專利名稱：：一種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及有機氯降解
技術領域：
，具體的說，涉及一種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑及其制備方法。
背景技術：
：有機氯是指含有一個或多個氯原子的氯代烴類或芳香化合物，是一類重要的持久性有機污染物(POPs)，其包括DDT(dichloro-diphenyl-trichloroethane，二氯二苯三氯乙烷)、HCH(hexachlorocyolohexane，六氯環已烷)、PCP(pentachlorophenol，五氯苯酚)、PCBs(Polychlorinatedbiphenyls，多氯聯苯)等。大多數有機氯具有強疏水性、生物積累性和難降解性，有些還具有內分泌干擾作用，對環境及生物存在很大的危害。因此，有機氯污染及其修復已經成為環境科學的研究熱點。土壤有機氯污染是一個全球性的環境問題，我國尤為突出。根據廣東省生態環境與土壤研究所的調查，珠江三角洲地區土壤有機氯污染范圍廣、種類多，600個土壤樣品DDT等六種有機氯含量為0.0031.568mg/kg，蔬菜中的含量為0.0311.102mg/kg，DDT檢出率達到90%以上，已經引起突出的農產品安全問題與環境健康問題。厭氧條件下的還原脫氯反應是土壤有機氯降解的重要途徑。有機氯還原脫氯的本質是氯原子獲得電子并從有機物結構上脫除形成氯離子的過程。水稻土、紅壤等環境的厭氧過程能夠明顯促進還原脫氯反應。其中，水溶態、吸附態、絡合態的Fe(II)含量較高，在厭氧環境下這些離子可以通過電子傳遞，作用于有機氯，使其還原脫氯，降低其毒性。大量研究表明，水稻土中有機氯含量明顯低于其它土壤。例如，早年蔡道基院士發現，長江三角洲大量施用DDT的棉田改為水田后，明顯促進了DDT的降解。珠江三角洲地區的調査也發現水稻土、潮土的六六六、DDT、七氯、艾氏劑、狄氏劑、硫丹、異狄氏劑等有機氯含量均低于旱地土壤。鐵在自然環境中通常以難溶性Fe(III)氧化物的形式存在，Fe(III)的還原是由特定微生物介導的酶促反應，具有Fe(III)還原能力的細菌是鐵氧化物還原的動力。厭氧環境下，鐵還原菌的存在能夠有效促進具有還原脫氯活性的Fe(II)的生成，從而加速有機氯的還原降解。經文獻與專利檢索，在現有技術中還未發現利用鐵還原菌與含鐵礦物制備復合菌劑，并應用于有機氯污染修復的報道。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑。本發明的另一個目的在于提供上述鐵還原菌-礦物復合菌劑的制備方法。為了實現上述目的，本發明的可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑的制備方法采用液體深層發酵方法，包括如下步驟(1)培養基選用細菌培養基，加入消泡劑，調pH為7.07.2，滅菌備用；(2)搖瓶培養將產氣腸桿菌(五繞ra^z"er臟oge廳)或鐵還原叢毛單胞菌(aw2flmwzay/ern>edwce/w)接種到裝有細菌液體培養基中，進行搖瓶培養，條件為溫度3037°C、轉速150250轉/分鐘、三角瓶裝液量2040%、培養時間810小時；所述產氣腸桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC1969;所述鐵還原叢毛單胞菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC1968;(3)種子罐發酵按13%的接種量將產氣腸桿菌或叢毛單胞菌的搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養，條件為罐溫3037X:、罐壓0.020.06MPa、通氣量1:1.01.5v/v/min、攪拌速度300400轉/分鐘、發酵時間912小時；(4)發酵罐發酵按36%的接種量將產氣腸桿菌或鐵還原叢毛單胞菌的種子液移種到發酵罐，培養條件為罐溫3037°C、罐壓0.020.06MPa、通氣量1:1.0L5v/v/min、攪拌速度300400轉/分鐘、發酵時間1218小時；(5)含鐵礦物-發酵液混合處理發酵結束后，收集所得菌液，按含鐵礦物與發酵液的重量比為25:1，將兩者混合處理，充分攪拌，混合均勻后分裝。所述含鐵礦物優選水鐵礦、針鐵礦、赤鐵礦、褐鐵礦或紅壤膠體。在上述制備方法中，步驟(1)所述細菌培養基優選牛肉膏蛋白胨培養基，其配方為5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl。在上述制備方法中，步驟(1)所述消泡劑為泡敵、聚醚消沫劑GPE或豆油，加入消泡劑的重量比為0.05%。(6)產品質量檢驗合格產品中鐵還原菌活菌數25億個/克，含鐵量24%。鐵還原菌活菌數檢測方法為稀釋平板計數法。具體操作過程如下①稱取鐵還原菌-礦物混合菌劑l.Og，加入盛有99ml并裝有玻璃珠的無菌生理鹽水錐形瓶中，震蕩1020分鐘，使復合菌劑中菌體均勻分散，制成10-2稀釋度的稀釋液；②按10倍稀釋法進行稀釋取盛有9ml無菌生理鹽水試管6支，并依次編號為10—310—8，用無菌移液管吸取1.0ml10—z稀釋液到一支盛有9ml無菌生理鹽水試管中，用漩渦混合器震蕩l分鐘，使菌體均勻分散，制成10—3稀釋液，用同樣的方法制備10—A10-8稀釋液;③用無菌移液管分別吸取0.1ml10-6、10—7、10—8三個稀釋液于相應編號已制備好的牛肉膏蛋白胨培養基平板上(每個稀釋度做三個平行)，用無菌玻璃涂布棒將平板表面的菌液均勻向四周涂布擴散，將平板倒置于3(TC恒溫箱中培養；1016小時后每一個活菌細胞可以在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落，根據平板上菌落的數目，計算每克混合菌劑中所含的活菌總數，計算公式如下每克混合菌劑中活菌數=(同一稀釋度的3個平板上菌落平均數x稀釋倍數)/混合菌劑克數含鐵量的檢測方法為鄰菲羅啉顯色法。具體操作過程如下取lg鐵還原菌-礦物混合菌劑于20ml6.0MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分鐘震蕩1.5小時；把菌體等沉淀濾掉，用1%的鹽酸羥胺將濾液中的Fe(III)還原成Fe(II)，然后采用鄰菲羅林法顯色，采用紫外-可見分光光度計在510nm處測定混合菌劑中的鐵其中，g/L是指每lL液體培養基中加入目標物的克數；%是指每100份質量的液體發酵培養基中接入接種物的質量分數；v/v/min是指每分鐘向1份體積的培養基中通入空氣的體積分數。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明以普通細菌培養基(牛肉膏蛋白胨培養基)為主要營養物，在維持適宜pH、溫度與通氣量的條件下，使具有鐵還原活性的菌株得以生長與增殖，所得發酵液按一定比例與含鐵礦物混合制成鐵還原菌-礦物復合菌劑。(1)此鐵還原菌-礦物復合菌劑具有加速有機氯降解的功效，可為有機氯污染修復提供一條新的處理途徑。(2)鐵還原菌是從自然環境中分離純化所得，含鐵礦物也是自然環境原有物質，因此本發明來源于自然環境，又應用于自然環境，對環境友好無害，不會對原有環境的生態結構造成破壞。(3)生產方法簡單，易于實現大規模生產。圖1為本發明的制備流程圖。具體實施例方式實施例l產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑(1)培養基選用牛肉膏蛋白胨培養基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比例加入消泡劑泡敵，調pH為7.05，充分溶解，攪拌均勻后，在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與12rc下滅菌30分鐘，冷卻至35。C備用。(2)搖瓶培養從保藏正常的產氣腸桿菌(五.CGMCC1969)斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。條件為溫度35。C、轉速200轉/分鐘，三角瓶裝液量40%，培養時間9小時。(3)種子罐發酵按2%的接種量將產氣腸桿菌搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養。培養條件為罐溫35。C、罐壓0.04MPa、通氣量1:1.0v/v/min、攪拌速度400轉/分鐘、發酵時間10小時。(4)發酵罐發酵按5%的接種量將產氣腸桿菌種子液移種到發酵罐。培養條件為罐溫35。C、罐壓0.04MPa、通氣量1:1.0v/v/min、攪拌速度400轉/分鐘、發酵時間12小時。(5)礦物-發酵液混合處理發酵結束后，收集所得菌液。按水鐵礦與產氣腸桿菌發酵液的重量比為5:1，將兩者混合處理，充分攪拌，混合均勻后分裝。(6)產品質量檢驗采用稀釋平板計數法檢驗產品中產氣腸桿菌活菌數。具體操作過程如下①稱取產氣腸桿菌-水鐵礦混合菌劑1.0g，加入盛有99ml并裝有玻璃珠的無菌生理鹽水錐形瓶中，震蕩1020分鐘，使復合菌劑中菌體均勻分散，制成10—2稀釋度的稀釋液；②按10倍稀釋法進行稀釋:取盛有9ml無菌生理鹽水試管6支，并依次編號為10—310—8，用無菌移液管吸取l.Oml10—2稀釋液到一支盛有9ml無菌生理鹽水試管中，用漩渦混合器震蕩1分鐘，使菌體均勻分散，制成10—3稀釋液，用同樣的方法制備10—410—s稀釋液；③用無菌移液管分別吸取O.lml10—6、10—7、10-8三個稀釋液于相應編號已制備好的牛肉膏蛋白胨培養基平板上(每個稀釋度做三個平行)，用無菌玻璃涂布棒將平板表面的菌液均勻向四周涂布擴散，將平板倒置于3(TC恒溫箱中培養；④16小時后根據平板上菌落的數目，按照如下公式計算每克混合菌劑中所含的活菌總數每克混合菌劑中活菌數=(同一稀釋度的三個平板上菌落平均數x稀釋倍數)/混合菌劑克數結果顯示，產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑中活菌數為8.2億個/克。采用鄰菲羅林顯色法檢驗產品的含鐵量。具體操作過程如下取lg產氣腸桿菌-水鐵礦混合菌劑于20ml6.0MHC1溶液(M表示每升水中含HC1的摩爾數)中180轉/分鐘震蕩1.5小時；把菌體等沉淀濾掉，用l免的鹽酸羥胺將濾液中的Fe(in)還原成Fe(n)，然后采用鄰菲羅林法給濾液中的Fe(II)顯色，采用紫外-可見分光光度計在510nm處測定混合菌劑中的鐵含量。結果顯示，產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑中鐵含量為52.3%。實施例2產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑(1)培養基選用牛肉膏蛋白胨培養基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05免重量比加入消泡劑聚醚消沫劑GPE，調pH為7.17，充分溶解，攪拌均勻后，在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與121°C下滅菌40分鐘，冷卻至3(TC備用。(2)搖瓶培養從保藏正常的產氣腸桿菌(￡.^ragw"CGMCC1969)斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。條件為溫度37。C、轉速220轉/分鐘，三角瓶裝液量40%，培養時間IO小時。(3)種子罐發酵.按3%的接種量將產氣腸桿菌的搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養。培養條件為罐溫37。C、罐壓0.03MPa、通氣量1:1.5v/v/min、攪拌速度300轉/分鐘、發酵時間12小時。(4)發酵罐發酵按5%的接種量將產氣腸桿菌的種子液移種到發酵罐。培養條件為罐溫37。C、罐壓0.03MPa、通氣量1:1.5v/v/min、攪拌速度300轉/分鐘、發酵時間15小時。(5)礦物-發酵液混合處理發酵結束后，收集所得菌液。按紅壤膠體與產氣腸桿菌發酵液的重量比為4:1，將兩者混合處理，充分攪拌，混合均勻后分裝。(6)產品質量檢驗產品中產氣腸桿菌活菌數檢驗方法同實施例l。結果顯示，產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑中活菌數為7.8億個/克。產品的含鐵量檢驗方法同實施例1。結果顯示，產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑中鐵含量為5.6%。實施例3鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑(1)培養基選用牛肉膏蛋白胨培養基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比加入消泡劑豆油，調pH為7.12，充分溶解，攪拌均勻后，在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與121'C下滅菌30分鐘，冷卻至37。C備用。(2)搖瓶培養從保藏正常的鐵還原叢毛單胞菌(C./m7'm^"似CGMCC1968)斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。條件為溫度3(TC、轉速180轉/分鐘，三角瓶裝液量40%，培養時間8小時。(3)種子罐發酵按3%的接種量將鐵還原叢毛單胞菌的搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養。培養條件為罐溫3(TC、罐壓0.02MPa、通氣量l:1.0v/v/min、攪拌速度300轉/分鐘、發酵時間9小時。(4)發酵罐發酵按5%的接種量將鐵還原叢毛單胞菌種子液移種到發酵罐。培養條件為罐溫3(TC、罐壓0.02MPa、通氣量1:1.0v/v/min、攪拌速度300轉/分鐘、發酵時間12小時。(5)礦物-發酵液混合處理發酵結束后，收集所得菌液。按針鐵礦與產氣腸桿菌發酵液的重量比為2:1，將兩者混合處理，充分攪拌，混合均勻后分裝。(6)產品質量檢驗產品中鐵還原叢毛單胞菌活菌數檢驗方法同實施例1。結果顯示，鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑中活菌數為97億個/克。產品的含鐵量檢驗方法同實施例l。結果顯示，鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑中鐵含量為31.9%。實施例4鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑(1)培養基選用牛肉膏蛋白胨培養基，5g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，按0.05%重量比加入消泡劑泡敵，調pH為7.10，充分溶解，攪拌均勻后，在種子罐或發酵罐中經15磅壓力與12rC下滅菌30分鐘，冷卻至35。C備用。(2)搖瓶培養從保藏正常的鐵還原叢毛單胞菌(C./wnV"e^"似CGMCC1968)斜面培養基上挑取一環接種到裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，進行搖瓶培養。條件為溫度32。C、轉速200轉/分鐘，三角瓶裝液量40%，培養時間9小時。(3)種子罐發酵按3%的接種量將鐵還原叢毛單胞菌搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養。培養條件為罐溫32°C、罐壓0.02MPa、通氣量1:1.0v/v/min、攪拌速度400轉/分鐘、發酵時間10小時。(4)發酵罐發酵按5%的接種量將鐵還原叢毛單胞菌種子液移種到發酵罐。培養條件為罐溫32。C、罐壓0.02MPa、通氣量1:1.0v/v/min、攪拌速度400轉/分鐘、發酵時間15小時。(5)礦物-發酵液混合處理發酵結束后，收集所得菌液。按赤鐵礦與鐵還原叢毛單胞發酵液的重量比為3:1，將兩者混合處理，充分攪拌，混合均勻后分裝。(6)產品質量檢驗產品中鐵還原叢毛單胞菌活菌數檢驗方法同實施例1。結果顯示，鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑中活菌數為109億個/克。產品的含鐵量檢驗方法同實施例l。結果顯示，鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑中鐵含量為50.8%。實施例5產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑加速有機氯降解的效果稱取5g按實施例1制備所得的產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑，投放到含有10mg/kgDDT(二氯二苯三氯乙垸)的土壤中，充分混合均勻，并置于N2/CO2=80/20的厭氧環境下3(TC恒溫培養，030天內測定并記錄其DDT含量(單位為mg/kg)，結果見表l:表1.產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑對DDT降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>說明產氣腸桿菌-水鐵礦復合菌劑可顯著加速有機氯的降解。實施例6鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑加速有機氯降解效果稱取5g按實施例3制備所得的鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑，投放到含有10mg/kgDDT的土壤中，充分混合均勻，并置于N2/CO2=80/20的厭氧環境下30'C恒溫培養，030天內測定并記錄其DDT含量(單位為mg/kg)，結果見表2:表2.鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑對DDT降解效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>說明鐵還原叢毛單胞菌-針鐵礦復合菌劑同樣具有加速有機氯降解的功效。實施例7產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑加速有機氯降解的效果稱取5g按實施例2制備所得的產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑，投放到含有10mg/kgPCP(五氯苯酚)的土壤中，充分混合均勻，并置于N2/CO2=80/20的厭氧環境下3CTC恒溫培養，030天內測定并記錄PCP的含量(單位為mg/kg)，結果見表3:表3.產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑對PCP降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>說明產氣腸桿菌-紅壤膠體復合菌劑可顯著加速有機氯的降解。實施例8鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑加速有機氯降解的效果稱取5g按實施例4制備所得的鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑，投放到含有10mg/kgHCH(六氯環已垸)的土壤中，充分混合均勻，并置于N2/CO2=80/20的厭氧環境下3(TC恒溫培養，030天內測定并記錄HCH含量(單位為mg/kg)，結果見表4:表4.鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑對HCH降解的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>說明鐵還原叢毛單胞菌-赤鐵礦復合菌劑可顯著加速有機氯的降解。權利要求1.一種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)培養基選用細菌培養基，加入消泡劑，調pH為7.0～7.2，滅菌備用；(2)搖瓶培養將產氣腸桿菌或鐵還原叢毛單胞菌接種到裝有細菌液體培養基中，進行搖瓶培養；條件為溫度30～37℃、轉速150～250轉/分鐘、三角瓶裝液量20～40％、培養時間8～10小時；所述產氣腸桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC1969；所述鐵還原叢毛單胞菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC1968；(3)種子罐發酵按1～3％的接種量將產氣腸桿菌或叢毛單胞菌的搖瓶菌液移入種子罐，進行發酵培養，條件為罐溫30～37℃、罐壓0.02～0.06MPa、通氣量1∶1.0～1.5v/v/min、攪拌速度300～400轉/分鐘、發酵時間9～12小時；(4)發酵罐發酵按3～6％的接種量將產氣腸桿菌或鐵還原叢毛單胞菌的種子液移種到發酵罐，培養條件為罐溫30～37℃、罐壓0.02～0.06MPa、通氣量1∶1.0～1.5v/v/min、攪拌速度300～400轉/分鐘、發酵時間12～18小時；(5)發酵液-礦物混合處理發酵結束后，收集發酵所得菌液，按含鐵礦物與發酵液的重量比為2～5∶1，將含鐵礦物與發酵液混合處理，充分攪拌，混合均勻，分裝。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述細菌培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，配方為5g/L牛肉膏、10g/L蛋白胨、5g/LNaCl。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述消泡劑為泡敵、聚醚消沫劑GPE或豆油，加入消泡劑的重量比為0.05%。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述含鐵礦物為水鐵礦、針鐵礦、赤鐵礦、褐鐵礦或紅壤膠體。5.—種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑，其特征是利用權利要求1所述制備方法制備得到。全文摘要本發明公開了一種可加速有機氯降解的鐵還原菌-礦物復合菌劑及其制備方法。本發明以普通細菌培養基為主要營養物，在維持適宜pH、溫度與通氣量的條件下，使具有鐵還原活性的菌株得以生長與增殖，所得發酵液按一定比例與含鐵礦物混合制成鐵還原菌-礦物復合菌劑。(1)此鐵還原菌-礦物復合菌劑具有加速有機氯降解的功效，可為有機氯污染修復提供一條新的處理途徑。(2)鐵還原菌是從自然環境中分離純化所得，含鐵礦物也是自然環境原有物質，因此本發明來源于自然環境，又應用于自然環境，對環境友好無害，不會對原有環境的生態結構造成破壞。(3)生產方法簡單，易于實現大規模生產。文檔編號C22B3/18GK101096646SQ20071002839公開日2008年1月2日申請日期2007年6月1日優先權日2007年6月1日發明者周順桂,李曉敏,李芳柏,王躍強申請人:廣東省生態環境與土壤研究所