專利名稱：從血液中分離免疫細胞的方法及其在治療疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及從血液中分離免疫細胞的方法及其在治療疾病中的應用，具體涉及從健康人體的血液中分離免疫細胞并凍存，以及在出現免疫低下或發生疾病癥狀時，將免疫細胞進行體外擴增并施用于患者進行免疫細胞治療的方法。
背景技術：
免疫細胞(immune cell)是白細胞的俗稱，包括淋巴細胞和各種吞噬細胞，也特指能識別抗原、產生特異性免疫應答的淋巴細胞。淋巴細胞是免疫系統的基本成分，在體內分布很廣泛。研究發現血液中蘊含豐富的淋巴細胞，由于這類細胞具有免疫調控和自我復制等特點，所以一直受到人們的關注。淋巴細胞具有自然殺傷和自我保護的特性，針對病毒、細菌、真菌感染的治療均起到關鍵的作用，在癌癥的治療中具有很大的臨床應用價值。
免疫細胞在健康人體的血液中蘊含豐富，但由于年齡老化、亞健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫細胞數目會顯著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫細胞移植給患者則可能引起免疫排斥反應；提取免疫細胞過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了免疫細胞的臨床應用，使得尋找一種穩定可靠的免疫細胞獲取來源成為一個重要的問題。研究顯示，健康人的新鮮血液中含有大量有效的免疫細胞并且能有效分離，這種組織來源的免疫細胞不僅保持了免疫細胞的特異性免疫應答的生物學特性，而且分離出來的免疫細胞具有原始的、強勁的增殖能力，同時還易于冷凍保存和復蘇。由于免疫細胞起源于自身，大大減低了觸發免疫反應及引起移植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對健康的被采集者無任何危害及損傷。以上原因足以令從血液中分離免疫細胞成為獲得免疫細胞的有效途徑。但是，目前關于血液免疫細胞的分離和擴增方法不一，且大多步驟復雜，獲得較多數量血液免疫細胞也存在一定困難，同時患者在罹患疾病時采集血液存在一定風險。因此，本領域需要有從血液中分離、保存和擴增免疫細胞的簡單、有效的方法，以滿足醫藥、科研、臨床應用等領域的需求。
發明內容
本發明的目的是解決現有技術提取、凍存、復蘇血液免疫細胞方法的缺陷，提供一種簡單有效的血液免疫細胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復蘇的方法，以及復蘇后免疫細胞擴增的方法。本發明發現使用特定操作步驟的提取、凍存、復蘇以及擴增，可以有效地獲得免疫細胞。本發明基于此發現而得以完成。因此，本發明第一方面提供了從健康哺乳動物的新鮮血液中獲取免疫細胞的方法，該方法包括以下分離步驟(a)全血樣本預處理將血樣本充分混勻，轉移至離心容器中，稀釋血液；(b) FicolI法分離取離心容器，加入Ficoll細胞分離液，然后將稀釋后的血液樣本加入Ficoll細胞分離液的上層，將離心容器置于離心裝置中，離心處理；(C)單個核細胞(在本文中可用縮寫MNC表示)收集和洗滌離心處理結束后，將上層血漿轉移至離心容器，吸取白膜層于離心容器內，補充生理鹽水，混勻后再次離心處理，待細胞沉淀后洗滌兩次，得到免疫細胞；以及任選的下列步驟(d)針對步驟(C)所得免疫細胞，檢測以下項目的至少一項單個核細胞總數、單個核細胞活率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據本發明第一方面的方法，該方法還包括以下對提取的免疫細胞進行凍存的步驟(e)單個核細胞凍存向步驟(C)提取的免疫細胞中加入凍存液，重懸免疫細胞，將免疫細胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲存； 以及任選的下列步驟(f)建立包含步驟以上信息的免疫細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(e)的凍存免疫細胞進行關聯。根據本發明第一方面的方法，該方法還包括以下對凍存的免疫細胞進行復蘇的步驟(g)細胞復蘇將步驟(e)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉移至生物安全柜中，將免疫細胞轉移至裝有培養基的離心容器中，重懸，混勻，補加培養基，離心洗滌；以及任選的下列步驟(h)針對步驟(g)所得復蘇的免疫細胞，檢測以下項目的至少一項單個核細胞總數、單個核細胞活率及復蘇率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據本發明第一方面的方法，該方法還包括以下對復蘇的免疫細胞進行擴增的步驟(i)細胞擴增用含有培養基和血清的細胞培養液對復蘇后的單個核細胞進行重懸培養，吸出細胞培養液，轉移至離心容器，反復吹洗貼壁細胞，直至貼壁細胞完全不被吹洗下來，獲得未成熟樹突狀細胞(iDC)，添加培養基重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)，將離心容器中的細胞培養液進行離心處理，獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，針對iDC細胞和CIK細胞進行細胞計數，再分別針對iDC細胞及CIK細胞進行培養。根據本發明第一方面的方法，在步驟(a)中，將血樣本充分混勻是將血袋上下顛倒2-8次實現的，優選4-5次。根據本發明第一方面的方法，其中所述離心容器是離心管。根據本發明第一方面的方法，其中所述步驟(a)的離心容器是50ml的離心管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉移至離心容器中的血液是按照150ml血量計算，每個離心容器裝有25ml血液，共裝6管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉移至離心容器中的血液留取5ml血樣于15ml離心容器中，用于血型檢測。根據本發明第一方面的方法，其中所述步驟(a)的稀釋血液是通過于離心容器中加入生理鹽水稀釋實現的，優選生理鹽水的加入量按照與離心管內血液體積比5 :1-1 5的比例加入稀釋，優選2 :1-1 2的比例加入稀釋，優選按照等體積I :1的比例加入稀釋，優選加入生理鹽水25ml進行等體積I :1稀釋。根據本發明第一方面的方法，在步驟(a)中，稀釋血液后用吸液管充分混勻，優選25ml移液管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(b)中，離心容器為50ml的離心管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(b)中，按照150ml血量計算，取12支50ml 離心管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(b)中，每個離心容器中加入Ficoll細胞分離液 5_25ml,優選 10-20ml,優選 15ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的稀釋后的血液樣本加入Ficoll細胞分離液的上層是通過移液管吸取血樣本沿傾斜的離心容器壁緩緩加入來實現的，優選移液管為25ml移液管。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(b)所述稀釋后的血液樣本的加入量為10-35ml，優選 15-30ml，優選 25ml。根據本發明第一方面的方法，在步驟(b)中，加入的Ficoll細胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為I :10-10 :1，優選2 :7-7 :2，優選3 :5-5 :3，例如3 :5。本發明人發現，Ficoll細胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為3 5是特別優選的，比之于按照該比例變化20%以上的比例加樣，能在加樣過程中有效避免沖散界面。根據本發明第一方面的方法，其中所述的離心處理是通過水平離心機實現的。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的離心處理是將加樣后的離心容器置于水平離心機內離心。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的離心處理是設置水平離心機升速為1，降速為0，轉速為1000-4000rpm，離心時間為10_40min，離心溫度為15_30°C，優選轉速為1500-3000rpm,優選轉速為2000rpm,優選離心時間為15_30min,優選離心時間為20min，優選離心溫度為20°C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(C)所述離心容器為50ml的離心管。根據本發明第一方面的方法，在步驟(C)中，每個離心容器內吸取約10_50ml的白膜層，優選約25-30ml。根據本發明第一方面的方法，在步驟(C)中，補充生理鹽水至總體積為30_50ml，優選45ml。根據本發明第一方面的方法，在步驟(C)中，所述混勻是通過旋緊離心容器的蓋子，將離心容器上下顛倒3-8次實現的，優選顛倒4-5次。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的離心處理是設置水平離心機升速為9，降速為9，轉速為1000-4000rpm，離心時間為5_20min，離心溫度為15_30°C，優選轉速為1500-3000rpm，優選轉速為2000rpm，優選離心時間為lOmin，優選離心溫度為20°C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的洗滌第一次是觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積30-50ml，優選40ml，用25ml移液管混勻，旋緊離心容器的蓋子，設置水平離心機升速為9，降速為9，轉速為1000-3000rpm，離心時間為5_15min，離心溫度為15_30°C，優選轉速為1200_2000rpm，優選轉速為1500rpm，優選離心時間為lOmin，優選離心溫度為20°C，離心處理。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的洗滌第二次是觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積30-50ml，優選40ml，用25ml移液管混勻，旋緊離心容器的蓋子，設置水平離心機升速為9，降速為9，轉速為1000-2000rpm,離心時間為5_15min,離心溫度為15-30°C,優選轉速為1200rpm,優選離心時間為lOmin，優選離心溫度為20°C，離心處理。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(d)所述的檢測單個核細胞總數和單個核細胞活率是向步驟(c)收集的細胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優選20ml，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數與活率，記錄結果。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無血清培養基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而·成的，優選X-VIVO無血清培養基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份，優選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。在一個實施方案中，凍存液中含有約50重量份的X-VIVO無血清培養基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液。本發明人發現，含有約50重量份的X-VIVO無血清培養基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液是特別優選的，比之于使該凍存液的任一成分含量變化10%以上的配方在提高冷凍效果、保護冷凍細胞等效果方面具有顯著優勢。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液配置10_20ml，優選15ml，放置于0-7 °C冰箱中備存，優選4 °C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的重懸免疫細胞是將步驟(C)獲得的細胞沉淀按照2X 105-2X 109/ml的密度用凍存液充分混勻，優選2 X 10Vml的密度。根據本發明第一方面的方法，其中所述的凍存容器為凍存管，優選2ml的凍存管。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的將免疫細胞加入凍存容器后，將凍存容器用封口膜封口，并標示免疫細胞的相關信息，優選標示免疫細胞來源的標簽。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的程序降溫是將凍存容器放入程序降溫裝置(優選程序降溫盒)中，放入0-7°C (優選4°C)冰箱中備用，轉移至-100°C至_40°C (優選_80°C )的冰箱中儲存20-36小時(優選24小時)，再將凍存容器從程序降溫裝置中取出。在一個實施方案中，凍存容器取出后，程序降溫裝置放入4°C冰箱以備下一次使用。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(e)所述凍存容器置于液氮罐中長期儲存，同時記錄樣本儲存的位置。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(g)所述水浴是將從液氮中取出的凍存容器迅速放入水浴裝置(優選水浴鍋)中實施的。在一個具體實施方式
中，所述水浴裝置的溫度在體溫附近，優選37°C。在一個具體實施方式
中，所述凍存容器在水浴裝置中反復震蕩5-15次，優選8-10次，震蕩時間控制在5min以內，優選控制在2min以內。在一個具體實施方式
中，直至看到凍存容器中只剩下一團冰晶后從水浴裝置中取出凍存容器。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(g)所述清洗凍存容器表面是用蘸有75%酒精的無塵布將凍存容器表面水滴擦拭。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(g)所述將免疫細胞轉移至裝有培養基的離心容器中、重懸和混勻的步驟是用Iml移液槍將凍存容器中復蘇后的免疫細胞迅速吸出轉移至裝有2-10ml (優選5ml) X-VIVO無血清培養基的10_20ml (優選15ml)離心容器中重懸，并用槍頭反復吹洗混勻2-8次(優選3-5次)。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(g)所述補加培養基是補加X-VIVO無血清培養基至5_15ml (優選IOml)。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(g)所述離心洗滌是設置水平離心機升速為9，降速為9，轉速為1000-3000rpm，離心時間為5_20min，離心溫度為15_30°C，優選轉速為1500-2500rpm,優選轉速為1800rpm,優選離心時間為IOmin,優選離心溫度為20°C。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(h)所述的檢測單個核細胞總數和單個核 細胞活率及復蘇率是向步驟(g)收集的細胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優選20ml，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數、活率及復蘇率，記錄結果。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細胞培養液為含有X-VIVO無血清培養基及10%的自體人血清。根據本發明第一方面的方法，其中步驟⑴所述重懸培養是將細胞密度為4X 104-4X IO8 (優選4 X IO6)的免疫細胞置于體溫條件下(優選37°C )，在2-10% (優選5%)的二氧化碳培養箱中孵育1-4小時(2小時)。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述轉移至離心容器為50ml離心管。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述貼壁細胞吹洗1-5遍，優選2-3遍。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)通過施加l_5ml的X-VIVO無血清培養基重懸，優選2_3ml。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)細胞計數為吸取20 μ I細胞,加入180 μ I臺盼蘭染液,充分混勻后加入計數板計算細胞總數和活率。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述未成熟樹突狀細胞(iDC)細胞計數為單個核細胞總數減去細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)總數。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述未成熟樹突狀細胞(iDC)的培養為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細胞介素4 (IL_4) 500U/ml ;第4天，半量換液；第5天，加入抗原負載；第6天，加入人腫瘤壞死因子a (TNF-a) 1000U/ml過夜；第7天，DC第一次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第9天，DC第二次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶llc、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第11天，DC第三次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第13天，DC第四次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量。根據本發明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的培養為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子INF-Y 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子CD3單抗375ng/ml、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIV0無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ；第8天，補加一倍含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK第一次收獲，計數，測定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8 等細胞表面抗原的表達量 ’第14 天，CIK 第二次收獲，計數，測定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8等細胞表面抗 原的表達量。根據本發明第一方面的方法，該方法包括以下步驟(a)全血樣本預處理上下顛倒血袋4-5次，將血樣本充分混勻,血液轉移至50ml離心管中，轉移至離心容器中的血液按照150ml血量計算，每個離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻；(b)Ficoll法分離按照150ml血量計算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細胞分離液上層，Ficoll細胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機內離心，水平離心機升速為1，降速為O,轉速為2000rpm,離心時間為20min，離心溫度為20°C ；(c)單個核細胞收集和洗滌離心結束后，將上層血漿轉移至50ml離心管內，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內，通常每管約25-30ml，補充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機升速為9，降速為9，轉速為2000rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1500rpm,離心時間為IOmin,離心溫度為200C ;第二次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1200rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ；(d)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數與活率，記錄結果。進一步地，可以包括以下對提取的免疫細胞進行凍存的步驟(e)單個核細胞凍存按照50%X_VIV0無血清培養基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細胞沉淀按照2X107/ml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細胞轉移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲存一個小時，轉移至_80°C冰箱儲存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉至液氮罐內進行儲存，同時程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲存；
(f)記錄步驟(e)的凍存樣本儲存的位置，建立免疫細胞的數據庫。進一步地，可以包括以下對凍存的免疫細胞進行復蘇的步驟(g)細胞復蘇從液氮罐中取出單個核細胞凍存管，迅速放入預先準備的37°C的水浴鍋中，反復振蕩8-10次，時間控制在2min以內，直至看到凍存管中只剩下一團冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復蘇后的免疫細胞迅速吸出轉移至一裝有5mlX-VIVO無血清培養基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復吹洗混勻3_5次，補加X-VIVO無血清培養基至IOml,離心洗漆,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1800rpm,離心時間為lOmin,尚心溫度為20 C ；(h)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加 入計數板計算細胞總數、活率及復蘇率；進一步地，可以包括以下對復蘇的免疫細胞進行擴增的步驟(i)細胞擴增用含有X-VIVO無血清培養基及10%的自體人血清的細胞培養液對復蘇后的單個核細胞進行重懸培養，細胞密度為4X IO6個細胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養箱中孵育2小時，2小時后，取出細胞培養瓶，將細胞培養液吸出，轉移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細胞用生理鹽水反復吹洗2-3遍，直至貼壁細胞完全不被吹洗下來，此時的細胞為未成熟樹突狀細胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養基重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)，將上述轉移至50ml的離心管中的細胞培養液進行離心，獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，吸取20 μ I細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)細胞總數和活率，單個核細胞總數減去細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)總數為未成熟樹突狀細胞(iDC)細胞計數，然后分別針對細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)和未成熟樹突狀細胞(iDC)進行細胞培養；優選未成熟樹突狀細胞(iDC)的培養步驟如下第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細胞介素4 (IL_4) 500U/ml ；第4天，半量換液；第5天，加入抗原負載；第6天,加入人腫瘤壞死因子a (TNF- a ) 1000U/ml過夜；第7天，DC第一次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第9天，DC第二次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第11天，DC第三次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第13天，0(第四次收獲，計數，測定0)80、0)86、0)83、0)11(3、!11^-01 等細胞表面
抗原的表達量；優選細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的培養步驟如下第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子 INF-y 1000U/ml ；第2天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子 CD3 單抗 375ng/ml、白細胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第8天，補加一倍含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第12 天，CIK 第一次收獲，計數，測定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等細胞表面抗原的表達量；
第14天，CIK第二次收獲，計數，測定⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+、⑶3+⑶56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等細胞表面抗原的表達量。此外，在本發明的第一方面，提供了對血液免疫細胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復蘇的方法，以及復蘇后免疫細胞擴增的方法。因此，本發明第二方面提供了一種免疫細胞。根據本發明第二方面的免疫細胞，其是根據本發明第一方面任一實施方案所述方法獲得的。根據本發明第二方面的免疫細胞，其細胞純度大于90%，例如大于95%。在一個實施方案中，所述免疫細胞經3代以上傳代后，細胞純度大于90%，例如大于95%。此外，在本發明的第二方面，提供了一種免疫細胞。因此，本發明第三方面提供了一種免疫細胞用于治療疾病的用途，同時提供了一種免疫細胞制備用于治療疾病的藥物中的用途。根據本發明第三方面的用途，其是根據本發明第一方面任一實施方案所述方法獲得的。根據本發明第三方面的用途，其疾病選自腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑色素瘤、間皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，優選腫瘤。此外，在本發明的第二方面，提供了一種免疫細胞。因此，本發明第四方面提供了一種免疫細胞用于非治療目的保健中的應用，同時提供了一種免疫細胞制備保健品中的用途。根據本發明第四方面的用途，其非治療目的保健是在出現免疫低下時提高免疫力。在本發明中，如未特別另外地說明，％表示重量/重量的百分數。下面對本發明作進一步的說明。本發明所引用的文獻，以及該文獻中所引用的文獻，它們的全部內容通過弓I用并入本文。在本發明中，本發明任一方面的任一技術方案中，其任一技術特征同樣適用于本發明的任一方面的任一實施方案，只要它們不會引起矛盾，并且這種相互適用在必要時可以作適當的修改。
圖I為細胞凍存過程的流程圖的示意圖。圖2為細胞凍存步驟的流程圖的示意圖。圖3為細胞復蘇擴增步驟的流程圖。圖4為張三細胞培養測試圖。圖5為李四細胞培養測試圖。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發明進行進一步的描述，然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業人員能夠理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作盡可能詳細的描述。實施例I、免疫細胞提取和凍存的方法免疫細胞提取方法包括以下步驟(I)全血樣本預處理上下顛倒血袋4-5次,將血樣本充分混勻,血液轉移至50ml 離心管中，轉移至離心容器中的血液按照150ml血量計算，每個離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻；(2)Ficoll法分離按照150ml血量計算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細胞分離液上層，Ficoll細胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機內離心，水平離心機升速為1，降速為O,轉速為2000rpm,離心時間為20min，離心溫度為20°C ；(3)單個核細胞收集和洗滌離心結束后，將上層血漿轉移至50ml離心管內，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內，通常每管約25-30ml，補充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機升速為9，降速為9，轉速為2000rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1500rpm,離心時間為IOmin,離心溫度為200C ;第二次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1200rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ；(4)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數與活率，記錄結果。與提取方法配套使用的凍存方法包括以下步驟(5)單個核細胞凍存按照50%X_VIV0無血清培養基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細胞沉淀按照IXlOVml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細胞轉移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲存一個小時，轉移至_80°C冰箱儲存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉至液氮罐內進行儲存，同時程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲存；(6)記錄步驟(5)的凍存樣本儲存的位置，建立免疫細胞的數據庫。志愿者張三(化名)，年齡42歲，性別男，采血量150ml。步驟(4)計算得到單個核細胞收集總量3. 20 X IO8個細胞，折合成IOOml血量計算為2. 13 X IO8個細胞。步驟(5)凍存管數為18管，其中至少有9管是按照IXlOVml的密度凍存。實施例2、免疫細胞提取和凍存的方法參考實施例I的方法進行。志愿者李四(化名)，年齡41歲，性別女，采血量115ml。步驟(4)計算得到單個核細胞收集總量I. 40 X IO8個細胞，折合成IOOml血量計算
為I. 22 X IO8個細胞。步驟(5)凍存管數為12管，其中至少有7管是按照lX107/ml的密度凍存。實施例3、免疫細胞提取和凍存的方法參考實施例I的方法進行。志愿者王五(化名)，年齡33歲，性別男，采血量120ml。步驟(4)計算得到單個核細胞收集總量I. 69 X IO8個細胞，折合成IOOml血量計算為I. 41 X IO8個細胞。步驟(5)凍存管數為14管，其中至少有2管是按照5 X 106/ml的密度凍存，至少有3管是按照I X IOVml的密度凍存，其中至少有2管是按照2 X 10Vml的密度凍存。實施例4、免疫細胞提取和凍存的方法參考實施例I的方法進行。志愿者孫六(化名)，年齡63歲，性別女，采血量135ml。步驟(4)計算得到單個核細胞收集總量2. 44X IO8個細胞，折合成IOOml血量計算為I. 81 X IO8個細胞。步驟(5)凍存管數為16管。根據實施例1-4可以得出以下結論I.年齡在30-60歲之間的健康人群，IOOml的采血量都可以獲取MNC在I X IO8個細胞以上，符合要求；2.健康人群的MNC在性別選擇上沒有顯著性差異。實施例5、免疫細胞復蘇的方法凍存后免疫細胞復蘇的方法包括以下步驟(7)細胞復蘇從液氮罐中取出單個核細胞凍存管，迅速放入預先準備的37°C的水浴鍋中，反復振蕩8-10次，時間控制在2min以內，直至看到凍存管中只剩下一團冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復蘇后的免疫細胞迅速吸出轉移至一裝有5mlX-VIVO無血清培養基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復吹洗混勻3_5次，補加X-VIVO無血清培養基至IOml,離心洗漆,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1800rpm,離心時間為lOmin,尚心溫度為20 C ；(8)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數、活率及復蘇率；志愿者張三(化名)，凍存密度為IXlOVml的凍存免疫細胞復蘇9管，細胞數量為1.6X108，復蘇后細胞數量為7.4X107，復蘇率為66%。實施例6、免疫細胞復蘇的方法參考實施例5的方法進行。志愿者李四(化名)，凍存密度為I X IOVml的凍存免疫細胞復蘇7管，細胞數量為7. 9 X IO7,復蘇后細胞數量為5. 5 X IO7,復蘇率為70%。實施例7、免疫細胞復蘇的方法參考實施例5的方法進行。志愿者王五(化名)，凍存密度為5 X 106/ml的凍存免疫細胞復蘇2管，細胞數量為I. 52 X IO7,復蘇后細胞數量為9. 52 X IO6,復蘇率為62%。實施例8、免疫細胞復蘇的方法參考實施例5的方法進行。志愿者王五(化名)，凍存密度為I X 107/ml的凍存免疫細胞復蘇3管，細胞數量為4. 57 X IO7,復蘇后細胞數量為3. 42 X IO7,復蘇率為75%。·實施例9、免疫細胞復蘇的方法參考實施例5的方法進行。志愿者王五(化名)，凍存密度為2X IOVml的凍存免疫細胞復蘇2管，細胞數量為6. I X IO7,復蘇后細胞數量為5. 16 X IO7,復蘇率為85%。根據實施例5-9可以得出結論以2X IO7凍存密度保存的免疫細胞復蘇率是最高的。實施例10、復蘇后免疫細胞擴增的方法復蘇后免疫細胞擴增的方法包括以下步驟(9)細胞擴增用含有X-VIVO無血清培養基及10%的自體人血清的細胞培養液對復蘇后的單個核細胞進行重懸培養，細胞密度為4X IO6個細胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養箱中孵育2小時；2小時后，取出細胞培養瓶，將細胞培養液吸出，轉移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細胞用生理鹽水反復吹洗2-3遍，直至貼壁細胞完全不被吹洗下來，此時的細胞為未成熟樹突狀細胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養基重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)；將上述轉移至50ml的離心管中的細胞培養液進行離心，獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)；吸取20 μ I細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)細胞總數和活率，單個核細胞總數減去細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)總數為未成熟樹突狀細胞(iDC)細胞計數；未成熟樹突狀細胞(iDC)的培養為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、粒細胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細胞介素4 (IL-4) 500U/ml ;第4天，半量換液；第5天，加入抗原負載；第6天，加入人腫瘤壞死因子a (TNF- a ) 1000U/ml 過夜；第 7 天，DC 第一次收獲，計數，測定 CD80、CD86、CD83、CDllc,HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第9天，DC第二次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第11天，DC第三次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；第13天，DC第四次收獲，計數，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細胞表面抗原的表達量；細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)的培養為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子INF-Y 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液及細胞因子CD3單抗375ng/ml、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIVO無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第8天，補加一倍含有X-VIV0無血清培養基及10%自體人血清的細胞培養液、白細胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK 第一次收獲，計數，測定 CD3+、 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等細胞表面抗原的表達量 ’第14天，CIK第二次收獲，計數，測定⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等細胞表面抗原的表達量。擴增結果在100X顯微鏡下拍攝圖片，見圖4。志愿者張三(化名)的免疫細胞擴增，在第8天細胞開始增殖，克隆球明顯，視野中仍有少許血小板(見圖4a)，故在此換液，吹散克隆球，繼續培養；在第10天細胞克隆明顯增大，細胞已經有活化現象，視野清亮，血小板較少(見圖4b)，此后繼續加液即可。實施例U、復蘇后免疫細胞擴增的方法參考實施例10的方法進行。擴增結果在100X顯微鏡下拍攝圖片，見圖5。志愿者李四(化名)的免疫細胞擴增，在第8天細胞開始增殖，克隆球明顯，視野中仍有少許血小板(見圖5a)，故在此換液，吹散克隆球，繼續培養；在第10天細胞克隆明顯增大，細胞已經有活化現象，視野清亮，血小板較少(見圖5b)，此后繼續加液即可。實施例12、復蘇后免疫細胞的藥效實驗生物分布通過生物分布分析來評價體內靶向性能。通過在10至12周齡的Balb/c雌性裸鼠體內皮下注射IO7個MDA-MB-231人乳癌細胞來獲得荷瘤小鼠(Charles RiverLabor atories)。當可明顯觸及腫瘤時將小鼠分組(n ^ 5)并在生物分布8天、24h或2h之前，將復蘇擴增的免疫細胞進行放射性碘化并注射到所有小鼠的側向尾靜脈中。在注射后24小時處死小鼠(12. 5 μ g，3. 3 μ Ci/小鼠)。對器官進行稱重并用Packard Cobra伽瑪計數器讀出其放射性。代表性器官的放射性含量被表示為每克組織注射劑量的百分比ID/g)。這些實驗的結果表明，凍存、復蘇和擴增不會削弱免疫細胞的腫瘤靶向作用。治療過在10至12周齡的Balb/c雌性裸鼠體內皮下注射2X IO7個MDA-MB-231人乳癌細胞來獲得荷瘤小鼠(Charles River Laboratories)。在腫瘤細胞植入9天后，當可明顯觸及腫瘤時將小鼠分組(η = 5)并在側向尾靜脈通過靜脈注射鹽水和復蘇擴增后的免疫細胞。每天監測小鼠并且每周用測徑器測量三次腫瘤生長，利用以下公式計算體積體積=長度X寬度2X0. 5。當腫瘤達到體積> 2000mm3或當腫瘤壞死時，將動物處死。腫瘤的尺寸由平均值土 SE表不。在植入到裸鼠體內的MDA-MB231人乳癌模型中觀察到復蘇擴增后的免疫細胞具有抑制腫瘤的活性。
權利要求
1.從血液中提取免疫細胞的方法，該方法包括以下分離步驟 (1)全血樣本預處理將血樣本充分混勻，轉移至離心容器中，稀釋血液； (2)FicolI法分離取離心容器，加入FicolI細胞分離液，然后將稀釋后的血液樣本加AFicoll細胞分離液的上層，將離心容器置于離心裝置中，離心處理； (3)單個核細胞收集和洗滌離心處理結束后，將上層血漿轉移至離心容器，吸取白膜層于離心容器內，補充生理鹽水，混勻后再次離心處理，待細胞沉淀后洗滌兩次； 以及任選的下列步驟 (4)針對步驟(3)所得免疫細胞，檢測以下項目的至少一項單個核細胞總數、單個核細胞活率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
2.根據權利要求I的方法，其中步驟(2)加入的Ficoll細胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為I :10-10 :1，優選2 :7-7 :2，優選3 :5_5 :3。
3.針對權利要求I提取的免疫細胞進行凍存的方法，該方法包括以下步驟 (5)單個核細胞凍存向步驟(3)提取的免疫細胞中加入凍存液，重懸免疫細胞，將免疫細胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲存； 以及任選的下列步驟 (6)建立包含步驟以上信息的免疫細胞的數據庫，并使該數據庫與步驟(5)的凍存免疫細胞進行關聯。
4.根據權利要求3的方法，其中步驟(5)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無血清培養基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，優選X-VIVO無血清培養基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份,優選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。
5.針對權利要求3凍存的免疫細胞進行復蘇的方法，該方法包括以下步驟 (7)細胞復蘇將步驟(5)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉移至生物安全柜中，將免疫細胞轉移至裝有培養基的離心容器中，重懸，混勻，補加培養基，離心洗滌； 以及任選的下列步驟 (8)針對步驟(7)所得復蘇的免疫細胞，檢測以下項目的至少一項單個核細胞總數、單個核細胞活率及復蘇率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
6.針對權利要求5復蘇的免疫細胞進行擴增的方法，該方法包括以下步驟 (9)用含有培養基和血清的細胞培養液對復蘇后的單個核細胞進行重懸培養，吸出細胞培養液，轉移至離心容器，反復吹洗貼壁細胞，直至貼壁細胞完全不被吹洗下來，獲得未成熟樹突狀細胞(iDC)，添加培養基重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)，將離心容器中的細胞培養液進行離心處理，獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，針對iDC細胞和CIK細胞進行細胞計數，再分別針對iDC細胞及CIK細胞進行培養。
7.根據權利要求I的方法，該方法包括以下步驟 (I)全血樣本預處理上下顛倒血袋4-5次,將血樣本充分混勻,血液轉移至50ml離心管中，轉移至離心容器中的血液按照150ml血量計算，每個離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻； (2)Ficoll法分離按照150ml血量計算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細胞分離液上層，Ficoll細胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機內離心，水平離心機升速為1，降速為0，轉速為2000rpm，離心時間為20min，離心溫度為20°C ； (3)單個核細胞收集和洗滌離心結束后，將上層血漿轉移至50ml離心管內，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內，通常每管約25-30ml，補充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機升速為9，降速為9，轉速為2000rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心，水平離心機升速為9，降速為9，轉速為1500rpm，離心時間為lOmin，離心溫度為20°C ’第二次洗滌，觀察細胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細胞沉淀，補充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1200rpm,離心時間為IOmin,離心溫度為20°C ； (4)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數與活率，記錄結果； 進一步地，可以包括以下對提取的免疫細胞進行凍存的步驟 (5)單個核細胞凍存按照50%X-VIV0無血清培養基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細胞沉淀按照2X IOVml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細胞轉移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲存一個小時，轉移至_80°C冰箱儲存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉至液氮罐內進行儲存，同時程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲存； (6)記錄步驟(5)的凍存樣本儲存的位置，建立免疫細胞的數據庫； 進一步地，可以包括以下對凍存的免疫細胞進行復蘇的步驟 (7)細胞復蘇從液氮罐中取出單個核細胞凍存管，迅速放入預先準備的37°C的水浴鍋中，反復振蕩8-10次，時間控制在2min以內，直至看到凍存管中只剩下一團冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復蘇后的免疫細胞迅速吸出轉移至一裝有5ml X-VIVO無血清培養基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復吹洗混勻3-5次，補加X-VIVO無血清培養基至IOml,離心洗漆,水平離心機升速為9,降速為9,轉速為1800rpm,離心時間為IOmin,離心溫度為20°C ； (8)單個核細胞計數重懸，于細胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復吹吸細胞，充分混勻；細胞計數，吸取20 μ I細胞，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞總數、活率及復蘇率； 進一步地，可以包括以下對復蘇的免疫細胞進行擴增的步驟 (9)細胞擴增用含有X-VIVO無血清培養基及10%的自體人血清的細胞培養液對復蘇后的單個核細胞進行重懸培養，細胞密度為4X IO6個細胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養箱中孵育2小時，2小時后，取出細胞培養瓶，將細胞培養液吸出，轉移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細胞用生理鹽水反復吹洗2-3遍，直至貼壁細胞完全不被吹洗下來，此時的細胞為未成熟樹突狀細胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養基重懸未成熟樹突狀細胞(iDC)，將上述轉移至50ml的離心管中的細胞培養液進行離心，獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，吸取20 μ I細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)，加入180 μ I臺盼藍染液，充分混勻后加入計數板計算細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)細胞總數和活率，單個核細胞總數減去細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)總數為未成熟樹突狀細胞(iDC)細胞計數，然后分別針對細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)和未成熟樹突狀細胞(iDC)進行細胞培養。
8.一種免疫細胞，其是根據權利要求1-7任一項所述方法獲得的。
9.權利要求8所述免疫細胞在治療疾病中的應用，所述疾病選自腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑色素瘤、間皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，優選腫瘤。
10.權利要求8所述免疫細胞在用于非治療目的保健中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種簡單有效的血液免疫細胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復蘇的方法，以及復蘇后免疫細胞擴增的方法，其包括如下步驟全血樣本預處理、Ficoll法分離、MNC收集和洗滌、MNC計數、MNC凍存、細胞復蘇、MNC計數和細胞擴增。本發明發現使用特定操作步驟的提取、凍存、復蘇以及擴增，可以有效地獲得免疫細胞，該免疫細胞可用于治療腫瘤。
文檔編號C12N5/0783GK102876631SQ20121037943
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月9日 優先權日2012年10月9日
發明者姚靜, 楊傳慶, 張輝, 鄭愛玲, 張星星, 朱曉青 申請人:博雅干細胞科技有限公司