專利名稱：利用免疫玫瑰花結分離細胞的方法
技術領域：
本發明涉及利用免疫玫瑰花結(immunorosettes)分離細胞的方法。本發明包括在本發明的方法中使用的新型抗體組合物。
純化的免疫細胞(如T細胞和抗原遞呈細胞)群體是研究免疫功能所必需的，并在免疫治療中使用。對細胞、分子和生物化學過程的研究需要分析分離的某些細胞型。大量技術已經用于分離T細胞亞組、B細胞、嗜堿性粒細胞、NK細胞和樹突細胞。
造血干細胞的分離也已經是備受關注的領域。純干細胞群體將促進對血細胞生成的研究，來自外周血和/或骨髓的造血細胞的移植越來越多地與高劑量化學治療和/或放射治療結合用于治療多種疾病，包括惡性、非惡性和遺傳疾病。這些移植物中的極少量細胞能長期造血重建，因此有一種強烈需求來發展造血干細胞的純化技術。此外，嚴重的并發癥和實際上移植方法的成功很大程度上依賴于用于去除移植物中對移植受體造成危險的細胞的方法的效果。這些細胞包括引起異體移植中移植物抗宿主疾病(GVHD)的T淋巴細胞，和可引起惡性生長復發的自體移植物中的腫瘤細胞。通過除去不必要的細胞，從而減少需輸入的細胞保藏劑的體積，縮減移植物也是重要的。
在某些情況中，從生物樣品如骨髓移植物中除去或排除腫瘤細胞是希望的。支氣管、乳房導管和胃腸道及泌尿生殖道的上皮癌代表了今天所能見到的主要的實體瘤類型。微轉移腫瘤細胞遷移被認為是上皮癌患者的一個重要的預后因素(Braun等人，2000；Vaughan等人，1990)。檢測這些轉移細胞的能力受組織或液體取樣的效率和腫瘤檢測方法靈敏度的限制。一種富集血樣中循環上皮腫瘤細胞的技術會提高檢測轉移疾病的能力，并將促進對這些稀少細胞的研究和確定使疾病擴散的生物學變化。
造血細胞和免疫細胞已經根據物理性質(如密度)和對可殺傷循環細胞的某些藥理試劑的敏感性分離。抗細胞表面抗原的單克隆抗體的出現已經大大擴展了區別和分離不同細胞型的能力。用單克隆抗體從血液和相關細胞懸液中分離細胞群體有兩種基本方法。它們的不同之外在于是用抗體區別、標記希望的還是不希望的細胞。
在正選擇技術中，希望的細胞用抗體標記，并從剩余的未標記/不必要的細胞中移出。在負選擇中，標記并移出不需要的細胞。抗體/補體處理和免疫毒素的使用是負選擇技術，但是FACS分選和大多數分批免疫吸附技術能適用于正選擇和負選擇兩者。在免疫吸附技術中，細胞用單克隆抗體選擇，優先結合到能從剩余細胞中去除的表面上，例如珠柱、燒瓶、磁性顆粒。免疫吸附技術在臨床上和研究中受到歡迎，因為它們保持了用單克隆抗體導向細胞的高特異性，但是不同于FACS分選，它們能被放大，以直接處理臨床收獲物中的大量細胞，它們避免了使用細胞毒性試劑(如免疫毒素)和補體的危險。然而，它們需要利用“裝置”或細胞分離表面，如珠柱、淘洗瓶或磁鐵。
分離造血干細胞、免疫細胞和循環上皮腫瘤細胞的現有技術全都包括一個初始步驟，來除去紅細胞，然后是對一種裝置或人工顆粒的抗體介導的粘附。(Firat等人，1988；de Wynter等人，1975；Shpall等人，1994；Thomas等人，1994；Miltenyi Biotec Inc.，Gladbach，德國)。在正選擇的情況中，還有另外一個步驟從該裝置或顆粒中去除細胞。所有這些多個步驟都需要時間并且導致細胞損失。Slaper-Cortenbach等人(1990)描述了一種利用形成免疫玫瑰花結凈化骨髓的普通急性白血病(cALL)細胞的方法。該方法需要首先從骨髓樣品中去除紅細胞，并用可結合cALL細胞的抗體標記。標記的紅細胞然后被加回cALL細胞已形成免疫玫瑰花結的樣品中。當隨后還有一個補體介導的cALL細胞裂解步驟時，該排除方法效果最好。
密度分離通常用于將外周血單核細胞與粒細胞和紅細胞分離。Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)是用于此用途的最常用的密度溶液。在Ficoll密度分離中，全血在Ficoll上分層，然后離心。紅細胞和粒細胞位于細胞沉淀中，而單核細胞保持在Ficoll血漿界面。該技術的成功依賴于單核細胞和粒細胞密度的不同。如果全血貯存超過24小時，粒細胞密度改變，將與紅細胞一起沉淀。在一次密度分離中不能從細胞密度改變的貯存的血液或樣品中獲得純單核細胞懸液。
由上可見，在本領域中需要提供新型方法，用來從生物樣品中分離希望的細胞或去除不希望的細胞。
因此，在一個實施方案中，本發明提供一種從含有具核細胞和紅細胞的樣品中分離具核細胞的方法，其包括(1)在具核細胞與紅細胞可形成免疫玫瑰花結的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與將要分離的具核細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接；和
(2)從樣品中去除免疫玫瑰花結。
該方法能在正選擇和負選擇方案中使用。該方法適用于含有紅細胞的任何樣品，包括全血、骨髓、胎肝、臍帶血、棕黃層懸液、胸膜和腹膜滲出液和胸腺細胞及脾細胞樣品。
發明詳述I.發明方法如上所述，本發明涉及一種通過細胞與紅細胞形成免疫玫瑰花結分離細胞的方法。
最廣義的來講，本發明提供一種從含有具核細胞和紅細胞的樣品中分離具核細胞的方法，其包括(1)在具核細胞與紅細胞可形成免疫玫瑰花結的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與將要分離的具核細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接；和(2)從樣品中去除免疫玫瑰花結。
該方法能在正選擇和負選擇方案中使用。在正選擇中，希望的細胞形成玫瑰花結。在這種實施方案中，該方法進一步包括裂解免疫玫瑰花結中的紅細胞和分離希望的細胞的步驟。因此在正選擇方法中，抗體組合物將含有(a)至少一種抗體，其對人們希望獲得或從樣品中分離的具核細胞特異。
優選地，本發明的方法在負選擇方案中使用。在負選擇中，希望的細胞不形成免疫玫瑰花結，而是在去除免疫玫瑰花結后保留在樣品中。在負選擇方法中，抗體組合物將含有(a)至少一種抗體，其對人們希望從樣品中去除的細胞特異。因此，本發明提供一種負選擇方法，用于在含有希望的細胞、紅細胞和不希望的細胞的樣品中富集并回收希望的細胞，該方法包括(1)在不希望的細胞與紅細胞可形成免疫玫瑰花結的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接；和(2)從剩余樣品中分離免疫玫瑰花結，以獲得富含希望的細胞的樣品。
利用多種技術，能將在步驟(1)中紅細胞和不需要的細胞之間形成的免疫玫瑰花結與希望的細胞分離。在一個實施方案中，含有疫玫瑰花結的樣品在浮力密度溶液(如Ficoll-Hypaque)上分層并離心。免疫玫瑰花結沉淀，而希望的細胞保留在浮力密度溶液與樣品之間的界面上。然后從界面上移出希望的細胞供進一步使用。在另外一個實施方案中，在步驟(1)中獲得的含有免疫玫瑰花結的樣品與一種沉淀試劑(如羥乙基淀粉/明膠或甲基纖維素)混合，并使玫瑰花結沉淀。需要的細胞保留在懸液中，移出用于進一步用途。在另一個實施方案中，在步驟(1)中獲得的含有免疫玫瑰花結的樣品在借助或不借助離心或反向流動淘析的情況下沉淀。希望的細胞保留在懸液中，移出用于進一步的用途。
下面更詳細地描述本發明使用的抗體組合物。
本發明的方法可在含有紅細胞的生物樣品(包括血液(特別是臍帶血和全血)、骨髓、胎肝、棕黃層懸液、胸膜和腹膜滲出液和胸腺細胞和脾細胞懸液)的處理中使用。令人驚訝的是，發明者發現該方法能用來直接從全血或全骨髓中除去細胞，而不需要預先處理。這使本發明的方法具有優于現有方法的一個重要優點。特別是，紅細胞中不須被去除、標記和加回樣品中。
本發明的方法能用來制備富含任何細胞型的樣品，這些細胞型包括但不限于T細胞、B細胞、NK細胞、樹突細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、先祖細胞、干細胞和腫瘤細胞。
在一個實施方案中，本發明的方法能用來由骨髓樣品制備造血先祖和干細胞制品。例如，本發明的方法可在負選擇方案中用來從樣品中排除或凈化B和T淋巴細胞、單核細胞、NK細胞、粒細胞和/或腫瘤細胞，以制備造血先祖和干細胞制品，以在本領域技術人員明白的移植以及其他治療方法中使用。例如，在異體移植中能從供體中收集骨髓或血液，并用此處描述的方法富集先祖和干細胞。利用負選擇，制品中的人造血先祖和干細胞不被抗體覆蓋，或修飾，使其十分適用于移植和本領域技術人員明白的其他治療用途。
在另一個實施方案中，本發明的方法能用來從血液中分離并回收成熟樹突細胞和它們的前體。樹突細胞有許多有用的用途，包括作為能在體外和體內都激活T細胞的抗原遞呈細胞。一個例子是，樹突細胞能在體外裝載(脈沖)一種腫瘤抗原，并且體內注射，誘導抗腫瘤T細胞反應。
在另一個實施方案中，本發明的方法也可用來由樣品(如血液和骨髓)制備細胞懸液，其富含所選的分化細胞型，如T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞、樹突細胞、嗜堿性粒細胞和漿細胞。這使得能研究細胞與細胞的特異相互作用，包括生長因子產生和對生長因子的反應。這也允許對特異細胞型進行分子和生物化學分析。富含NK細胞、樹突細胞和T細胞的細胞制品也能在針對某些惡性疾病的免疫治療中使用。
在另一個實施方案中，本發明的方法能用來從樣品中分離腫瘤細胞，例如非造血轉移腫瘤細胞。該方法在檢測來自患者的血液、骨髓、腹膜和胸膜滲出液的非造血腫瘤細胞中有用，以幫助轉移疾病的診斷和檢測，監視轉移疾病的發展，監視治療的效果。II.抗體組合物本發明包括在本發明的方法中使用的抗體組合物。該抗體組合物將包含(a)至少一種抗體，它能與具核細胞上的一種抗原結合，該抗體與(b)至少一種能與紅細胞上的抗原結合的抗體直接或間接地連接。
術語“至少一種抗體”意指抗體組合物至少包含一種類型的抗體(與至少一個抗體分子不同)。一種類型的抗體是指一種可與特定抗原結合的抗體。例如，可與抗原CD2結合的抗體被認為是一種類型的抗體。優選地，本發明的抗體組合物含有(a)一種以上的可與具核細胞結合的抗體類型。
兩種抗體(a)和(b)可通過制備的雙功能或雙特異性抗體直接連接。兩種抗體(a)和(b)也可通過例如制備的四聚抗體復合物間接連接。所有這些都在以下描述。
一方面，對具核細胞特異的抗體直接與紅細胞特異的抗體連接。在一個實施方案中，本發明的抗體組合物含有雙功能抗體，其包含至少一種對具核細胞特異的抗體，其與(b)至少一種紅細胞特異性抗體直接連接。雙功能抗體可通過將一種抗體與另一種抗體化學偶聯制備，例如，使用N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)。
在另一個實施方案中，抗體組合物含有雙特異性抗體。雙特異性抗體含有紅細胞特異的抗體的可變區，和對于將要分離的具核細胞表面上的至少一種抗原特異的可變區。雙特異性抗體可通過形成雜種雜交瘤制備。雜種雜交瘤可以用本領域周知的方法制備，例如Staerz和Bevan(1986，PNAS(USA)831453)和Staerz和Bevan(1986，Immunology Today，7241)中所公開的。雙特異性抗體也可通過使用如Staerz等人(1985，Nature，314628)和Perez等人(1985，Nature316354)所述的方法通過化學方法構建，或通過重組免疫球蛋白基因構建體的表達構建。
另一方面，本發明的抗體組合物含有(a)至少一種對具核細胞型特異的抗體，其與(b)至少一種紅細胞特異的抗體間接連接。“間接連接”意指抗體(a)和抗體(b)不是彼此直接共價連接，而是通過連接部分(如免疫復合物)連接。在一個優選實施方案中，通過制備四聚抗體復合物將具核細胞型的抗體與紅細胞特異的抗體間接連接。可以通過將能與紅細胞結合的第一種單克隆抗體與能與將要分離的具核細胞結合的第二種單克隆抗體混合制備四聚抗體復合物。第一種和第二種單克隆抗體來自第一種動物種。第一種和第二種抗體與大約等摩爾量的第二種動物種的單克隆抗體反應，后者抗第一種動物種的抗體的Fc-片段。第一種和第二種抗體也可與大約等摩爾數量的第二種動物種的單克隆抗體的F(ab′)2片段反應，后者抗第一種動物種的抗體的Fc-片段。(參見授予Lansdorp的美國專利號4,868,109，關于四聚抗體復合物及其制備方法的描述在此引用作為參考)。
優選地，紅細胞特異的抗體是抗-血型糖蛋白A。本發明的抗體組合物中含有的抗-血型糖蛋白A用來結合紅細胞。血型糖蛋白A特異的單克隆抗體的例子有10F7MN(美國專利號4,752,582，細胞系ATCC保藏號HB-8162)和D2.10(Immunotech，馬賽，法國)。
優選地，具核細胞特異的抗體是一種抗體組合。抗體組合可以對許多細胞型特異，使得可以從樣品中去除許多細胞型。當使用抗體組合時，每種抗體將與一種紅細胞特異的抗體連接(直接或間接地)。
在一個優選的實施方案中，抗體組合物是一種四聚復合物，其含有(a)可結合紅細胞的抗-血型糖蛋白A抗體，(b)一種可與人們希望形成免疫玫瑰花結的具核細胞型結合的抗體，和(c)可與(a)和(b)兩者的Fc部分(任選的F(ab’)2抗體片段)結合的抗體。(a)∶(b)∶(c)的摩爾比可能約為1∶3∶4。當要分離幾種類型的細胞時，可用幾種抗-具核細胞抗體(b)制備復合物。然后可將復合物一起混合，形成一種抗體組合物，供本發明的方法使用。
圖1是通過四聚抗體復合物形成的玫瑰花結的示意圖。
在本
發明內容
中，抗體被理解為包括單克隆抗體和多克隆抗體、抗體片段(例如，Fab和F(ab′)2)、嵌合抗體、雙功能或雙特異性抗體和四聚抗體復合物。如果以適當的親和力(結合常數)結合，例如大于或等于107M-1，則認為抗體對具核細胞或紅細胞表面上的選擇抗原有反應性。
單克隆抗體優選地在本發明的抗體組合物中使用。對于具核細胞表面上的選擇抗原特異的單克隆抗體可以利用常規技術容易地產生。例如，單克隆抗體可以通過Kohler和Milstein 1975發展的雜交瘤技術產生(Nature 256，495-497；參見美國專利號RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993，在此引用作為參考；參見《單克隆抗體，雜種瘤生物學分析的一個新方面》，Plenum Press，Kennett，McKearn，Bechtol(編)1980，和《抗體實驗室手冊》，Harlow和Lane(編)，冷泉港實驗室出版社，1988)。也可利用其他技術構建單克隆抗體(例如，參見William D.Huse等人，1989，“在λ噬菌體中產生免疫球蛋白組成成分大組合文庫”，Science 2461275-1281，L.Sastry等人，1989，“為了產生單克隆催化抗體，免疫學組成成分在大腸桿菌中的克隆重鏈可變區特異cDNA文庫的構建”，Proc Natl.Acad.Sci.USA865728-5732；Kozbor等人，1983 Immunol.Today 4,72，關于人B細胞雜交瘤技術；Cole等人，1985，《癌癥治療中的單克隆抗體》，AllenR.Bliss，Inc.，77-96頁，關于生產人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術；參見Michelle Alting-Mees等人，1990，“單克隆抗體表達文庫雜交瘤的一種快速替代” Strategies in Molecular Biology 31-9)。為了生產對抗原有特異反應性的抗體，能免疫化學篩選雜交瘤細胞，并可分離單克隆抗體。
抗體可以用常規技術切成片段，并用與以上對于完整抗體相同的方法依用途篩選這些片段。例如，F(ab′)2片段能通過用胃蛋白酶處理抗體產生。可處理產生的F(ab′)2片段，還原二硫橋，產生Fab’片段。
本發明也涉及嵌合抗體衍生物，即結合了非人動物可變區和人恒定區的抗體分子。嵌合抗體分子可包括，例如，來自小鼠、大鼠或其他種的抗體的抗原結合域，及人恒定區。已經描述了多種制備嵌合抗體的方法，它們能用來制備含有可識別分化細胞或腫瘤細胞表面上的選擇抗原的免疫球蛋白可變區的嵌合抗體。參見，例如，Morrison等人，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Takeda等人，1985，Nature 314452；Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Boss等人，美國專利號4,816,397；Tanaguchi等人，歐洲專利公開文本EP171496；歐洲專利公開文本0173494，英國專利2177096B。
雙功能抗體可通過化學偶聯、體細胞雜交或遺傳工程技術制備。
化學偶聯是基于含有ε-氨基或絞鏈區硫醇基的同型和異型雙功能試劑的使用。同型雙功能試劑如5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)在兩個Fab之間產生二硫鍵，O-次苯基二馬來酰亞胺(O-PDM)在兩個Fab之間產生硫醚鍵(Brenner等人，1985，Glennie等人，1987)。異型雙功能試劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)結合抗體的暴露氨基和Fab片段，而無論類型或同種型如何(Van Dijk等人，1989)。
體細胞雜交包括兩種建立的雜種瘤的融合，產生四合瘤(quadroma)(Milstein和Cuello，1983)，或一種建立的雜交瘤與來自用第二種抗原免疫的小鼠的淋巴細胞的融合，產生三合瘤(trioma)(Nolan和Kennedy，1990)。使每種雜交瘤細胞系對特異抗藥性標記有抗性(De Lau等人，1989)，或用不同熒光染料標記每種雜交瘤并分選出異源熒光細胞(Karawajew等人，1987)，選擇雜種雜交瘤。
遺傳工程包括基于重組DNA的技術的使用，以將編碼抗體特異片段的DNA序列連接于質粒中，并表達重組蛋白。雙特異性抗體也能使用接頭通過結合兩種單鏈Fv(scFv)片段制備為單一共價結構(Winter和Milstein，1991)；作為共表達來自轉錄因子fos和jun的序列的亮氨酸拉鏈(Kostelny等人，1992)；共表達p53作用域的螺旋-轉角-螺旋(Rheinnecker等人，1996)，或diabodies(Holliger等人，1993)。
表1提供針對具核細胞上特定人抗原的抗體的例子，它們可在本發明的方法中使用。本發明的方法也可用于其他物種。針對具核細胞的一種或多種抗體的選擇將取決于樣品的性質、將要富集或排除的細胞的選擇，和該方法是正選擇還是負選擇方法。在所有情況中，當在本發明的方法中使用時，針對將要形成免疫玫瑰花結的具核細胞的抗體將與紅細胞特異的抗體直接或間接連接。
本發明的方法和抗體組合物優選地在負選擇方案中，用來制備一種富含特定細胞型的細胞制品。這通過使用缺乏針對希望分離的特定細胞型的抗體的抗體組合物實現。因此，本發明提供一種抗體組合物，用于在含有希望的細胞、紅細胞和不希望的細胞的樣品中富集和回收希望的細胞，該抗體組合物含有(a)至少一種可與不希望的細胞上的抗原結合的抗體，其與(b)至少一種可結合紅細胞的抗體連接。表2列出了可在本發明的負選擇方案中用于人體細胞的抗體組合物的具體實施方案。該表提供了能在上述方法中用作抗體(a)富集特定細胞型的抗特定抗原抗體的列表和混合配方(雞尾酒)。在大多數情況中，提供了必需抗體的幾種選擇，以及幾種任選的抗體。例如，為了富集T細胞，抗體(a)可以是抗下列成分的抗體的雞尾酒(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14。雞尾酒可任選地含有抗CD33和/或CD56和/或IgE和/或CD41的抗體。除了表2列出的抗體組合外，本領域技術人員應當理解，也可用其他抗體組合富集特定細胞型，如美國專利號5,877,299所述，在此引用作為參考。由于本發明涉及制備富集細胞制品的免疫玫瑰花結的制備，本領域技術人員應當理解，也可使用其他抗體和抗體組合。
本發明的方法和抗體組合物可在正選擇方案中，用來制備一種細胞制品，其中希望的細胞形成免疫玫瑰花結。下面列出了在正選擇方案中有用的抗體組合的一些例子。
為了用正選擇方法分離非造血腫瘤細胞，抗體組合物包含對腫瘤細胞表達的非造血抗原特異的抗體，如抗乳癌和肺癌和成神經細胞瘤細胞表面上表達的抗原的抗體。上皮腫瘤細胞上表達的非造血抗原的抗體可從商業來源獲得(如表3所示)，或可用本領域周知的技術制備。
為了用正選擇方法分離B細胞，抗體組合物含有抗CD24和/或CD19和/或CD20和/或CD22的抗體。
為了用正選擇方法分離T細胞，抗體組合物含有抗CD3和/或CD2和/或CD5和/或CD4和CD8兩者的抗體。
為了用正選擇方法分離NK細胞，抗體組合物含有抗CD56的抗體。
為了用正選擇方法分離粒細胞，抗體組合物含有抗CD16和/或CD66e和/或CD66b的抗體。
為了用正選擇方法分離單核細胞，抗體組合物含有抗CD14的抗體。
下列非限制性實施例說明本發明實施例抗體組合物根據人們希望排除哪些細胞通過結合不同的四聚抗體復合物制備。不同的四聚抗體復合物的濃度不同抗具核細胞上表達的抗原的抗體一般在四聚復合物中為10-30μg/mL。該組合物然后向細胞中1/10稀釋，使細胞懸液中每種抗具核細胞抗體的終濃度為1.0-3.0μg/mL。
1.每mL全外周血加入100μL抗體組合物。
2.在室溫下溫育20分鐘。
3.用等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)+2％胎牛血清(FCS)稀釋樣品，并輕輕混合。
4.將被稀釋的樣品在Ficoll Hypaque上分層，或使Ficoll在被稀釋的樣品之下分層。
5.在關閉剎車的情況下，在室溫下以1200×g離心20分鐘。
6.從Ficoll血漿界面移出富集的細胞。
7.用5-10×體積的PBS+2％FBS洗滌富集的細胞。
注意為了富集單核細胞和其他粘附細胞，向全血樣品和所有洗滌/稀釋溶液中加入1mM EDTA。
1.每5mL血液和混合物加入1mL 6％羥乙基淀粉鹽水溶液。
2.向全血中加入實施例1中描述的抗體組合物，使得每種抗-具核細胞抗體的終濃度為1.0-2.0μg/mL。
3.在室溫下溫育10分鐘。
4.在室溫下以50×g離心5分鐘。
5.取出上清液。該級分中含有富集的細胞。
6.用2-5×體積的PBS+2％胎牛血清(FBS)洗滌富集的細胞級分。
1.每5mL血液和混合物中加入1mL 6％羥乙基淀粉鹽水溶液。
2.加入0.6mL的60％w/v碘克沙醇和混合物。碘克沙醇是許多可略微增加水溶液密度的化合物之一。
3.向全血中加入實施例1中描述的抗體組合物，使每種抗-具核細胞抗體的終濃度為1.0-2.0μg/mL。
4.在室溫下溫育10分鐘。
5.在室溫下以50×g離心5分鐘。
6.移出上清液。該級分中含有富集的細胞。
7.用2-5×體積的PBS+2％FBS洗滌富集的細胞級分。
1.留出1mL血液。
2.將10mL血液在Ficoll-Paque上分層，并在室溫和關閉剎車的情況下，以1200×g離心20分鐘。
3.回收Ficoll血漿界面上的MNC層，用PBS+2％FBS洗滌。
4.計數細胞，并以1×108/mL重懸浮。
5.測量樣品體積，稱為體積A。
6.加入0.2mL來自步驟1的保留血液。
7.用PBS+2％FBS使總體積達到體積A的兩倍。
8.以1.0μg/mL的終濃度加入對特定抗原特異的四聚抗體復合物，其合成在實施例1中描述。
9.在室溫下溫育20分鐘。
10.用PBS+2％FBS稀釋兩倍，并在以1.085g/mL的密度和280mOsm摩爾滲透壓濃度制備的Percoll上分層。
11.如步驟2以1200×g離心20分鐘。
12.棄去上清液，重懸浮包含富集細胞的沉淀。
13.用氯化銨溶液裂解紅細胞，并用PBS+2％FBS洗滌。實施例6T細胞的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成該實施例說明利用實施例2中描述的方法從全外周血中富集T細胞。制備了含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的T細胞富集雞尾酒。結果(顯示在表4中)證明本發明的方法可產生95％的T細胞純度，回收率接近50％。
該實施例說明利用實施例2中描述的方法從全外周血中富集B細胞。制備了四聚抗體復合物的兩種B細胞富集雞尾酒。一種雞尾酒含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56的抗體。另一種雞尾酒含有抗CD2、CD3、CD16、CD36、CD56和IgE的抗體。結果(顯示在表7中)證明，本發明的方法導致88％的B細胞純度和43％的回收率，向富集雞尾酒中加入抗-IgE可提高B細胞的純度。
結果(顯示在表9中)證明，對于廣泛先祖富集雞尾酒，本發明的方法導致29％的CD34+細胞純度和53％的回收率，而對于四種抗體減量雞尾酒只導致5％的純度和45％的回收率。
制備含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的T細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致95％以上的T細胞純度和60％回收率。
制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的B細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致75％的B細胞純度和39％的回收率。
制備含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗體的四聚抗體復合物的NK細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致65％的NK細胞純度和27％的回收率。
制備含有抗CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的T細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致95％的T細胞純度和61％的回收率。
制備含有抗CD8、CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的CD4+T細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致89％的CD4+細胞純度和64％的回收率。
制備含有抗CD4、CD16、CD19、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的CD8+T細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致80％的CD8+T細胞純度和43％的回收率。
制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體的四聚抗體復合物的B細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致84％的B細胞純度和58％的回收率。
制備含有抗CD3、CD4、CD19、CD36和CD66b抗體的四聚抗體復合物的NK細胞富集雞尾酒。本發明的方法導致80％的NK細胞純度和50％的回收率。
該實施例證明，用不同基質代替步驟4中的Ficoll-Hypaque能改進實施例2的方法。Ficoll的密度是1.077g/mL，而摩爾滲透壓濃度約為300mOsm。Percoll和碘克沙醇溶液制備為1.085g/mL密度和280mOsm的摩爾滲透壓濃度。制備含有抗CD2、CD3、CD16、CD36和CD56抗體復合物的A B細胞富集雞尾酒。
兩種不同樣品的B細胞富集結果(顯示在表15中)證明，以較高密度使用不同的分層基質能提高B細胞的回收率而不降低B細胞純度。
該實施例說明利用實施例2中描述的方法從貯存(48小時)的全外周血中去除粒細胞。制備含有抗CD66b的四聚抗體復合物的粒細胞排除雞尾酒。表17顯示的結果證明，本發明的方法導致1.8-2.6log的粒細胞排除。
雖然參照目前認為是優選的實施例描述了本發明，但應當理解，本發明不限于所公開的實施例。相反，本發明旨在覆蓋在附加權利要求書的精神和范圍內包括的多種修改和相當的安排。
所有公開文本、專利和專利申請書在此完整引用作為參考，每個公開文本、專利和專利申請書特別、分別地引用作為參考。
表1在細胞分離中使用的抗體
表2免疫玫瑰花結用于人細胞負選擇的抗體雞尾酒T細胞富集抗-CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息T細胞富集抗-HLA-DR和/或CD25、CD69CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41γδT細胞富集抗-αβTCRCD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41αβT細胞富集抗-γδTCRCD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD4+T細胞富集抗-CD8CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41幼稚CD4+T細胞富集抗-CD8CD45RO和/或CD29CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41記憶CD4+T細胞富集抗-CD8CD45RACD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息CD4+T細胞富集抗-CD8HLA-DR和/或CD25、CD69CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD4+αβT細胞富集抗-γδTCRCD8CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41TH1 CD4+T細胞富集抗-CD8CD124CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41TH2 CD4+T細胞富集抗-CD8CCR5CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20，CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD8+T細胞富集抗-CD4CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41幼稚CD8+T細胞富集抗-CD4CD45RO和/或CD29CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41記憶CD8+T細胞富集抗-CD4CD45RACD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41靜息CD8+T細胞富集抗-CD4HLA-DR和/或CD25、CD69、CD27CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41CD8+αβT細胞富集抗-γδTCRCD4CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24、IgCD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、IgE、CD41B細胞富集抗-CD2和/或CD3、CD4和CD8兩者CD16和/或CD66b、CD11b、CD15CD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD56、CD41NK細胞富集抗-CD3CD66b和/或CD15CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24CD36和/或CD14和任選的抗-CD33、CD4、IgE、CD41單核細胞富集抗-CD2和/或CD3、CD5CD19和/或CD20、CD21、CD22、CD24CD66b和/或CD16和任選的抗-CD8、CD56樹突細胞富集抗-CD3CD14CD16CD19CD34CD56CD66b嗜堿性粒細胞富集抗-CD2CD3CD14CD15CD16CD19CD24CD34CD36CD56CD45RA先祖細胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14和任選的抗-CD56、CD10、CD45RA、CD38、CD36、CD33、CD71紅系先祖細胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD45RACD33CD10和任選的抗-CD56髓祖細胞富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD71CD10和任選的抗-CD56巨核細胞先祖富集抗-CD2和/或CD3CD16和/或CD66bCD19和/或CD24CD14CD45RACD10和任選的抗-CD56上皮腫瘤細胞富集抗-CD45CD66b和任選的CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD36、CD38、CD56、CD66e表3可識別在上皮腫瘤細胞上表達的非造血抗原的抗體
表4T細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝％CD3+細胞回收率＝CD3+細胞的回收率表5CD8+T細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝％CD8+細胞回收率＝CD8+細胞的％回收率*n＝4表6CD4+T細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝％CD4+細胞回收率＝CD4+細胞的％回收率*n＝5表7B細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝％CD19+細胞回收率＝CD19+細胞的％回收率表8NK細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝％CD56+細胞回收率＝CD56+細胞的％回收率表9CD34+細胞從全臍帶血的富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
純度＝％CD34+細胞回收率＝CD34+細胞的％回收率SD＝平均值的標準差表10單核細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
純度＝CD14+細胞的％純度回收率＝CD14+細胞的％回收率表11腫瘤富集雞尾酒的抗體組成
表12CAMA乳癌細胞從全血中的富集
表13T細胞富集——利用Ficoll的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝CD3+細胞的％純度回收率＝CD3+細胞的％回收率表14利用羥乙基淀粉/碘克沙醇混合物的免疫玫瑰花結形成
SD＝平均值的標準差純度＝希望的細胞型的％純度(T細胞＝CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞，B細胞＝CD19+細胞，NK細胞＝CD56+細胞)回收率＝希望的細胞之％回收率表15利用不同分層基質的免疫玫瑰花結形成B細胞富集
SE＝平均值的標準誤純度＝CD19+細胞的％純度回收率＝CD19+細胞的％回收率表16利用免疫玫瑰花結形成對乳癌細胞的凈化
表17從貯存的全外周血中去除粒細胞
免疫玫瑰花結形成＝實施例2中概述的方法，使用含有抗-CD66b的排除雞尾酒單獨的Ficoll＝不使用免疫玫瑰花結的標準Ficoll密度分離本說明書中引用參考文獻的全部引文1.Braun等人，N.Engl.J.Med.342525533.2.Brenner，M.B.，Trowbridge，I.S.，Strominger，J.L.，1985，Cell40183-190.3.De Lau，W.B.，Van Loon，A.E，Heije，K.，Valerio，D.，Bast，B.J，1989，J.Immunol. Methods，1171-8.4.deWynter， E.A.等人，1975，Stem Cells，Vol.13524-532.5.Firat等人，1988，Bone Marrow Transplantation，Vol.21933-938.6.Glennie，M.J.，McBride，H.M.，Worth，A.T.，Stevenson，G.T.，1987，J.Immunol.，1392367-2375.7.Holliger，P.，Prospero，T.，Winter，G.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448.8.Horrocks，C，M.Fairhurst和T.Thomas，1998.Blood.Vol.92，p.25A.9.Karawajew，L.，Micheel，B.，Behrsing，O.，Gaestel，M.，1987，J.Immunol.Methods 96265-270.10.Kostelny，S.A.，Cole，M.S.，Tso，J.Y.，1992，J.Immunol.1481547-1553.11.Kohler和Milstein，1975，Nature 256，495-497.12.Milstein，C.，Cuello，A.C.，1983，Nature，305537-540.13.Nolan，O.，Kennedy，O.R.，1990，Biochem.Biophys.Acta，10401-11.14.Perez等人，1985，Nature 316354.15.Rheinnecker等人，1996，J.Immunol.1572989-2997.16.Shpall，E.J.等人，1994，J.of Clinical Oncology 1228-36.17.Slaper-Cortenbach，Ineke C.M.，等人，1990，Exp.Hematol.1849-54.18.Staerz和Bevan，1986，PNAS(USA)831453.19.Staerz和Bevan，1986，Immunology Today，7241.20.Staerz等人，1985，Nature，314628.21.Thomas，T.E.，1994，Cancer Research，Therapy and Control 4(2)119-128.22.Van Dijk，J.et al，1989，Int.J.Cancer 44738-743.23.Vaughan等人，1990，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.99.24.Winter，G.，Milstein，C.，1991，Nature，349293-299.
權利要求
1.一種負選擇方法，用于從含有希望的細胞、紅細胞和不希望的細胞之樣品中富集并回收希望的細胞，其包括(1)在允許不希望的細胞與紅細胞可形成免疫玫瑰花結的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接；和(2)從樣品中分離免疫玫瑰花結，獲得富含希望的細胞的樣品。
2.根據權利要求1的方法，其中在步驟(2)中通過密度分離法分離免疫玫瑰花結。
3.根據權利要求1的方法，其中在步驟(2)中通過沉淀法分離免疫玫瑰花結。
4.根據權利要求1的方法，用于單核細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD5；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(3)CD66b和/或CD16結合的抗體。
5.根據權利要求4的方法，其中抗體(a)還包含CD56和/或CD8。
6.根據權利要求1的方法，用于B細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD4和CD8兩者；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；和(3)CD36和/或CD14結合的抗體。
7.根據權利要求6的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
8.根據權利要求1的方法，用于T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14結合的抗體。
9.根據權利要求8的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
10.根據權利要求1的方法，用于CD4+T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD8；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
11.根據權利要求10的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
12.根據權利要求1的方法，用于CD8+T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD4；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
13.根據權利要求12的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
14.根據權利要求1的方法，用于NK細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD66b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
15.根據權利要求14的方法，其中抗體(a)還包含CD4。
16.根據權利要求1的方法，用于嗜堿性粒細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD2；(3)CD14；(4)CD15；(5)CD16；(6)CD19；(7)CD24；(8)CD34；(9)CD36；(10)CD56和(11)CD45RA結合的抗體。
17.根據權利要求1的方法，用于樹突細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD14；(3)CD16；(4)CD19；(5)CD34；(6)CD56和(7)CD66b結合的抗體。
18.根據權利要求1的方法，用于造血先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14結合的抗體。
19.根據權利要求18的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
20.根據權利要求1的方法，用于類紅細胞先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD33和(7)CD10結合的抗體。
21.根據權利要求20的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
22.根據權利要求1的方法，用于髓先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD71；和(6)CD10結合的抗體。
23.根據權利要求22的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
24.根據權利要求1的方法，用于巨核細胞先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD10結合的抗體。
25.根據權利要求24的方法，其中抗體(a)還包含CD56。
26.根據權利要求1的方法，用于非造血腫瘤細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結合的抗體。
27.根據權利要求26的方法，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
28.根據權利要求1的方法，用于上皮腫瘤細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結合的抗體。
29.根據權利要求28的方法，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
30.根據權利要求1的方法，用于從包含粒細胞的樣品中富集和回收單核細胞，其中抗體(a)包含能與抗原CD66b或CD66abce結合的抗體。
31.根據權利要求30的方法，其中樣品是貯存的全血或臍帶血。
32.根據權利要求31的方法，其中樣品中粒細胞的密度低于新鮮全血的粒細胞密度。
33.根據權利要求1的方法，其中抗體組合物含有四聚抗體復合物，其中含有(a)一種可與不希望的細胞上的抗原結合的抗體；和(b)一種可與紅細胞結合的抗體；和(c)可與(a)和(b)所述抗體的Fc片段結合的兩種抗體，其中(a)和(b)中的抗體來自相同動物種，(c)中的抗體與(a)和(b)中的抗體來自不同動物種。
34.一種抗體組合物，用于從含有希望的細胞、紅細胞和不希望的細胞之樣品中富集和回收希望的細胞，其中含有(a)至少一種抗體，其可與不希望的細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接。
35.根據權利要求34的組合物，用于單核細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD5；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(3)CD66b和/或CD16結合的抗體。
36.根據權利要求35的組合物，其中抗體(a)還包含CD56和/或CD8。
37.根據權利要求34的組合物，用于B細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3和/或CD4和CD8兩者；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；和(3)CD36和/或CD14結合的抗體。
38.根據權利要求37的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
39.根據權利要求34的組合物，用于T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(2)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(3)CD36和/或CD14結合的抗體。
40.根據權利要求39的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
41.根據權利要求34的組合物，用于CD4+T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD8；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
42.根據權利要求41的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
43.根據權利要求34的組合物，用于CD8+T細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD4；(2)CD16和/或CD66b和/或CD11b和/或CD15；(3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24和/或Ig；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
44.根據權利要求43的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
45.根據權利要求34的組合物，用于NK細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD66b和/或CD15； (3)CD19和/或CD20和/或CD21和/或CD22和/或CD24；和(4)CD36和/或CD14結合的抗體。
46.根據權利要求45的組合物，其中抗體(a)還包含CD4。
47.根據權利要求34的組合物，用于嗜堿性粒細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD2；(3)CD14；(4)CD15；(5)CD16；(6)CD19；(7)CD24；(8)CD34；(9)CD36；(10)CD56和(11)CD45RA結合的抗體。
48.根據權利要求34的組合物，用于樹突細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD3；(2)CD14；(3)CD16；(4)CD19；(5)CD34；(6)CD56和(7)CD66b結合的抗體。
49.根據權利要求34的組合物，用于造血先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14結合的抗體。
50.根據權利要求49的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
51.根據權利要求34的組合物，用于類紅細胞先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；(6)CD33；和(7)CD10結合的抗體。
52.根據權利要求51的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
53.根據權利要求34的組合物，用于髓先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；(4)CD14；(5)CD71；(6)CD10結合的抗體。
54.根據權利要求53的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
55.根據權利要求34的組合物，用于巨核先祖細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD2和/或CD3；(2)CD16和/或CD66b；(3)CD19和/或CD24；和(4)CD14；(5)CD45RA；和(6)CD10結合的抗體。
56.根據權利要求55的組合物，其中抗體(a)還包含CD56。
57.根據權利要求34的組合物，用于非造血腫瘤細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結合的抗體。
58.根據權利要求57的組合物，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
59.根據權利要求34的組合物，用于上皮腫瘤細胞的富集和回收，其中抗體(a)包含能與抗原(1)CD45和(2)CD66b結合的抗體。
60.根據權利要求59的組合物，其中抗體(a)還包含CD2、CD16、CD19、CD36和CD38。
61.根據權利要求34的組合物，用于從含有粒細胞的樣品中富集和回收單核細胞，其中抗體(a)含有能與抗原CD66b或CD66abce結合的抗體。
62.一種從含有具核細胞和紅細胞的樣品中分離具核細胞的方法，包括(1)在允許具核細胞與紅細胞形成免疫玫瑰花結的條件下，使樣品接觸一種抗體組合物，后者含有(a)至少一種抗體，其可與待分離的具核細胞上的抗原結合，該抗體與(b)至少一種可與紅細胞結合的抗體直接或間接地連接；和(2)將免疫玫瑰花結與剩余樣品分離。
63.根據權利要求62的方法，其中抗體組合物含有一種雙功能抗體，其中可與具核細胞結合的抗體與可與紅細胞結合的抗體直接連接。
64.根據權利要求62的方法，其中抗體組合物含有四聚抗體復合物，其中含有(a)一種可與具核細胞上的抗原結合的抗體；和(b)一種可與紅細胞結合的抗體；和(c)可與(a)和(b)所述抗體的Fc片段結合的兩種抗體，其中(a)和(b)中的抗體來自相同動物種，(c)中的抗體與(a)和(b)中的抗體來自不同動物種。
65.根據權利要求62的方法，其中具核細胞選自T細胞、B細胞、NK細胞、樹突細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞、樹突細胞、漿細胞、肥大細胞、造血先祖細胞、造血干細胞、先祖細胞和腫瘤細胞。
66.根據權利要求62的方法，其中可與紅細胞結合的抗體是抗血型糖蛋白A。
67.根據權利要求62的方法，其還包括(3)裂解免疫玫瑰花結中的紅細胞，以分離細胞。
全文摘要
本發明涉及利用免疫玫瑰花結分離細胞的方法。該方法包括使含有具核細胞和紅細胞的樣品接觸一種可使具核細胞與紅細胞形成免疫玫瑰花結的抗體組合物。該抗體組合物優選地含有雙功能抗體或四聚抗體復合物。
文檔編號C07K16/28GK1367876SQ00809750
公開日2002年9月4日 申請日期2000年5月26日 優先權日1999年5月28日
發明者T·E·托馬斯, C·皮特斯, P·蘭斯卓普 申請人:干細胞技術公司