專利名稱：一種利用糞便中sfrp2基因超甲基化篩查大腸癌的方法
技術領域：
本發明屬于醫學領域，特別是公開一種篩查大腸癌的方法。
技術背景大腸癌是指大腸粘膜上皮在環境或遺傳等多種致癌因素作用下發生 的惡性病變，包括結腸癌、直腸癌和肛管癌，是最常見的消化道惡性腫 瘤之一。臨床常見血便或粘液膿血便，大便形狀或習慣發生改變，腹痛, 腹部包塊等。根據其發生部位不同，其臨床表現常各有其特殊性。大腸 癌起病隱匿，早期常無明顯的臨床表現，病情發展較慢，所以在早期易 被忽略。大腸癌的危險因素包括①年齡超過45歲，發病高峰為45-65 歲；②腺瘤性息肉，包括管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、管狀-絨毛狀腺瘤(混 合性腺瘤)，絨毛結構比例高的息肉和大的息肉更可能癌變，大腸癌生成 可能需10年時間，從可辨認的腺瘤發展為侵襲性癌需5年；③大腸癌 家族史，癌病人一級親屬的大腸癌發病率比普通人群高出2~3倍，而家 族性腺瘤性息肉病病人大腸內有成百丄T個腺瘤性息肉，如不切除結腸， 在十年內很可能發展為癌；④炎癥性腸病，潰瘍性結腸炎或Cmhn病癌 變機會隨病程而增大。隨著社會的發展，大腸癌的誘發因素不斷增加，尤其是近二十年來， 其發病率居高不下并有明顯的上升趨勢。在我國，大腸癌的發病率位居 腫瘤的第五位，發病男性多于女性。據國內統計，該病發病年齡也呈年 輕化，高發國家大腸癌高發年齡為60 70歲，30歲以下者占6%左右，而我國大腸癌好發年齡比國外提早10 15歲，30歲以下者占10%左右， 我國報道的最小的患者14歲。大腸癌的預后與確診時腫瘤的分期關系最密切，病期晚則預后差。 大腸癌患者如無轉移，手術5年存活率可超過90%;如有轉移，手術5 年存活率不足50%。大腸癌早期患者無特異性臨床癥狀，極易被忽略而 延誤治療，因此，早期發現、早期診斷、早期治療成為治療大腸癌的關 鍵因素。目前臨床常用的檢測方法有以下幾種l.直腸肛門指檢，該方 法簡單易行，是直腸癌術前檢査中最基本的方法，但是此方法容易誤診、 漏診，特異性不強。2.實驗室抽血檢査。針對性不強，且對身體有損傷， 不適合作為普查或早期診斷方法。3.內鏡檢査。4.CT診斷。5.超聲顯象 檢査。6.磁共振檢査。這些方式或對身體都有一定的創傷性，對身體造 成損傷，或特異性不強，或費用太高，因此，探索一種安全可靠、特異 性強、能早期有效篩查大腸癌的方法，使患者能早期發現、早期診斷、 早期治療大腸癌，成為醫學界噬待解決的問題。 發明內容鑒于以上問題，本發明的目的在于提供一種利用糞便中SFRP2基因 超甲基化篩査大腸癌的方法。為了達到以上目的，本發明是通過以下步驟實現的1 、標本制備，糞便DNA從糞便標本用QIAamp DNA Stool Mini Kit 分離DNA，置于-70^-85-C保存備用；2、數據收集，取500ng-2ng的基因組DNA放在容器中，用終濃度 為0.15-0.25mol/L的NaOH在36-37.5°C中變性14-17分鐘，添加30pL 的9-llmmol/L的對苯二酚和520pL的2.0-3.5mol/L的NaHS03，pH4.9-5.1，混合物在50-60。C下培養15-18小時，重亞硫酸鹽修飾的DNA 用Wizard DNA Cleanup kit純化，DNA用NaOH在室溫下培養14-17分 鐘脫磺酸基，終濃度為0.25-.035mol/L，用醋酸氨中和，PH為6.5-7.3， 終濃度為0.3mol/L， DNA用乙醇沉淀回收，用蒸餾水稀釋到終濃度為 4.5-5.5ng/^iL， 3pL的重亞硫酸鹽修飾的DNA和從80^L提取出的等量的 DNA用來擴增，PCR在反應容器中進行，包括17.875pL的ddH20、2.5jiL 的10xPCR Buffer、 2pL的dNTP Mixture 、 0.25 (iL的Forward Primer、 0.25 jaL 的Reverse Primer、 2pL的Template和0.125pL的TaKaRa Taq HS，在以 下條件下進行93-97"C變性5分鐘進入循環，循環溫度及時間為93-97 °C， 25-35秒；退火溫度U型引物45-55。C， M型引物60-64-C, 25-30 秒；70-75°C， 25-35秒，共40個循環，70-75*€延長5分鐘；3、數據處理及檢測，進行電泳分析，根據電泳圖，得出甲基化結果， 根據MSP原理判定有無腫瘤存在。本發明的原理亞硫酸氫鹽可選擇性地將胞嘧啶變成尿嘧啶，甲基 化的胞嘧啶卻不會發生變化，利用甲基化與非甲基化的差異，以亞硫酸 氫鹽處理過的DNA作模板，利用特異性的引物作PCR，擴增產物通過瓊 脂糖電泳或DNA測序就可以檢測基因是否發生甲基化。本發明是針對目前常用大腸癌檢測化驗方法對人體的創傷性及操作 的復雜性等缺陷的改進。本發明操作簡便且無創傷。通過大量反復的實 驗表明，MSP技術檢測糞便中SFRP2基因甲基化改變情況效果確切，如 若檢測到SFRP2基因發生頻繁的甲基化改變(超甲基化)則可篩査大腸 癌。本發明的優點是1、 簡便易行，易于大規模推廣；2、 通過檢測糞便中SFRP2基因發生頻繁的甲基化改變(超甲基化) 有效篩査大腸癌；3、 有效提高檢測效率，安全實用，降低檢測成本；4、 無創傷，減輕患者痛苦。
具體實施方式
患者自行收集糞便標本，糞便DNA從糞便標本(250mg)用QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen)分離DNA，置-8(TC保存備用。取500ng-2嗎 的基因組DNA在容積為50pL中用NaOH(新鮮制備，終濃度為0.2mol/L) 在37'C中變性15分鐘。接著添加30pL的10mmol/L的新鮮對苯二酚和 520pL的3.0mol/L的新鮮制備的NaHS03， pH5.0 (Sigma)，混合物在 55'C下培養16小時。重亞硫酸鹽修飾的DNA用Wizard DNA Cleanup kit (Promega)純化。DNA用NaOH在室溫下培養15分鐘脫磺酸基(終濃度 為0.3mol/L)，用醋酸氨中和，PH為7.0 (終濃度為0.3mol/L)。 DNA用 乙醇沉淀回收，用蒸餾水稀釋到終濃度為5ng/^iL。 3pL的重亞硫酸鹽修 飾的dna和從80mL提取出的等量的dna用來擴增。pcr在25pL的 反應容積中進行，包括17.875pL的ddH20、2.5pL的10xPCR Buffer、2^L 的dNTP Mixture、 0.25|iL的Forward Primer、 0.25的Reverse Primer、 2pL的Template和0.125^L的TaKaRaTaqHS，然后在以下條件下進行 95'C變性5min進入循環，循環溫度及時間為95 °C ， 30s;退火溫度U 型引物5(TC， M型引物62'C， 30s; 72。C， 30s,共40個循環，然后72°C 延伸5min。最后進行電泳分析，根據電泳圖，得出甲基化結果，根據 MSP原理判定有無腫瘤存在。
權利要求
1. 一種利用糞便中SFRP2基因超甲基化篩查大腸癌的方法，其特征是通過以下步驟實現的(1)糞便DNA從糞便標本用QIAamp DNA Stool Mini Kit分離DNA，置于-70--85℃保存備用；(2)取500ng-2μg的基因組DNA放在容器中，用終濃度為0.15-0.25mol/L的NaOH在36-37.5℃中變性14-17分鐘；添加30μL的9-11mmol/L的對苯二酚和520μL的2.0-3.5mol/L的NaHSO3，pH4.9-5.1，混合物在50-60℃下培養15-18小時；重亞硫酸鹽修飾的DNA用Wizard DNA Cleanup kit純化；DNA用NaOH在室溫下培養14-17分鐘脫磺酸基，終濃度為0.25-.035mol/L，用醋酸氨中和，PH為6.5-7.3，終濃度為0.3mol/L；DNA用乙醇沉淀回收，用蒸餾水稀釋到終濃度為4.5-5.5ng/μL；3μL的重亞硫酸鹽修飾的DNA和從80μL提取出的等量的DNA用來擴增；PCR在反應容器中進行，包括17.875μL的ddH2O、2.5μL的10×PCR Buffer、2μL的dNTP Mixture、0.25μL的Forward Primer、0.25μL的Reverse Primer、2μL的Template和0.125μL的TaKaRa Taq HS，在以下條件下進行93-97℃變性5分鐘進入循環，循環溫度及時間為93-97℃，25-35秒；退火溫度U型引物45-55℃，M型引物60-64℃，25-30秒；70-75℃，25-35秒，共40個循環，70-75℃延長5分鐘；(3)進行電泳分析，根據電泳圖，得出甲基化結果；根據MSP原理判定有無腫瘤存在。
2、 根據權利要求1所述的一種篩査大腸癌的方法，其特征在于所述判斷 的標準為糞便中SFRP2基因是否發生甲基化。
全文摘要
本發明屬于醫學領域，提供了一種篩查大腸癌的方法，該方法是一種利用糞便中SFRP2基因超甲基化篩查大腸癌，通過制作標本、收集數據、處理數據來完成篩查。本發明具有極高的準確率，為大腸癌的早期發現、早期診斷治療提供了新的方法；其設計合理，無創傷，痛苦小，費用低，可作為大腸癌的普查方法，如果應用到臨床，能大幅提高大腸癌的治愈率，降低我國大腸癌的病死率，具有極高的經濟效益和社會效益。
文檔編號C12Q1/68GK101250588SQ20081008959
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月9日 優先權日2008年4月9日
發明者東 湯, 王道榮 申請人:王道榮;湯 東