專利名稱：：一種利用pax1和cdh1基因甲基化檢測宮頸癌的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫學領域，更具體地涉及利用與宮頸癌發生相關基因PAX1和⑶HI的甲基化狀態檢測宮頸癌或宮頸癌易感性的方法和試劑盒。
背景技術：
：長期以來，人們對生命體遺傳的觀點是用DNA語言(即以4個堿基核苷酸，腺苷酸(G)，胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)為語符的)來描述的。生命體表型的維持及異化均歸結于攜帶決定這些表型的基因的攜帶者DNA(在某些情況下，以RNA的形式)的忠實或突變后的代間傳遞。雙倍體生物的表型多樣性亦可由父本及母本的基因組的組合而大大地提高。然而，越來越多的證據表明，不涉及到基因組一級結構變化的表觀遺傳學的機制，也參與了高等生物體的遺傳和變異。幾乎在所有生物中都發現了DNA甲基化。除胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘌呤外，DNA可含有甲基化的核堿基5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)、N4-甲基胞嘧啶(4_mCyt)或N6-甲基腺嘌呤(6-mAde)。由DNA甲基轉移酶(MTase)形成這些甲基化核堿基，該酶能催化活化甲基從輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)轉移到其DNA識別序列中的胞嘧啶的C5碳、胞嘧啶的N4氮或腺嘌呤的N6氮上(Cheng,(1995)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，293-318)。由于核苷酸序列可以以甲基化或非甲基化形式存在，所以可認為DNA甲基化是DNA信息量的增加，并負責各種生物功能。在原核生物中，DNA甲基化參與保護宿主基因組不受內源性限制性核酸內切酶、DNA錯配修復、基因表達調控和DNA復制的影響。在真核生物中，DNA甲基化在一些重要的調控過程中起作用，這些調控過程包括基因沉默(Bird,(2002)GeneDev.16，6-21)、基因組印記(Feil和Khosla，(1999)TrendsGenet.15，431-435)、X-染色體失活(Panning和Jaenisch，(1998)Cell93，305-308)、基因組內寄生物的沉默(Yoder,(1997)TrendsGenet.13，335-340)和癌發生(Baylin,(1998)Adv.CancerRes.72，141-196Jones和Laird,(1999)Nat.Genet.21，163-167)。據認為許多癌癥與基因表達調控的改變有關。在許多情況下，基因表達改變可追溯到染色體DNA的甲基化模式改變。很久以前就知道，DNA甲基化是改變基因表達而不改變基因的編碼功能的機制。甲基化反應涉及形成5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)。令人感興趣的是，5-甲基胞嘧啶在染色體DNA中并非均勻分布，而傾向于位于CpG二核苷酸。哺乳動物基因組含有數個分離的CpG二核苷酸，它們大部分是甲基化的(Larsen，等人，(1992)Genomics13，1095-1107)。更通常觀察到的是CpG的二核苷酸簇或“CpG島”(Gardiner-Garden和Frommer,(1987)J.Mol.Biol.196，261-282)，它們存在于約40%的哺乳動物基因的啟動子和外顯子區。CpG島長度一般為約0.2-lkb，并富含胞嘧啶和鳥嘌呤。已證明CpG島連接于所有管家基因和許多組織特異性基因的5’端，并連接于一些組織特異性基因的3’端。5’CpG島可通過5’側翼DNA、外顯子和內含子延伸，而大多數3’CpG島似乎連接于外顯子。CpG島通常的位置與不同種類中等效基因的轉錄單元相同，但有一些顯然例外(Gardiner-Garden3和Frommer，(1987)J.Mol.Biol.196，261-82)。DNA甲基化是表觀遺傳學現象的一種核心機制。在高等生命體中，組成DNA的4個堿基核苷酸，僅胞嘧啶的5’碳原子可被甲基化。這也只發生在其3’端毗鄰的堿基核苷酸為鳥苷的胞嘧啶5’碳原子上，即5’CpG3’的二連體中的胞嘧啶。這些GpG二連體在高等生命體基因組中的出現的頻率僅為0.6%左右，遠遠低于二連體均態出現的預期值8.35%。這一分布的非隨機性偏移是與甲基化的C很易經脫氨等反應過程而轉變為(尿嘧啶U，胸腺嘧啶T)，即，與胞嘧啶甲基化可促進C向T的點突變的現象相關。在高等生命體中，大部分CpG二連體散在于象AluI和Line等類高度重復序列中，且甲基化程度高。CpG的甲基化將抑制重復序列的轉錄活性從而負調該類DNA的片段轉座和重排，以確保基因組的穩定。剩余的CpG則富集在所謂的CpG島區(長度為200-1000bp左右，CpG的頻率在8.33%左右)。CpG島的分布有著高度的選擇性，尤以見之于核糖體RNA基因和50%左右編碼蛋白質的基因的啟動子區而令人矚目。在多數情況下，這類CpG島的甲基化程度很低，是這類基因得以轉錄所必需。全豐度的甲基化僅見于完全靜息化了的常染色體的遺傳印記基因或女性個體失活了的X染色體上的多個基因的CpG島。CpG二連體的甲基化是一由甲基轉移酶以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體和DNA為模板的反應過程。CpG二連體的C甲基化雖不影響C與G之間的堿基配對，但可明顯地改變的DNA高級結構。對其高級結構的精細分析表明甲基基團外伸在DNA雙螺旋原先空置的大溝區中，這直接影響DNA與蛋白質相互的作用。參與基因轉錄調控過程中的很多轉錄調控因子所識別的DNA序列中含有CpG序列。由此這類CpG的甲基化會使其與相應蛋白的結合能力減弱，從而引起有關的下游基因轉錄受抑以至失活。長期以來，癌被認為是一種涉及到多個關鍵基因的量或質發生改變的遺傳性的疾病。癌相關的染色質數目和結構的宏觀水平改變，早在上世紀初已有報道。近代癌癥分子遺傳學研究在核苷酸序列的水平上已精確地描述了眾多正或負地影響正常細胞向癌變細胞惡化過程的基因的變化(點突變、缺失重排等等)。另外，在腫瘤細胞中抑癌基因的去表達似乎也可因其啟動子CpG島的甲基化程度提高所致。同樣，癌基因啟動子的去甲基化和該基因的活化亦同見之于某些腫瘤細胞中。與此同時，CpG島區選擇性的甲基化也可導致抑癌基因的失活。隨著人們對DNA的甲基化在腫瘤發生相關基因的表達的影響的重視程度的提高，對各類腫瘤的DNA甲基化的分析已成為當前種腫瘤分子生物些研究的一個熱點。在W02002/070742中公開了一種基于基因的甲基化進行疾病檢測的方法，其中列舉了多達上百種的抑癌基因和原癌基因，并認為這些抑癌基因和原癌基因可能與某些癌癥有關，其中包括ABL1、ABL2、AKT1、AKT2、APC、ARAF1、ARAF2、ARHA、ARHB、ARHC、AXL、BCL2、BCL3、BCR、BLYM、BMI1、BRAF、BRAFP、CBFA2、CBL、CCND1、CDH1、CDK4、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CHES1、COT、CRK、CRKL、CSF1R、DIGS170、DCC、DDX6、E2F1、ECT2、EGFR、EIF3S6、ELEI、ELK1、ELK2P1、ELK3、EMPLI、EMS1、EPHA1、EPHA3、ERBA2L、ERBAL2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERG、ETS1、ETS2、ETV1、ETV3、ETV6、EVI1、EWSR1、FAT、FER、FES、FGF3、FGF4、FGF6、FGR、FKHL1、FLU、FLT1、FOS、F0SB、F0SL1、F0SL2、FYN、GLI、GLI2、GLI3、GRF2、GR01、GR02、GR03、HCK、HKR3、HRAS、HRASP、INT6P1、IRF4、JUN、JUNB、JUND、KAI1、CD82抗原、KIT、KRAS1P、KRAS2、LBC、LCK、LCN2、LCO、LPSA、LTA、LTB、LYN、M1S1、M4S1、MADH4、MAF、MAFG、MAFK、MASKMAX,MCC、MCF2、MDM2、MEL、MELL1、MET、MLH1、MOS、MPL、MSH2、MUM1、MYB、MYBL1、MYBL2、MYC、MYCL1、MYCL2、MYCLK1、MYCN、MYCP、NBL1、NF1、NF2、NFKB2、NKTR、N0TCH4、NOV、NRAS、NRASL1、NRASL2、NRASL3、NTRK1、OVC、PACE、PDGFB、PIM1、PVT1、RAB1、RAB11A、RAB11A、RAB13、RAB2、RAB27A、RAB27B、RAB2L、RAB3A、RAB3B、RAB4、RAB5A、RAB5B、RAB6、RAB7L1、RABL、RAF1、RAF1P1、RALA、RALB、RAN、RAP1A、RAP1AP、RAPIB、RAP2A、RAP2B、RB1、REL、RELA、RELB、RET、ROS1、RRAS、SEA、SKI、SMARCB1、SPI1、SPINK1、SRC、ST5、SUPT3H、SUPT5H、SUPT6H、TALI、TGFBR2、THPO、THRA、THRB、TIAM1、TIM、TM4SF1、TNF、TP53BP2、TP73、TPR、TRE17、USP4、USP6、VAV1、VAV2、VHL、WNT1、WNT2、WNT5A、WT1、YES1、YESP、AMPHL、APC、ARHA、ARHB、ARHC、AXL、BCL2、BCL3、BCR、BLYM、BRCA1、BRCA2、CBL、CCND1、CDH1、CDK4、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CHES1、D1OS170、DCC、DDX6、E2F1、EIF3S6、ELE1、ELK3、EMP1、EMS1、EPHA1、EPHA3、ETV3、EVI1、EWSRUFAT、FER、FHIT、FKHL1、FLT1、F0SL1、F0SL2、GLI2、GLI3、HCK、HKR3、ING1、IRF4、KAI1、CD82抗原、LCK、LTA、LTB、MISI、IMS1、MADH4、MAX、MCC.MENUMLH1、MSH2、NBL1、NF1、NF2、NFKB2、NKTR、NME1、NOV、NTRK1、PDGFRL、PLA2G2A、PTCH、PTEN、RBI、SMARCB1、SPINK1、ST5、SUPT3H、SUPT5H、SUPT6H、TALI、TGFBR2、TIAM1、TIM、TM4SF1、TNF、TP53、TP53BP2、TP73、VHL、WNTUWNT2、WNT5A、WT1。宮頸癌是常見的婦科腫瘤之一，嚴重危害女性生命健康。近來發現，多種抑癌基因的失活是導致宮頸癌的重要原因，而DNA甲基化作為一種主要的基因失活方式在宮頸癌中被頻繁發現(KEKEEVATV,ZHEVLOVAAI,PODISOCIUI,etal.Aberrantmethylationoftumorsuppressorgenesandallelicimbalanceincervicalintraepithelialneoplasia[J].MolBiol(Mosk)2006，40(2):224_230)。雖然已知了眾多的抑癌基因或原癌基因，然而導致哪些基因與宮頸癌發生密切有關是不清楚的。如果需要同時檢測10種或更多的基因才能給出檢測結果的話，那么可能會因檢測成本過高而難以普及。另一方面，如果確定的少數幾種基因不能覆蓋絕大部分患者的話，那么又可能會導致漏檢率過高。綜上所述，鑒于包括宮頸癌在內的多種癌癥的治療成功大部分取決于腫瘤發生的早期診斷，因此本領域迫切需要研究各種基因在DNA甲基化狀態與宮頸癌的相關性，并在此基礎上開發更為敏感和有效的早期診斷的方法。
發明內容本發明的目的就是提供新的更有效和簡便的檢測宮頸癌或宮頸癌易感性的方法和試劑盒。本發明的另一目的是提供一種有助于早期輔助檢測宮頸癌或將宮頸癌與宮頸炎和HPV感染進行有效區分的方法。在本發明的第一方面，提供了一種可用于檢測宮頸癌的試劑盒，它含有(a)針對P0X1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對；或含有(b)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對P0X1基因和CDH1基因的特異性引物對。5在另一優選例中，所述的試劑盒還可用于將(1)宮頸癌與(2)宮頸炎和HPV感染但無宮頸癌進行區分。在另一優選例中，所述的試劑盒還可用于將(1)宮頸癌與(3)宮頸上皮內瘤樣病變I期(CINI)進行區分。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括陽性對照和/或陰性對照。在另一優選例中，所述的試劑盒還含有非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑。在另一優選例中，所述的特異性引物對通過聚合酶鏈反應擴增出擴增產物含有啟動子區的CpG島。在另一優選例中，所述的針對CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對如下(i)CDHl甲基化引物對GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC,SEQIDN0:1禾口CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG,SEQIDNO2；(ii)CDHl甲基化引物對GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT,SEQIDNO3禾口AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC,SEQIDNO:4。在另一優選例中，所述的針對POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對如下(iii)擴增PAXl基因的甲基化引物對TATTTTGGGTTTGGGGTCGC,SEQIDNO5CCCGAAAACCGAAAACCG,SEQIDNO6；(iv)擴增PAXl基因的甲基化引物對GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG,SEQIDNO7CACCCAAAAACCAAAAACCAC,SEQIDNO:8。在另一優選例中，所述的甲基化敏感性限制性內切酶選自HpaII、BstuI和HhaI。在另一優選例中，所述的使甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑包括亞硫酸氫鹽，聯苯二酚和氫氧化鈉。在本發明第二方面中，提供了一種引物集的用途，所述的引物集包括(a)針對POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對和(b)針對CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對，所述的引物集被用于制備檢測宮頸癌或宮頸上皮內瘤樣病變的試劑盒。在另一優選例中，所述的引物集被用于制備檢測宮頸上皮內瘤樣病變I期(CINI)和II-III期(CINII-III)的試劑盒。在另一優選例中，所述的引物集被用于制備檢測人的宮頸癌或宮頸上皮內瘤樣病變的試劑盒。在另一優選例中，所述的引物集還被用于制備區別宮頸癌與宮頸炎的試劑盒。在另一優選例中，所述的引物集包括或由以下引物構成序列如SEQIDNO=I-S所示的引物。在本發明的第三方面，提供了一種基因集的用途，所述的基因集包括(a)POXl基因和(b)CDHl基因，其中所述的基因集被用于制備檢測宮頸癌或宮頸上皮內瘤樣病變的試劑或試劑盒。在另一優選例中，所述的試劑包括或由以下引物構成序列如SEQIDN0:l_8所示的引物；或者，所述的試劑盒含有序列如SEQIDN0:l-8所示的引物。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1.CDHl基因的MSP-PCR和非MSP-PCR反應后產物電泳結果。其中，U非甲基化M甲基化。各泳道如下M=DNA分子量標志物；12=HPV；34宮頸炎；56=CINI；78=CINIIIII；910宮頸癌；11陽性對照；12陰性對照。圖2.PAXl基因的MSP-PCR和非MSP-PCR反應后產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。其中，U:非甲基化M甲基化。各泳道如下M=DNA分子量標志物；12=HPV；34宮頸炎；56=CINI；78=CINIIIII；910宮頸癌；11陰性對照；12陽性對照具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，對大量基因進行了篩查，對宮頸癌患者的癌及其癌旁組織的多種基因甲基化的情況進行了分析，意外地發現，對于PAXl和CDHl這兩種基因而言，不僅其各自甲基化狀態與宮頸癌之間存在密切相關性，而且基于這兩個基因的檢測存在極佳的互補性(如在宮頸上皮內瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測高達97%的樣品)。此外，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽性率明顯增高。這提示⑶Hl和PAXl基因可能涉及導致宮頸癌的二種不同機制。此外，通過對⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程的參考指標。在此基礎上完成了本發明。具體地，本發明人應用甲基化特異性聚合酶鏈反應法(methylationspecificPCR,MSP)對HPV、宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣病變(cervicalintraepithelialneoplasia,CINI)、CINIIIII(各15例)及宮頸癌組(40例)組織中⑶HI、PAXl基因進行甲基化檢測。結果表明(I)CDHl基因在HPV、宮頸炎、CINI組中均末出現甲基化狀態，在CINII-III組和宮頸癌組甲基化的陽性率分別為13.3%、22.5%，與前述各組相比差異顯著，P<0.05；(2)PAXl基因甲基化在HPV、宮頸炎組中末出現，在CINI、CINII-III組和宮頸癌組中甲基化的陽性率分別為13.3%、46.7%、87.5%，P<0.05，與前述各組相比差異顯著。(3)上述基因甲基化總陽性率(任何一個基因出現甲基化即為陽性)宮頸癌組(97.5%)高于CINII-III組(60.0%),(P<0.05)；兩組均明顯高于CINI組(13.5%),(P<0.05)。這提示，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程中，⑶HI、PAXl基因甲基化的陽性率明顯增高。這一結果顯示，⑶Hl和PAXl基因的組合，在宮頸癌的臨床診斷上具有潛在價值。如本文所用，“啟動子CpG島特異性引物”指與模板DNA基本上完全匹配且與模板的結合位點中包括啟動子CpG島或其一部分的引物。例如，用甲基化敏感性限制性內切酶處理樣品DNA后，未甲基化的CpG島被切割開，而甲基化的CpG島未被切割。使用特異性結合于該啟動子CpG島的引物(即啟動子CpG島特異性引物)時，前者不會產生PCR產物，而后者則會產生PCR產物。又例如，如果采用使胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑(包括亞硫酸氫鈉，聯苯二酚和氫氧化鈉)使胞嘧啶轉化為尿嘧啶，這可以使用二對引物，一對引物針對甲基化情況，另一對引物針對未甲基化情況，它們會因該CpG島的甲基化或非甲基化以否而特異地結合于含啟動子CpG島的區域，從而引發甲基化或非甲基化特異性的PCR擴增。在本發明提供的宮頸癌相關基PAXl和CDHl都屬于抑癌基因。當抑癌基因的啟動子CpG島發生甲基化后，導致抑癌基因不表達或表達水平下降，從而導致癌癥。因此，在本發明的檢測方法中，檢測抑癌基因(尤其是其啟動子CpG島)是否發生了甲基化。如果存在上述情況，就表明被檢測對象患有宮頸癌或宮頸癌易感性高于正常人群。分析DNA甲基化的常見方法有以下二種(1)使用對甲基化敏感的限制性內切酶；(2)甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR。第一種方法(使用對甲基化敏感的限制性內切酶)方便簡單，但受限于限制性內切酶的DNA識別序列的有限性。目前可供使用的酶僅有三種HpaII(CCGG)(注MspI是可以切動甲基化的CCGG序列的酶)、BstuI(CGCG)和HhaI(GCGC)。這些酶無法切動其中CpG二連體中C甲基化了的識別序列。基因組DNA經這些酶分別充分消化后，作為模板用相應的引物對有關的區段進行PCR分析。PCR結果陽性意味著相應CpG沒有被甲基化，否則即甲基化。顯然這種方法受到“并非所有CpG二連體會位于限制性內切酶的識別序列之中”這一事實的限制，且只能提供存在上述核苷酸序列中CpG中的C的甲基化的狀態的信息，對其它CpG的甲基化狀態的評估毫無價值。第二種方法(甲基化胞嘧啶核苷酸特異性的PCR)，可以對任一對象片段中的每個CpG二聯體中的C是否甲基化進行測定。由于亞硫酸氫鹽處理單鏈的DNA中，所有的未甲基化的胞嘧啶脫氨后均變為尿嘧啶，其配對由C:G變為T:A，而甲基化C不會被脫氨而仍保持C:G配對。結果是前者(未甲基化)的二連體序列變為CpG二TpG，而后者(甲基化的)則仍為CpG。通過對PCR擴增的片段進行測序，人們可以研究該研究區域中的每個CpG的甲基化的狀態。本發明所提供的腫瘤發生的重要基因的甲基化狀態信息，在宮頸癌的基因診斷和治療上有極為重大的指導性意義。在診斷方面，由于所研究的對象是DNA，它較蛋白質及RNA材料的穩定性明顯為高，對發展簡單易用檢驗方法是有利的。診斷新方法的準確、快速以及方便上的程度都是影響其的應用前景的關鍵因素。上面所提到兩種檢測甲基化的方法都用于檢測，即，使用對甲基化敏感的限制性內切酶酶切方法以及亞硫酸氫鈉處理DNA的方法，再分別結合PCR反應的程序。另外，DNA芯片技術也可以用于將來的臨床檢驗的方法。此外，還可通過對檢測樣品直接進行測序，而進行檢測。試劑盒本發明還提供一種檢測宮頸癌或宮頸癌易感性的試劑盒，它包括(a)針對POXl基因和CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對；或含有(b)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對POXl基因和CDHl基因的特異性引物對。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書。本發明的主要優點在于(a)基于PAXl和⑶Hl這兩種基因的檢測存在極佳的互補性(如在宮頸上皮內瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測高達97%的樣品)。(b)從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽性率明顯增高。因此，通過對⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程的參考指標，為臨床診斷治療提供新的方法。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。1資料與方法1.1臨床資料選擇2006年1月至2008年11月在上海市第八人民醫院行宮頸環形電刀切除術、子宮全切除術以及門診活檢的患者。根據宮頸上皮有無異型細胞、異型細胞侵犯上皮的程度以及細胞的極性、核分裂象分成HPV感染正常宮頸組織標本15例、宮頸炎組標本15例、CINI組標本15例、高度CINIIIII組標本15例、宮頸癌組標本各40例。患者年齡1763歲，中位年齡32歲。所有樣本一次性取組織約50mg-150mg，放入液氮中保存以備提取基因組DNA。1.2組織DNA提取DNA的提取①標本中加入組織消化液和蛋白酶K(終濃度為0.5mg/ml)55°C過夜。②取上述等體積的酚、氯仿、異戊醇混合物，室溫振蕩、離心取上清液2次。③1/10體積的3mol/L醋酸鈉，2倍體積的無水乙醇混勻，-20°C過夜。④離心，75%乙醇洗滌沉淀，ddH2050ul溶解后于_20°C保存待用。1.3MSP檢測聚合酶(Takara公司產品)，dNTPmix(混合脫氧核苷三磷酸)(Takara公司)使用方法參考試劑說明。(a)亞硫酸氫鈉處理取IOugDNA,加入3MNaOH至終濃度0.3M，37°C15分鐘一加入新鮮配制的對苯二酚至終濃度5mM—加入新鮮配制的亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite,pH5.0)至終濃度3.1M—加礦物油，50°C16小時。將的瓊脂糖加入2ml的試管，插入200ul的管尖。待瓊脂糖凝固后拔出tip，在孔中加入上述處理樣品。室溫下靜置45分鐘。重復以上操作3次。吸出以上樣品加入3MNaOH至終濃度0.3M，37°C15分鐘。加入lug/lul糖原，加入IOMNH4Ac至終濃度3M，加入3倍體積無水乙醇。沉淀DNA(_20°C過夜，離心30分鐘)，70%乙醇洗滌，干燥，溶解于20ul的水中。保存在_20°C。(b)甲基化胞嘧啶特異性PCR法分別用甲基化特異性或非甲基化特異性引物對(表1)對處理過的DNA進行PCR。用MJ公司的PCR儀進行擴增，所有基因甲基化和非甲基化PCR反應條件為94°C預變性5min，然后94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環，最后72°C延伸7min。PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，并用溴化乙錠(EB)染色。相對分子質量標準使用50bp標準DNA相對分子質量標記(北京天為時代科技有限公司)。PCR反應體系中用ddH20代替DNA作為陰性對照。其余反應試劑和條件一樣。結果分析采用PCR產物條帶用凝膠成像系統(ΒΙΟ-Rad公司)。MSP引物由上海生工合成，引物序列見表1。表1.MSP中所用的引物序列和產物片斷大小SEQIDSEQID長度基因正向引物(5，-3')反向引物(5，-3’)_NO:_NO:(bp)CDHl(M)GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC1CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG2172CDHl(U)GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT3AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC4172PAXl(M)TATTTTGGGTTTGGGGTCGC5CCCGAAAACCGAAAACCG6153PAXl(U)GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG7CACCCAAAAACCAAAAACCAC_81581.4數據統計甲基化的總陽性率=所有基因甲基化例數/所有基因分析的例數X100%基因甲基化率=基因甲基化數/標本總數X100%數據顯著性分析采用T檢驗。2結果2.IOTHl基因在宮頸癌和非癌對照各組間的甲基化情況部分CDHl基因的甲基化和非甲基化PCR產物電泳圖見圖1。⑶Hl基因甲基化在HPV組、宮頸炎組和CINI組中均未見檢出；在CINIIIII組中檢出2例(所占比例為13.3%，與HPV組有顯著差異，P<0.05)，宮頸癌組中檢出9例(所占比例為22.5%，與HPV組有顯著差異，P<0.05)。但宮頸癌組和CINII-III組相比，其顯著性無統計學意義(P<0.05)。從以上各組來看，⑶Hl基因甲基化比例隨病癥發展程度呈現遞增趨勢。而用甲基化引物和非甲基化引物進行PCR擴增結果顯示，在所有各組樣本中，用CDHl基因非甲基化引物都能擴增出條帶，說明CDHl基因即使在標本中存在著甲基化現象，也不是整個基因完全甲基化(詳細結果見表2)。表2宮頸癌發生過程不同時期基因異常甲基化的例數和百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*N樣本數量；P括號內為百分比2.2PAX1基因在宮頸癌和非癌對照各組間的甲基化情況部分PAXl基因的甲基化和非甲基化PCR產物電泳圖見圖2。PAXl基因甲基化在HPV組和宮頸炎組中均未見出現。在CINI組中出現2例(所占比例為13.3%，和HPV組P>0.05，無顯著差異)，CINII-III組中出現7例(所占比例為46.7%JPCINI組有顯著差異，P<0.05)，宮頸癌組出現35例(所占比例為87.5%，和CINII-III組有顯著差異，P<0.05)。從以上各組來看，PAXl基因的甲基化比例從HPV組、宮頸炎組至CINI組、CINIIIII組、宮頸癌組逐步遞增，并且在CINIIIII組和宮頸癌組中具有非常高的甲基化陽性率。從甲基化的總陽性率來看，HPV組和宮頸炎組無甲基化，在CINI組中甲基化總陽性率為13.3%，在CINII-III組和宮頸癌組中分別達到了60.0%和97.5%(見表2)。3討論盡管高危型人乳頭狀病病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染被認為是最有可能的宮頸癌致病因素，但HPV病毒感染本身并不能完全導致宮頸癌的發生，因為腫瘤的發生是多步驟多階段的一個過程，腫瘤發生發展的早期涉及很多基因的失活或過量表達，目前HPV感染后啟動宮頸癌中相關抑癌基因失活的具體分子機制并不清楚，但DNA甲基化作為一種主要的抑癌基因失活方式在宮頸癌中被頻繁發現，已有的研究多從ΠΠΤ、P16等在其它腫瘤中廣泛出現的失活平行應用到宮頸癌中的研究。DNA甲基化屬于表觀遺傳學的一部分，通過啟動子區的甲基修飾導致基因無法轉錄。而腫瘤細胞作為一種惡性增殖細胞脫離了細胞周期和凋亡調控，在分子機制上常涉及抑癌基因的失活，目前已有大量的研究表明抑癌基因的DNA頻繁甲基化與腫瘤的發生、發展及預后關系密切。⑶Hl和PAXl是眾多抑癌基因中的二個抑癌基因。成對區控制基因家族(Pairedbox,PAX)是包括了128個氨基酸的成對結構域。目前共發現9個PAX基因，即PAXl9。PAX基因編碼一組結合特異DNA序列的轉錄因子，調節不同基因的轉錄表達，從而影響細胞的生長、分化、浸潤等生物學行為。目前PAX家族基因的甲基化和腫瘤方面的研究尚為數不多，HATA等研究了PAX4在黑色素瘤中存在著異常甲基化，據此認為它是一個抑癌基因(HATAS，HAMADAJ，MAEDAK，etal.PAX4hasthepotentialtofunctionasatumorsuppressorinhumanmelanoma[J].IntJOncol.2008,33(5):1065-1071)；Li等也報道了PAX4基因在血液腫瘤中存在著異常甲基化M^.(LIY,NAGAIH,0JN0T,etal.AberrantDNAdemethylationinpromoterregionandaberrantexpressionofmRNAofPAX4geneinhematologicmalignancies[J].LeukRes.2006，30(12):1547-1553.)。而PAXl基因在宮頸癌中的異常甲基化是Lai等人于2008年首次發現的(LAIHC,LINYff,HUANGTH,etal.IdentificationofnovelDNAmethylationmarkersincervicalcancer[J]·IntJCancer.2008,123(1):161-167)，通過全基因組掃描芯片發現PAXl是宮頸癌發生的一個有效基因。此外，他們比較了正常組織和HSIL/SCC標本發現，PAXl基因甲基化合并HPV檢測可以提高臨床檢測靈敏度(提高了14%)，因而揭示了PAXl基因在宮頸癌的篩選鑒定上有著重要意義。本發明人系統地檢測了宮頸癌發生發展過程中不同階段包括HPV感染者、宮頸炎、CINI型、CINIIIII型、宮頸癌病人的PAXl基因啟動子區的甲基化陽性情況，發現其呈現明顯增高狀態，在HPV感染者、宮頸炎、CINI型組織中無陽性率或陽性率極低；在CINIIIII組、宮頸癌組織中甲基化陽性率則極高，尤其是在宮頸癌患者中陽性率可達87.5%，遠遠高于大多數其他基因在子宮頸癌中的甲基化陽性率。同時這一結果也恰能說明PAXl基因可以作為宮頸癌臨床診斷的一個極具參考價值的指標。E-cadherin的編碼基因⑶Hl是一種腫瘤抑制基因和腫瘤轉移抑制基因。已有研究表明，E-cadherin的編碼基因⑶Hl異常甲基化與多種腫瘤的發生密切相關(NAKATAS,SUQIOK,URAM0TAH,etal.ThemethylationstatusandproteinexpressionofCDHl,ρ16(INK4A),andfragilehistidinetriadinnonsmallcelllungcarcinomaepigeneticsilencing，clinicalfeatures,andprognosticsignificance[J].Cancer.2006,106(10):2190_2199)。已知正常組織細胞向腫瘤的轉化過程中，⑶Hl失活，細胞的粘附能力下降，遷移運動能力增強，因而⑶Hl可用作判斷腫瘤從良性至惡性轉變的一個重要分子標志物。CDHl基因的甲基化頻繁出現于膽管癌、卵巢癌胃癌等各種不同的癌癥標本和細胞株Φ(LEES,KIMWH,JUNGHY,etal.AberrantCpGislandmethylationofmultiplegenesinntrahepaticcholangiocarcino-ma[J].AmJPathol,2002,1611015-1022；沈文靜，郭科軍，戴冬秋，等.CDHl基因異常甲基化在上皮性卵巢癌中的檢測及臨床意義[J],中國實用婦科與產科雜志，2007，7:520-522;丫六獻5!111六S,TSUJIN0Y，MORIGUCHIK,etal.ChemicalgenomicscreeningformethyIation-silencedgenesingastriccancercelllinesusing5-aza-2'-deoxycytidinetreatmentandoligonucleotidemicroarray[J],CancerSci.，2006，97:64_71)。此外，CDHl基因的甲基化被認為是E-cadherin表達下調或無表達的主要原因(CHENCL,LIUSS,IPSM,etal.E-cadherinexpressionissilencedbyDNAmethylationincervicalcancercelllinesandtumours[J].Eur.J.Cancer.2003,39517-523；Τ0Υ00ΚΑKO，T0Y00KAS,VIRMANIAK，etal.LossofexpressionandaberrantmethylationoftheCDH13(H-cadherin)geneinbreastandlungcarcinomas[J].CancerRes.2001,61:4556_4560·)。既然CDHl基因在惡性腫瘤的轉變過程中起著關健的作用，那么其和腫瘤治療預后是密切相關的。Widschwendter等人的研究顯示，血清DNA檢測的⑶Hl和⑶H13非陽性癌頸癌病人存活期顯著高于陽性病人，存活期中位值分別為1.2年和4.3年。同時在宮頸癌中CDHl和CDH13的合并甲基化率達到43%(WIDSCHWENDTERA,IVARSS0NL,BLASSNIGA.CDHlandCDH13methylationinserumisanindependentprognosticmarkerincervicalcancerpatients[J]·Nt.J.Cancer.2004.109，163-166)。在本發明人的研究顯示了相似的結果，⑶Hl在宮頸癌中的甲基化率為22.5%。更為重要的是，本發明人通過在子宮頸癌中對PAXl和⑶Hl兩個基因同時進行甲基化研究，并且揭示了這兩個基因之間存在極佳的互補性，并且隨著宮頸癌發生發展的不同階段中的甲基化狀態改變。本發明人的研究顯示，二者在宮頸癌組織中的總陽性率可達97.5%，并且隨著病癥的嚴重程度呈現明顯的升高趨勢。綜上所述，對于PAXl和⑶Hl這兩種基因而言，不僅其各自甲基化狀態與宮頸癌之間存在密切相關性，而且基于這兩個基因的檢測存在極佳的互補性(如在宮頸上皮內瘤樣病變I期和CINIIIII期樣品中無交叉樣品)且覆蓋廣(在宮頸癌中可檢測高達97%的樣品)。此外，從HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程中，⑶Hl和PAXl基因甲基化的陽性率明顯增高。這提示⑶Hl和PAXl基因可能涉及導致宮頸癌的二種不同機制。此外，通過對⑶Hl和PAXl基因甲基化的跟蹤檢測，可以作為判斷HPV感染到宮頸炎、再到宮頸增生及宮頸癌的發生進展過程的參考指標。實施例2試劑盒的制備制備一宮頸癌檢測試劑盒，它含有甲基化特異性限制性內切酶HpaII、BstuI和HhaI各200單位，并且含有特異性引物對各100微升，所述各引物對就是表1中各引物SEQIDN0:l-8。該試劑盒還含有使用說明書。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海市第八人民醫院<120>一種利用PAXl和⑶Hl基因甲基化檢測宮頸癌的方法和試劑盒<130)091180<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>1gtgggcgggtcgttagtttc20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>2ctcacaaatactttacaattccgacg26<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3ggtgggtgggttgttagttttgt23<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4aactcacaaatctttacaattccaac26<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5tattttgggtttggggtcgc20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6cccgaaaaccgaaaaccg18<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7gtttattttgggtttggggttgtg24<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8cacccaaaaaccaaaaaccac2權利要求一種可用于檢測宮頸癌的試劑盒，其特征在于，它含有(a)針對POX1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對；或含有(b)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對POX1基因和CDH1基因的特異性引物對。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，它還包括陽性對照和/或陰性對照。3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還含有非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶的試劑。4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性引物對通過聚合酶鏈反應擴增出擴增產物含有啟動子區的CpG島。5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的針對CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對如下(i)CDHl甲基化引物對GTGGGCGGGTCGTTAGTTTC,SEQIDNO1禾口CTCACAAATACTTTACAATTCCGACG,SEQIDNO2；(ii)CDHl甲基化引物對GGTGGGTGGGTTGTTAGTTTTGT,SEQIDNO3禾口AACTCACAAATCTTTACAATTCCAAC,SEQIDNO:4。6.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的針對POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對如下(iii)擴增PAXl基因的甲基化引物對TATTTTGGGTTTGGGGTCGC,SEQIDNO5CCCGAAAACCGAAAACCG,SEQIDNO6；(iv)擴增PAXl基因的甲基化引物對GTTTATTTTGGGTTTGGGGTTGTG,SEQIDNO7CACCCAAAAACCAAAAACCAC,SEQIDNO:8。7.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的甲基化敏感性限制性內切酶選自HpaII、BstuI禾口HhaI。8.一種引物集的用途，所述的引物集包括(a)針對POXl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對和(b)針對CDHl基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對，其特征在于，所述的引物集被用于制備檢測宮頸癌或宮頸上皮內瘤樣病變的試劑盒。9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述的引物集還被用于制備區別宮頸癌與宮頸炎的試劑盒。10.一種基因集的用途，所述的基因集包括(a)POXl基因和(b)⑶Hl基因，其特征在于，所述的基因集被用于制備檢測宮頸癌或宮頸上皮內瘤樣病變的試劑或試劑盒。全文摘要本發明涉及一種利用PAX1和CDH1基因甲基化檢測宮頸癌的方法和試劑盒。具體地，本發明提供了一種試劑盒，它含有(a)針對POX1基因和CDH1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對；或含有(b)甲基化敏感性限制性內切酶，以及針對POX1基因和CDH1基因的特異性引物對。本發明的試劑盒可有效地將宮頸癌與宮頸炎、HPV感染區分開。文檔編號C12Q1/68GK101831490SQ200910047419公開日2010年9月15日申請日期2009年3月12日優先權日2009年3月12日發明者徐軍,王紅琳申請人:上海市第八人民醫院