶A的形成。在一些實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶(EC 1.3.1.38)。可以使用本領域已知的和描述于此的任何反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶。在其它實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶(EC 1.3.1.8)。可以使用本領域已知的和描述于此的任何酰基-輔酶A脫氫酶。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-去氫酰基-輔酶A轉化酶是相同的。在一個實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是酰基-輔酶A脫氫酶。在其它實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是反式-2-烯酰基-輔酶A脫氫酶。可以使用本領域已知的和描述于此的任何酰基-輔酶A脫氫酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶。第一和第二電子受體可以是與選擇用于所述反應的酶類相容的任何電子受體，條件是第一電子受體和第二電子受體是不同的。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶并且第一電子受體是O2。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。在一些實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。在一些實施方案中，反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。在一些實施方案中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶可以一起催化(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A之間的循環反應，所述反應在所述檢定中產生放大的信號。(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶可以利用不同的電子受體并且不與由另一個酶使用的電子受體交叉反應或者以低親合性反應。備選地，可以認為所述兩種酶是相同的電子受體。可以將足夠量的第一電子受體的氧化形式和第二電子受體的還原形式加入到所述循環反應以驅動兩個反應并且容許所述循環進行直到產生充分的信號。在下列兩個例舉性的步驟b)反應流程中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是不同的。例如，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶(EC 1.3.1.8)并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶(EC 1.3.1.38)。由此，步驟b)的例舉性反應流程是(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+硫代-NADP++H2O→反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A+硫代-NADPH+H+(2a)反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A+NADH+H+→(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+NAD++H2O(2b)反應(2a)表示由酰基-輔酶A脫氫酶催化的反應，并且反應(2b)表示由反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶催化的反應。作為實施例，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A是(2S)-姥鮫烷酰-輔酶A并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A是反式-2，3-脫氫姥鮫烷酰-輔酶A。可以將充分的硫代-NADP+和NADH加入到所述反應以產生循環反應，所述循環反應導致硫代-NADPH的積累。在另一個實施例中，在所述循環反應中，將酰基-輔酶A氧化酶(EC 1.3.3.6)用作(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶，并且將反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶(EC 1.3.1.38)用作反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶。例舉性反應流程是(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+O2→反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A+H2O2(3a)反式-2，3-脫氫酰基-CoA+NADPH+H+→(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+NADP++H2O(3b)反應(3a)表示由酰基-輔酶A氧化酶催化的反應，并且反應(3b)表示由反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶催化的反應。作為實施例，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A是(2S)-姥鮫烷酰-輔酶A并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A是反式-2，3-脫氫姥鮫烷酰-輔酶A。將充分量的O2和NADPH加入到所述反應以產生循環反應，其導致NADP和H2O2的積累。下列是例舉性反應流程，其中(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是相同的。一種這樣的例舉性反應流程是(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+硫代-NADP++H2O→反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A+硫代-NADPH+H+(4a)反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A+NADH+H+→(2S)-2-甲基酰基-輔酶A+NAD++H2O(4b)反應(4a)和(4b)都是由相同酶催化的，所述酶是酰基-輔酶A脫氫酶(EC1.3.1.8)或反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶(EC 1.3.1.38)。作為實例，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A是(2S)-姥鮫烷酰-輔酶A并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A是反式-2，3-脫氫姥鮫烷酰-輔酶A。可以將充分的硫代-NADP+和NADH加入到所述反應混合物以驅動循環反應中的兩個反應，導致硫代-NADPH的積累。(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶類和反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶類的任何其它組合可以用于實現相同的循環效果。步驟a)和b)中的酶反應一般在適于所述酶反應完成的條件(諸如緩沖液和溫度)中進行。用于描述于此的步驟b)和步驟a)的緩沖液可以相同或可以不同。可以使用適于步驟a)和/或b)中特定酶反應的本領域已知的任何緩沖液。例如，所述緩沖液可以是pH為約6至約8的磷酸鹽緩沖液；pH為約7至約9的Tris-HCl緩沖液，或pH為約6至約9的Good’s緩沖液。步驟b)的溫度可以相同或不同于步驟a)。步驟b)中的溫度優選在約25℃至約37℃之間。在一些實施方案中，在單獨的反應混合物中進行描述于此的一個或多個步驟。例如，可以將所述反應中的一個或多個步驟的最終產品部分或完全與所述反應混合物分開，之后加入下一步驟的試劑。在一些實施方案中，在單一反應混合物中進行描述于此的步驟a)和b)。在一些實施方案中，在前一步驟末尾，將用于下一步驟的酶類、底物、或電子受體順序加入到相同反應混合物。在一些實施方案中，終止前一步驟中的反應，之后加入用于下一步驟的試劑。在一些實施方案中，將用于超過一個步驟的一些或全部試劑同時加入到所述反應混合物。在一些實施方案中，將用于步驟a)和b)的試劑同時與所述樣品混合。在這些實施方案中，將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、氧化形式的第一電子受體、反式-2，3-去氫酰基-輔酶A轉化酶、和還原形式的第二電子受體接觸。在一些實施方案中，將用于步驟a)的試劑和步驟b)的一些試劑同時與所述樣品混合。在這些實施方案中，將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、和氧化形式的第一電子受體接觸。在一些實施方案中，將用于步驟b)的一些試劑首先與所述樣品混合，并且隨后加入用于步驟a)的試劑和用于步驟b)的其它試劑。在一些實施方案中，首先將(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體加入樣品中，并然后將所述樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、反式-2，3-去氫酰基-輔酶A轉化酶、和還原形式的第二電子受體接觸。在一些實施方案中，將具有(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體的樣品溫育而容許樣品中的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A。在實施例1和2中詳細地描述這些實施方案。
步驟c)步驟b)中產生的評定信號樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的定量可以通過監控步驟b)中產生的信號中減去的或添加的差異而實現。所述評定可以連續或在不同時間點進行。在一些實施方案中，評定第一電子受體的還原或氧化形式的濃度變化。在一些實施方案中，通過評定第一電子受體的還原形式的濃度增加而確定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的活性。在一些實施方案中，通過評定第一電子受體的氧化形式的濃度減少而確定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的活性。在一些實施方案中，評定第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化。在一些實施方案中，通過評定第二電子受體的還原形式的濃度減少而確定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的活性。在一些實施方案中，通過評定第二電子受體的氧化形式的濃度增加確定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的活性。可以利用本領域已知的方法評定描述于此的電子受體的濃度變化。例如，可以通過測量在340nm的吸收而分光光度法測定NADH或NADPH的濃度變化。可以通過測量在405nm的吸收而分光光度法測定硫代-NADPH的濃度變化。在一些實施方案中，可以通過比色法利用電子傳遞生色團測量NADH或NADPH的濃度變化，所述生色團包括，但不限于，3-(對-碘苯基)-2-(對-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物、3，3′-(4，4′-亞聯苯基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑化物、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙[2-(對-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑氯化物](＝硝基-四唑NTB)、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙[2，5-雙(對-硝基苯基)-2H-四唑氯化物]、3，3′-(3，3′-二甲氧基-4，4′-亞聯苯基)-雙(2，5-二苯基-2H-四唑氯化物)、和2，6-二氯苯酚-靛酚。優選的實施例是水溶性四唑鹽和心肌黃酶或吩嗪硫酸二甲酯的組合。這些電子傳遞生色團是NADP或NADPH的電子受體以形成顯色的甲 (formazane)顏料，并且形成的顏料在其最大吸收處是比色測量的。用于NADH或NADPH的進一步測定法是熒光測定法，其中在熒光試劑諸如刃天青(resazulin)存在下將NAD或NADPH用心肌黃酶處理。描述于此的電子受體的還原和/或氧化形式的濃度測量在本領域中是已知的。例如，可以通過利用電子傳感器檢定消耗的O2或H2O2的量。可以使用許多氧化還原指示劑用于本用途，并且在文獻中對于檢定溶液中的H2O2和O2描述了廣泛的方法。產生的H2O2還可以通過與指示劑和H2O2起反應作為可檢測出產物而測量。指示劑的實例是可以通過分光光度方法測量的試劑、顏色指示劑、熒光試劑或發光試劑。例如，可以利用peroxioxalate和吖啶酯的非-酶催化的化學發光反應評定H2O2。檢定可以一式兩份進行，同時具有陽性和背景對照。可以通過利用己知量的具有已知活性的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶獲得標準曲線。然后可以通過將每個測量信號對所述標準曲線比較而確定每個樣品中的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的水平。
C.方法的用途本發明提供具有增加的靈敏性的檢定法，用于檢測樣品例如血樣中存在的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶。因而本發明的方法提供用于與α-甲基酰基-輔酶A消旋酶改變水平有關的檢測條件并用于監控個體中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶水平的實用方法。所述方法可以用于受試者中與α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的不適當的量或活性，或這樣的效果或活性有關的任何疾病的預后或診斷。這樣疾病的實例包括，但不限于，癌癥諸如前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤。本發明的酶檢定法也提供用于探查α-甲基酰基-輔酶A消旋酶在生物過程和多種病理性病癥中作用的研究工具。
D.檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的試劑盒本發明也提供用于檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶活性的試劑盒，諸如診斷試劑盒。這樣的試劑盒包含描述于此的一種或多種底物、酶試劑和電子受體用于進行本發明的方法。在一些實施方案中，所述試劑盒包含(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、氧化形式的第一電子受體、反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶、還原形式的第二電子受體，其中第一電子受體和第二電子受體是不同的。在所述試劑盒中可以包括描述于此的任何底物、酶類、和電子受體。所述試劑盒也可以包含陽性和/或陰性對照標準，還有用于評定由步驟b)產生的信號的必要試劑，例如，可以包括用于進行比色檢定的試劑。所述試劑盒也可以包含用于進行本發明方法和/或將樣品傳遞到用于處理的診斷實驗室的裝置或容器，還包含用于進行本發明方法的適合的指導書。本發明的試劑盒可以在任何適合的包裝中。例如，有關診斷系統的在此討論的包裝是診斷系統中通常利用的那些。這樣的包裝包括適合于在自動分析器中使用的容器。
E.實施例僅為了說明性目的包括下列實施例，不意欲限制本發明的范圍。
實施例1.利用酰基-輔酶A脫氫酶和反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶(AMACR)在本研究中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶；并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶。在下面表1和表2中陳述了本研究中所用試劑。
表1試劑1的比較
表2試劑2的比較 在本研究中，將260μl的試劑1加入到20μl的樣品(血清或血漿)。在25℃或37℃的5min溫育后，將60μl的試劑2加入到所述反應混合物。在8min-10min之間監控405nm的吸光度變化。針對來自AMACR校準器產生的速率，將405nm的增長率用于計算樣品中AMACR活性。
實施例2.利用酰基輔酶A氧化酶和反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶檢定α-甲基酰基-輔酶A消旋酶(AMACR)在本研究中，(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶；并且反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶。用于本研究的試劑陳述在下面的表3和表4中。
表3.試劑1的組成
表4.試劑2的組成 在本研究中，將260μl的試劑1加入到25μl的樣品(血清或血漿)。在25℃或37℃的5min溫育后，將60μl的試劑2加入到所述反應混合物。在8min-10min之間監控550nm的吸光度變化。利用AMACR校準器計算樣品中的AMACR活性。僅為了說明性目的包括上述實施例，并且不意欲限制本發明的范圍。可以對上述那些進行許多變化。因為上述實施例的修改和變化對本領域技術人員是顯而易見的，所以意欲本發明僅受后附權利要求范圍所限制。
權利要求
1.一種用于檢定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)將推測含有α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A接觸以產生(2S)-2-甲基酰基-輔酶A；b)在(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體存在下，將如果產生的來自步驟a)的所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A，由此產生第一電子受體的還原形式；在反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶和還原形式的第二電子受體存在下，將所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化回(2S)-2-甲基酰基-輔酶A而形成循環反應體系，由此產生第二電子受體的氧化形式；其中第一電子受體和第二電子受體是不同的；和c)評定所述循環反應體系中第一電子受體的還原或氧化形式或者第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化，由此確定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的存在、不存在和/或數量。
2.權利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈酰基-輔酶A，鏈長從C(4)至C(30)。
3.權利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈酰基-輔酶A，鏈長從C(8)至C(25)。
4.權利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-姥鮫烷酰-輔酶A。
5.權利要求1的方法，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羥基(tyrihydroxy)-5β-膽甾烷酰-輔酶A。
6.權利要求1的方法，其中首先將所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和氧化形式的第一電子受體加入到所述樣品，并且然后將所述樣品與(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶、和還原形式的第二電子受體接觸。
7.權利要求1的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是不同的。
8.權利要求7的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。
9.權利要求7的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶，并且所述第一電子受體是O2。
10.權利要求7的方法，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
11.權利要求8的方法，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
12.權利要求9的方法，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
13.權利要求1的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是相同的。
14.權利要求13的方法，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶和所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶都是酰基-輔酶A脫氫酶或反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶。
15.權利要求14的方法，其中所述第一電子受體的氧化形式選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組；并且所述第二電子受體的還原形式選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
16.權利要求1的方法，其中通過光度測量法評定所述濃度變化。
17.權利要求1的方法，所述方法還包含在步驟c)以后將所述第一電子受體的氧化或還原形式或所述第二電子受體的還原或氧化形式偶聯至顏色產生試劑的步驟，其中通過比色法評定所述第一電子受體的氧化或還原形式或者所述第二電子受體的還原或氧化形式的濃度變化。
18.權利要求1的方法，其中所述樣品是生物樣品。
19.權利要求18的方法，其中所述生物樣品是血樣。
20.權利要求19的方法，其中所述血樣選自由全血、血清、和血漿組成的組。
21.權利要求18的方法，其中所述生物樣品選自由前列腺、結腸、胎盤、乳房、膀胱、肺、腎、淋巴細胞組成的組。
22.權利要求1的方法，所述方法用于個體中癌癥的預后和/或診斷。
23.權利要求22的方法，所述方法還包含將來自所述個體的樣品中的α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的量對于預定值比較的步驟，由此α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的量的增加顯示所述個體有癌癥或者處于癌癥形成的危險中。
24.權利要求22的方法，其中所述癌癥選自由前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤組成的組。
25.一種用于檢定樣品中α-甲基酰基-輔酶A消旋酶的試劑盒，所述試劑盒包含(2R)-2-甲基酰基-輔酶A、氧化形式的第一電子受體、在氧化形式的第一電子受體存在下催化(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化成反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A的(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶、還原形式的第二電子受體、和在還原形式的第二電子受體存在下催化反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化成(2S)-2-甲基酰基-輔酶A的反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶，其中所述第一電子受體和所述第二電子受體是不同的。
26.權利要求25的試劑盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈酰基-輔酶A，鏈長從C(4)至C(30)。
27.權利要求25的試劑盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-2-甲基-支鏈酰基-輔酶A，鏈長從C(8)至C(25)。
28.權利要求25的試劑盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(2R)-姥鮫烷酰-輔酶A。
29.權利要求25的試劑盒，其中所述(2R)-2-甲基酰基-輔酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羥基(tyrihydroxy)-5β-膽甾烷酰-輔酶A。
30.權利要求25的試劑盒，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A脫氫酶，并且所述第一電子受體選自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+組成的組。
31.權利要求25的試劑盒，其中所述(2S)-2-甲基酰基-輔酶A轉化酶是酰基-輔酶A氧化酶，并且所述第一電子受體是O2。
32.權利要求25的試劑盒，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
33.權利要求30的試劑盒，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
34.權利要求31的試劑盒，其中所述反式-2，3-脫氫酰基-輔酶A轉化酶是反式-2-烯酰基-輔酶A還原酶，并且所述第二電子受體選自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH組成的組。
35.權利要求25的試劑盒，所述試劑盒還包含指示用于癌癥的預后和/或診斷的說明書。
36.權利要求35的試劑盒，其中所述癌癥選自由前列腺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、淋巴瘤、和黑素瘤組成的組。
全文摘要
本發明提供了用于檢定α－甲基酰基－輔酶A消旋酶活性的方法。在所述檢定中，將含有α－甲基酰基－輔酶A消旋酶或推測含有α－甲基酰基－輔酶A消旋酶的樣品與(2R)－2－甲基酰基－輔酶A接觸。如果α－甲基酰基－輔酶A消旋酶存在于所述樣品中，則(2R)－2－甲基酰基－輔酶A轉化成(2S)－甲基酰基－輔酶A。所述方法然后利用(2S)－2－甲基酰基－輔酶A和反式－2，3－脫氫酰基－輔酶A之間的循環反應體系而產生對應于α－甲基酰基－輔酶A消旋酶酶活性的可檢測信號。也提供了基于相同原理的α－甲基酰基－輔酶A消旋酶檢定用試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK101040055SQ200580035331
公開日2007年9月19日 申請日期2005年10月14日 優先權日2004年10月15日
發明者袁崇生 申請人:通用原子公司