專利名稱：一種利用微量基因組dna進行全基因組甲基化位點精確檢測的方法
技術領域：
本發明涉及甲基化高通量測序技術領域，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序技術領域。另外，本發明還涉及標簽測序技術以及實現多個樣品在同一反應體系中進行構建標簽文庫的方法。本發明的方法特別適用于第二代測序技術，尤其是solexa測序技術。
背景技術：
DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學機制，DNA甲基化在維持正常細胞功能、 抑制寄生DNA成分對基因組完整性的損害、染色質結構修飾、X染色體失活、基因組印跡、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一 [1]。當今DNA甲基化研究主要方法有全基因組芯片雜交、全基因組甲基化敏感(非敏感)類限制性內切酶酶切等，特異位點或部分范圍基因采用重亞硫酸處理結合甲基化特異 PCR等[2]。重亞硫酸鹽處理(Bisulfite)結合測序是研究甲基化最常用也是最準確的方法。 Illumina GA是當今應用最為普遍的新一代高通量測序儀器，現已經成功應用于全基因組甲基化測序研究，主要流程是文庫構建首先需要將基因組DNA隨機打斷，然后對目的片段進行末端修復，在目的片段的3’末端連接“Α”堿基，將3’末端帶有“Α”堿基的目的片段與DNA接頭(也稱為adapter)連接(C位點甲基化修飾)，然后進行重亞硫酸鹽處理，之后進行片段選擇，最后通過PCR反應將目的片段進行擴增，最后回收含有DNA接頭的目的片段文庫[2]，見
圖1。該方法的主要主要缺陷或問題是1、不能混合多個樣品進行甲基化文庫構建；2、PCR擴增效率不高，需要多個循環(16個循環以上)擴增后方可得到足夠量的文庫進行高通量測序；3、文庫構建起始需要基因組DNA 5-10 μ g以上，不適宜微量DNA樣品建庫。
發明內容
本發明在Illumina常規標簽(也稱為index)文庫測序[3](圖2)及甲基化常規測序[2](圖1)基礎上進行了三點創新的改變1、將常規文庫標簽測序方法引入到甲基化測序研究中，并且修改了 Illumina公司提供的常規文庫標簽測序接頭序列(表1)，增加了 6bp的堿基序列(可作為標簽序列)，合成時采用甲基化修飾，增加后續PCR引物長度， 對于重亞硫酸鹽處理完的DNA這樣有效增加了后續PCR擴增效率；2、在使用微量基因組 DNA進行甲基化文庫構建時創新性的通過添加外源DNA進行重亞硫酸鹽高效共處理，對微量的DNA片段起到保護作用，最大限度的降低重亞硫酸鹽對微量DNA的破壞，使得納克級別 (30-100ng)基因組整體水平高精度的甲基化檢測成為現實；3、改變Illumina甲基化常規測序在重亞硫酸鹽處理之前要經過片段大小選擇，然后再進行PCR擴增的流程，摸索出了一個不需要進行片段大小選擇，在重亞硫酸鹽處理后直接進行PCR擴增的條件。克服了常規甲基化測序中不能混合樣品，PCR擴增效率低及不能對微量DNA樣品進行研究的缺點。本發明的微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫構建流程圖參見圖3。
表1基于Illumina GA的微量DNA全基因組甲基化高通量測序相關序列(5，- > 3，)
權利要求
1.構建全基因組甲基化高通量測序文庫的方法，所述方法用于微量基因組DNA，優選的是納克級別的基因組，更優選的是30-100ng的基因組，所述方法包括如下步驟步驟A目的基因組DNA及外源基因組DNA的片段化目的基因組DNA和作為外源基因組DNA的材料可以為任意物種，其中包括各種植物、動物、微生物，例如人，植物特別是擬南芥，昆蟲，特別是哺乳動物包括人、小鼠的基因組DNA ； 進行片段化的方法包括霧化、超聲片段化、HydroShear或酶切處理，從而將基因組DNA打斷為大小優選地為100-200bp的片段；片段化方法中優選地采用超聲片段化法，外源基因組 DNA優選地選擇擬南芥基因組DNA ；步驟B基因組DNA的末端修飾對于經片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP補平末端，以產生平端化的DNA;然后優選地利用Klenow Frgment (3‘ -5，exo-)聚合酶及dATP在補平的序列的3，末端加上“A”堿基；步驟C微量津庫接頭連接及重亞硫酸鹽處理將步驟B所得到的3’末端加上“A”堿基的DNA序列在連接酶包括但不限于T4連接酶的作用下與經甲基化修飾，優選地C位點甲基化修飾的微量建庫接頭進行連接，優選地在序列兩端都連接上微量建庫接頭；然后在兩端加了接頭的片段中加入100-500ng,優詵的200ng步驟A中片段化了的擬南芥基因組DNA, 然后一起用重亞硫酸鹽處理，優選地處理2小時，從而使非甲基化胞嘧啶轉換為尿嘧啶；步驟D PCR擴增及文庫切膠純化以步驟C所得到的重亞硫酸鹽轉換后的DNA為模板，加入針對微量建庫接頭序列的PCR 引物序列，進行PCR擴增；PCR擴增優選地使用熱啟動taq酶，所述熱啟動taq酶包括但不限于常規的r-taq或其它聚合酶，擴增產物使用優選地2 %的瓊脂糖進行電泳并將目的條帶切下純化后，即為待測序的文庫。
2.權利要求1所沭的方法,其中步驟C中使用的微量建庫接頭是表1中所示的Minim_ adapter 1 禾口 Minim—adapter 2。
3.權利要求1所述的方法，其中步騾D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim—PCR primer 1.1 禾口 Minim—PCR primer 2. 1。
4.通過權利要求1-3中任一項所述的方法構建的測序文庫，優選地是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。
5.通過權利要求1-3中任一項所述的方法構建的測序文庫，優選地是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫用于進行測序的用途，其中所述測序可通過第二代測序平臺進行。
6.用于微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的接頭，其是表 1 中所示的 Minim_adapter 1 禾口 Minim_adapter2。
7.權利要求6所述的接頭用于構建微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的用途。
8.使用權利要求6所述的接頭構建的微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。
9.用于微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的PCR引物，其是表 1 中所示的 Minim_PCR primer 1. 1 和 Minim_PCR primer 2. 1。
10.權利要求9所述的PCR引物用于構建微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫的用途。
11.使用權利要求9所述的PCR引物構建的微量測序文庫，特別是微量DNA全基因組甲基化高通量測序文庫。
全文摘要
本發明在Illumina常規標簽文庫測序及甲基化常規測序基礎上，結合常規文庫標簽測序方法，建立了新的利用微量基因組DNA進行全基因組甲基化位點精確檢測的方法。而且本發明在使用微量基因組DNA進行甲基化文庫構建時創新性的通過添加外源NA進行重亞硫酸鹽高效共處理；同時不需要進行片段大小選擇，在重亞硫酸鹽處理后直接進行PCR擴增。本發明的方法克服了常規甲基化測序中不能混合樣品，PCR擴增效率低及不能對微量DNA樣品進行研究的缺點。
文檔編號C40B50/06GK102409408SQ20101029931
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者孫繼華, 王君文, 羅慧娟, 閆淑靜 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司