專利名稱：可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療葡萄球菌感染的藥物的制備。
背景技術：
葡萄球菌感染是全世界醫院中一個日益嚴重的威脅。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是最常見的醫院感染來源之一。它引起多種不同的感染，如無癥狀的鼻腔攜帶、中度到重度皮膚和創傷感染、腹膜炎、骨髓炎、肺炎、尿道感染。當該細菌存在于血液中并且在全身移動時，最嚴重的情況是菌血癥和膿毒癥。葡萄球菌的外觀和致病能力與抗生素的廣泛使用有關，抗生素已經誘發并且在繼續誘發多藥耐藥性。由于這個原因，針對葡萄球菌感染的醫學治療不能只依賴抗生素。這些疾病的治療需要策略上的改變，旨在預防感染或者干擾促進疾病的細菌機制(綜述見Cossley編著，1997)。
因此，本發明的一個目的在于為了對抗葡萄球菌感染提供替代治療方法。
本發明提供可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途，從而解決了這一問題。
發明內容
觸珠蛋白受體，以前被稱為LPXT-Gp5，沒有與之有關的任何功能(特別是受體功能)，使用來自不同金黃色葡萄球菌感染患者的人血清，通過細菌表面展示和蛋白質組學，被鑒定為一種重要的抗原(WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska，2002)。它屬于金黃色葡萄球菌中的一類細胞表面蛋白質，與宿主組織、宿主細胞和分子的直接相互作用有關(Patti等人，1994；Schneewind等人，1995)。本發明提供了與該蛋白質的生物學功能有關的新用途，該蛋白質作為觸珠蛋白受體，介導金黃色葡萄球菌的鐵攝取，影響吞噬細胞的殺傷。
金黃色葡萄球菌和其它病原體的最限制生長的因素之一是鐵限制。本發明第一次使預防和治療金黃色葡萄球菌感染的藥物制備針對金黃色葡萄球菌的鐵攝取途徑。鐵作為大量酶的輔因子是細菌的一種必需的、限制生長的養分。鐵過載產生毒性，主要是因為不受控制的氧化還原循環、酶抑制、可與所有類型的生物分子強烈反應的羥自由基的形成，DNA損傷產生最有害的后果。因此，鐵饑餓與鐵中毒之間的精細平衡至關重要。眾所周知，鐵在幾種感染的易感性和后果中起作用。低于和高于臨界水平的鐵濃度可減弱身體的抗微生物防御。在醫學領域眾所周知，補鐵(特別是靜脈內)能夠加重不明顯的慢性疾病，眾所周知的例子是結核。這一現象在幾種動物模型中再現(Lounis等人，2001)。
在體內，(在宿主中生長的)病原體細菌面臨鐵限制，因為在真核生物中不含或者只含少量(10-12-15M)的游離鐵，因為事實上在需氧條件和生理pH下，Fe離子是不可溶的且有毒的。鐵被小無機物(如檸檬酸鹽)復合或與蛋白質結合。細胞外致病菌必須從Fe結合的血漿(胞外)蛋白質(如轉鐵蛋白、乳鐵蛋白、游離(血漿)血紅蛋白和血紅素結合蛋白)中提取鐵。細胞內鐵構成血紅素和非血紅素鐵結合蛋白，最豐富的是血紅蛋白(紅細胞中)、肌紅蛋白(肌肉中)和細胞色素C(所有細胞中)。過量的鐵在細胞內被一種特化的貯存蛋白——鐵蛋白螯合。
由于細菌高度依賴于外部鐵來源，專門的離子獲取系統是宿主中致病菌存活和生長的必要條件。大量細菌蛋白質與微生物鐵攝取和轉運有關，在不同細菌種使用的攝取系統中發現相當多的變化。細菌使用兩種主要的機制從宿主的鐵結合蛋白中提取鐵。在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中鑒定了幾種表面受體，它們直接結合宿主的鐵結合蛋白，使它們緊密靠近細菌表面，在表面上鐵或血紅素從這些蛋白質上脫落。該方法之后由專門的或通用的轉運蛋白穿過膜特異性轉運(Braun，2001綜述)。獲得鐵的另外一種機制是產生并分泌低分子量分子，即對Fe3+和血紅素有極高親和力的所謂的鐵載體。這種極高的親和力(10-12M)使這些分子能夠從蛋白質結合的鐵中清除鐵。裝載鐵和血紅素的鐵載體通過特異性受體被攝取，鐵在細胞內被利用。不同的細菌偏愛一種或者另外一種、甚至使用兩種方法，并且表達幾種不同的受體，用于結合宿主的鐵結合蛋白，或者輸入低分子量鐵螯合化合物，如血紅素、檸檬酸鹽或鐵載體。例如，致病的奈瑟氏球菌(腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoe)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)或釀膿鏈球菌(S.pyogenes))不含用于產生和攝取鐵載體成分的酶和受體，只依賴于通過捕獲宿主的鐵結合蛋白清除鐵。同源轉鐵蛋白結合的(TbpA，B)和乳鐵蛋白結合的(LbpA，B)蛋白質已經在奈瑟氏球菌和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)中鑒定(Cornelissen等人，1992；Pettersson等人，1994；Bonnah等人，1995；Biswas和Sparling，1995；Gray-Owen等人，1995；Schryvers，1988)。另外，奈瑟氏球菌也含有與血紅蛋白結合的受體(HmbR)和觸珠蛋白-血紅蛋白復合物(HpuA，B)(Lewis等人，1997；Kahler等人，2001；Stojiljkovic等人，1996)。在流感嗜血菌中也發現了血紅蛋白-觸珠蛋白受體(Jin等人，1996；Ren等人，1998)。這些鐵結合蛋白的表達模式和配體特異性已經表征。已經確定，它們是在低鐵培養基中生長所必需的，因為敲除株的生長受到限制，但不是完全缺陷，這是由于流感嗜血菌或奈瑟氏球菌表達的血紅素采集系統的多余性質。在流感嗜血菌或腦膜炎奈瑟氏球菌感染的恢復期患者的血清中，循環抗體的存在是體內表達的指示。
本發明證實，重組LPXTGp5能夠在親和純化中使用，用來結合并純化來自人血漿的血清觸珠蛋白。作為商品獲得的觸珠蛋白也顯示能夠結合LPXTGp5蛋白，其作為重組蛋白，或者直接分離自細菌細胞。因此，本發明清楚地表明，LPXTG5作為一種觸珠蛋白受體起作用，用于使觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌表面結合，從而使該細菌能夠攝取鐵。
最豐富的Fe結合蛋白是血紅蛋白(Hb)，它主要在細胞內(紅細胞)。然而，由于紅細胞的生理更新(t1/2＝180天)，血清中總是含有少量(～10μg/ml)的游離血紅蛋白。在溶血過程中，大量Hb釋放到血漿中。血漿(游離)Hb立即通過極高親和力的結合(Ka＞10-15M)與觸珠蛋白(Hp)復合，后者是一種豐富的(0.5-2mg/ml)血漿糖蛋白。大量溶血能夠耗盡血清觸珠蛋白，因此低Hp濃度對于溶血具有診斷價值。觸珠蛋白與血紅蛋白結合的主要作用之一是，僅僅通過將蛋白質復合物的大小提高到濾過限度以上(＞70kDa)，阻止Hb(64-kDa)被腎小球濾過到尿中。Hp-Hb復合物的形成防止發展兩種危險的疾病。直接危險是腎小球中高濃度的Hb，這阻塞濾過液的流動，阻止排尿，導致急性腎衰竭。慢性危險是體內失鐵，導致鐵缺乏，主要是貧血。為了防止腎臟損傷和失鐵，肝臟的RES(網狀內皮系統)從循環中提出Hp-Hb復合物。RES細胞含有對于觸珠蛋白與Hb結合特異的高親和力受體。
眾所周知，與鐵代謝有關的血漿蛋白，如觸珠蛋白、血紅素結合蛋白和乳鐵蛋白，具有免疫功能，有助于正常的感染抗性。
觸珠蛋白是一種急性期蛋白質，具有推測的抗炎癥活性。促炎細胞因子IL-6和IL-1可以增強它的肝表達(Baumann等人，1990)。另外，TNF-α似乎迅速提高感染或損傷部位的Hp水平，導致急性炎癥反應的調節(Berkova等人，1999)。最近已經證實，觸珠蛋白也能夠被肺上皮細胞表達，可能有助于局部微生物抗性(Yang等人，2000)。而且，觸珠蛋白與吞噬細胞功能的調節有關。人吞噬細胞(多形核粒細胞以及單核細胞，但不是嗜酸粒細胞)在特定顆粒內含有觸珠蛋白。這些觸珠蛋白貯存反映了從胞外環境中特異攝取觸珠蛋白。而且，如同其它顆粒部分一樣，觸珠蛋白在吞噬過程中被胞吐(Wagner等人，1996)。在體外測定中，顯示Hp抑制吞噬作用和粒細胞對細菌的胞內殺傷(Rossbacher等人，1999)。推測的功能是吞噬過程中氧化爆發(oxidative burst)的下調，從而防止吞噬細胞的氧化損傷。最近已經描述了巨噬細胞上的一種新型Hp-Hb受體(CD163)(Kristiansen等人，2001)。CD163/Hb清除受體負責肝臟從循環中攝取Hb-Hp復合物。另外，已經證明中性粒細胞表面整聯蛋白CD11b/CD18結合Hp(El Ghmati等人，1996)。這些數據提示，觸珠蛋白在宿主抗感染和炎癥的防御中具有重要的生物功能，作為免疫系統受體-配體激活的一種天然拮抗劑。
令人感興趣的是，有一些報道稱Hp對細菌(例如釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes))的生長甚至具有直接的抑制作用(Delanghe等人，1998b)。一種觸珠蛋白同源物，觸珠蛋白相關蛋白(HRP)，被鑒定為一種錐蟲裂解復合物的主要成分，負責T.cruci的直接殺傷(Smith等人，1995)。
人群中存在觸珠蛋白基因多態性，這是由于編碼Hp一條鏈的復制基因部分引起的。抗氧化蛋白質觸珠蛋白已知有三個表型Hp 1-1、Hp2-1和Hp 2-2。這些不同的表型與不同疾病(如細菌和病毒感染(例如AIDS)、糖尿病、心臟病等)的易感性有關(Delanghe等人，1998a；Hochberg等人，2002；Van Vlierberghe等人，2001)。主要解釋為不同的分子大小(單體對寡聚體形成)，因此不同的組織穿透和局部抗氧化活性。Hp能夠抵抗Hb誘導的Fenton反應引起的氧化損傷。
由于Hp的眾所周知的抗氧化活性，金黃色葡萄球菌的觸珠蛋白包被可導致吞噬體內細菌氧化損傷減少。此外，與金黃色葡萄球菌表面結合的Hp也可以使其逃脫殺傷，這是通過調節進入專業吞噬細胞的途徑(通過觸珠蛋白受體)，在細胞質而不是在吞噬細胞顆粒內產生游離細菌。
根據本發明，提供了與觸珠蛋白受體介導的配體結合相互作用的分子，其反過來將導致細菌，特別是金黃色葡萄球菌的鐵饑餓。如本發明所用的“相互作用”涉及導致阻礙病原體中的這種觸珠蛋白受體與配體結合的任何相互作用。優選地，通過破壞這種機制進行相互作用，即完全滅活或阻斷這種途徑。然而，該途徑功能性的顯著降低(例如通過競爭性反應)通常也足以對抗由含有觸珠蛋白受體的病原體引起的疾病。
本發明表明，LPXTGp5基因的預測的開放閱讀框(金黃色葡萄球菌N315株中的SA1552，根據Kuroda等人，2001的描述)(SEQ ID No 1)編碼一種長895個氨基酸的蛋白質，它在N端有一個典型的信號肽序列，在C端有典型的革蘭氏陽性錨定基序，包含LPXTG基序、疏水性跨膜區和帶正電的尾(SEQ ID.No 2)。
應當指出，在本發明中，“觸珠蛋白受體”是LPXTGp5基因(SEQ ID.No 1)編碼的LPXTGp5蛋白(SEQ ID.No 2)，也被稱為“HarA”，它代表觸珠蛋白受體A，具有針對人血漿觸珠蛋白和觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的特異性配體結合活性。
根據本發明的一個優選實施方案，可與配體的觸珠蛋白受體結合相互作用的分子選自觸珠蛋白受體抗體、與根據SEQ ID NO 2的肽(觸珠蛋白受體)結合的觸珠蛋白模擬位(mimotope)，或其片段。
“觸珠蛋白受體抗體”包括任何一種抗體或抗體片段或衍生物，其顯示對根據本發明的觸珠蛋白受體的結合親和力。它們可以是多克隆或單克隆抗體、單鏈抗體或含有抗體分子的可變結合域的其它片段。
抑制與觸珠蛋白(Hp)結合的一個有效方法是通過抗LPXTGp5的特異性抗體。除了中和其作為HpR的功能以外，相同的抗體能夠支持調理吞噬，因為Hp結合區必須是表面暴露的。在動物模型中使用的保護性疫苗有幾個例子，它們包含細菌鐵攝取受體蛋白(Webb和Cripps，1999)。Webb和Cripps證明，在大鼠模型中，用重組轉移結合蛋白(TbpB)免疫可通過刺激保護性應答(抗體產生)加速從肺中清除無法分型的流感嗜血菌。
而且，抗LPXTGp5抗體能夠用于發展有效抑制劑和拮抗劑，如模擬位。這些拮抗劑優選地是肽或無機(或有機)小分子。此外，HpR的鑒定也能夠產生小藥物抑制劑，是抗細菌化學治療或化學預防的一部分。
根據本發明的一個優選實施方案，觸珠蛋白受體抗體或觸珠蛋白模擬位可結合選自SEQ ID NO 4(D1)和SEQ ID NO 6(D2)或其片段的多肽。
在本發明的過程中，已經鑒定了兩個高度同源的結構域(D1和D2)，它們位于LPXTGp5蛋白的胞外部分。這兩個分離的結構域都能夠結合從人血漿中純化的觸珠蛋白。
根據一個方面，本發明也提供了編碼觸珠蛋白結合分子(即一種觸珠蛋白受體)的基因。因此本發明也涉及這些含有根據SEQ.ID.NO.1的序列的基因。編碼根據SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的D1或D2結構域的核酸和編碼觸珠蛋白結合多肽的片段也是根據本發明的核酸分子。
根據本發明的核酸序列可以是例如RNA或DNA；它們也可以與適當的啟動子、增強子、標記等序列共存于例如一種載體中，如質粒或病毒載體，使多肽或mRNA在靶細胞、組織或體液中表達。根據SEQ.ID.NO.7的Fur盒是根據本發明使用的一種優選的調節元件。本發明也包括編碼觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結合片段的核酸序列，分別可與SEQ.ID.Nos1、3、5、7嚴格雜交的核酸(或其互補序列)。可能的嚴格雜交條件是例如6×SSC(例如Sambrook等人1989，《分子克隆實驗室方法》所定義的)。
根據另一方面，本發明提供了分離的多肽，包括選自下列的多肽SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6及其觸珠蛋白結合片段，以及同源結構域。“同源結構域”包括所有觸珠蛋白結合域，根據SIM(Expasy)程序(例如可以利用PSIPRED預測排比程序進行二級結構測定(例如用于結構域限定；也用于同源性))計算，它們與SEQ ID NOs 4或6有至少40％、優選地至少70％、特別是至少90％的序列同源性。
只在結構域和相鄰區之間存在顯著同源性
根據本發明的再一方面，提供一種合成偶聯物，其含有一種根據SEQ ID NO 4的肽，該肽通過非天然存在的接頭與根據SEQ ID NO 6的肽連接。原則上不干擾Hp結合的所有偶聯物都可用于本發明，例如GST(谷胱甘肽-S-轉移酶、His-tag、FLAG-尾等)。
根據本發明的一個優選實施方案，非天然存在的接頭是多肽。
根據本發明的另一方面，本發明包括反義技術的使用。因此，病原體中觸珠蛋白受體的表達被可結合觸珠蛋白受體mRNA或其調節元件的反義核酸分子阻斷或大大抑制。用來與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子因此是一種結合觸珠蛋白受體基因或結合調節元件的反義核酸，用于表達觸珠蛋白受體基因，特別是根據SEQ ID NO 7的Fur盒。
根據本發明的另一方面，提供了一種在嚴格條件下可與選自SEQID NO 7的核酸序列雜交的核酸。
嚴格雜交條件在本領域公知(見上)。如果核酸序列已知，能夠計算最佳雜交條件。例如，能夠根據將要雜交的核酸的GC含量確定雜交條件(Sambrook等人1989，《分子克隆實驗室方法》)。
在原核生物中，鐵代謝主要在基因轉錄水平上調節。在進化過程中，已經發展了高度調節的、復雜的、繁瑣的攝取系統，大量基因(在有些情況下＞40種)的表達由優勢胞內濃度的Fe通過與調節蛋白復合直接控制。在幾乎所有細菌中表征最好的、最保守的是Fur阻抑蛋白(鐵攝取調節蛋白)。Fur直接感知細胞內鐵濃度的改變，是一種鐵結合蛋白。在足夠或高濃度下，鐵與Fur結合。鐵的結合使得該蛋白質能夠結合被稱為fur盒的某些DNA序列，抑制靶基因的轉錄。在鐵限制條件下，Fe2+易于從Fur-Fe復合物上解離，使Fur調節的基因轉錄(Escolar等人，1999)。重要的是，毒力因子的表達與鐵饑餓聯系在一起(例如，志賀毒素、大腸菌素、溶血素)，提示低鐵濃度是體內“戰場上的”致病菌的一個總體信號。這在目的上可能是合理的，因為細胞毒素、溶血素導致鐵結合蛋白(如血紅蛋白和肌紅蛋白)釋放，它們是細菌生長的極佳的鐵源。
通常對于革蘭氏陽性菌，特別是葡萄球菌，對它們的鐵轉運和調節所知相對較少。金黃色葡萄球菌基因組編碼三個鐵攝取調節基因(Fur)同源物Fur、PerR和Zur。發現PerR控制編碼氧化應激抗性蛋白過氧化氫酶(KatA)、烷基氫過氧化物還原酶(AhpCF)、細菌鐵蛋白共遷移蛋白(Bcp)和硫氧還蛋白還原酶(TrxB)的基因轉錄。此外，PerR也調節編碼鐵貯存蛋白-鐵蛋白和鐵蛋白樣Dps同源物MrgA的基因的轉錄(Horsburgh等人，2001綜述)。而且，已經證明金黃色葡萄球菌能夠利用幾種氧肟酸鹽鐵載體在鐵限制條件下生長(Sebulsky等人，2000)。曾經提出sir(鐵載體調節)操縱子構成金黃色葡萄球菌中的鐵載體轉運系統。它含有受體和細胞質膜結合的交通ATPase，該酶與鐵(III)-氧肟酸鹽復合物的具體轉運有關(Sebulsky等人，2001)。然而，關于通過與宿主鐵結合蛋白直接結合獲得鐵所知甚少。表面GAPDH是一種42-kDa的金黃色葡萄球菌蛋白質，可能是轉鐵蛋白受體(Modun和Williams，1999)。最近，一種LPXTG蛋白已經被鑒定為金黃色葡萄球菌的轉鐵蛋白受體(Taylor和Heinrichs，2002)。本發明表明，LPXTGp5上游的核苷酸序列對應于位于起始ATG密碼子上游-53和-35bps之間的共有fur結合盒。本發明表明，LPXTGp5一方面在fur缺失突變的金黃色葡萄球菌株中組成型表達，另一方面，在fur基因完整的野生型金黃色葡萄球菌株中，這種表達是鐵調節的。
根據另一方面，本發明提供一種方法，用于分離可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-在固體表面上提供觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段，-使標記的觸珠蛋白與這種固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段結合，形成固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段與標記的觸珠蛋白的復合物，-使這種復合物接觸含有候選分子的庫(pool)，-確定該庫中替代復合物中所述標記觸珠蛋白的分子，和-分離替代該復合物中的標記觸珠蛋白的所述分子。
利用這種方法，能夠分離與觸珠蛋白競爭觸珠蛋白受體之觸珠蛋白結合位點的分子。
根據本發明的一種相當的方法，用于分離可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-提供固定于固體表面上的觸珠蛋白，-使標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段與這種固定的觸珠蛋白結合，形成固定的觸珠蛋白與標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段的復合物，-使該復合物接觸含有候選分子的庫，
-確定該庫中替代該復合物中所述標記觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段，并與固定的觸珠蛋白結合的分子，-分離該庫中與固定觸珠蛋白結合的所述分子。
利用該方法，能夠分離觸珠蛋白受體模擬位。
根據本發明的另一種相當的方法，用于分離可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子，其特征在于下列步驟-提供候選分子庫，-從該庫中提取并分離可與固定的觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結合片段結合的分子，-從該庫中提取并分離可與固定的觸珠蛋白結合的分子，-使其余的候選分子庫接觸在觸珠蛋白與觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結合片段之間形成的固定復合物，-分離與該固定復合物結合的所述分子。
利用該方法，能夠分離特異性結合觸珠蛋白/觸珠蛋白受體復合物而不結合(未復合的)單種成分的分子。因為復合物只在病原體細胞表面上體內存在，因此能夠將這些復合物特異性分子與適當的對抗病原體的分子(例如特定抗生素)組合，以實現病原體的定點控制。
在本發明的一個優選實施方案中，該觸珠蛋白結合片段選自SEQID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或這些片段的組合。
如本發明的實施例所述，能夠建立一種基于ELISA的體外測定和一種基于FACS的體外測定，用于測定LPXTGp5或其片段(例如D1和D2)與觸珠蛋白的競爭性結合。這類測定系統在篩查、分離可相互作用或破壞LPXTGp5和觸珠蛋白相互作用的分子中特別有用。
在本發明的一個優選實施方案中，該觸珠蛋白受體是金黃色葡萄球菌觸珠蛋白受體。
在本發明的另外一個優選實施方案中，該觸珠蛋白是一種哺乳動物，特別是人觸珠蛋白。
本發明通過下列實施例和附圖更詳細地描述，但是并不限于此。
圖1顯示LPXTGp5蛋白的結構，以及LPXTGp5與含有同源結構域的其它葡萄球菌蛋白質之間的二級結構的比較。
圖2通過凝膠電泳、蛋白質染色和免疫印跡法顯示重組LPXTGp5。
圖3-4顯示在不同金黃色葡萄球菌感染患者和健康供體的血清中，測定的抗rLPXTGp5、D1和D2的IgG水平。
圖5顯示人血漿蛋白質與重組LPXTGp5的結合。
圖6顯示觸珠蛋白與體外培養的金黃色葡萄球菌細胞表達的原始LPXTGp5的結合。
圖7顯示金黃色葡萄球菌的依賴生長條件的LPXTGp5表達。
圖8顯示fur盒序列的排比，以及鐵和Fur調節的LPXTGp5表達。
圖9顯示在基于ELISA的測定中，rLPXTGp5結構域對觸珠蛋白的結合。
圖10顯示在基于FACS的測定中，觸珠蛋白與活金黃色葡萄球菌細胞的結合。
圖11顯示在D1結構域存在下，觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌結合的抑制。
圖12顯示觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌8325-4和LXTGp5KO的結合。
圖13顯示Hp-Hb復合物引起的金黃色葡萄球菌生長的增強。
圖14顯示觸珠蛋白受體結合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。
實施例方法與實驗程序菌株和培養條件金黃色葡萄球菌野生株8325-4(Novick，1967)、臨床分離株COL(Shafer和Iandolo，1979)和限制缺陷株RN4220(Kreiswirth等人，1983)來自我們實驗室的菌株庫。金黃色葡萄球菌fur突變體(Horsburgh等人，2001)由Simon Foster(Sheffield University，UK)惠贈。金黃色葡萄球菌株在BHI(腦心浸液)培養液或RPMI 1640組織培養基(含有25mMHepes緩沖液和L-谷氨酰胺，Gibco BRL)中培養，作為鐵含量較少的貧乏培養基。向RPMI培養基中加入FeCl3至終濃度為25μM實現補鐵。可作為商品獲得的大腸桿菌BL21株和ElectroMAX DH10B(Invitrogen)分別用于重組蛋白質表達和克隆目的，在Luria-Bertani培養液(LB)中生長。當含有抗生素時，以下列濃度加入對于大腸桿菌氨芐青霉素，100μg ml-1；紅霉素，300μg ml-1；對于金黃色葡萄球菌紅霉素，5μg ml-1；林可霉素，25μg mol-1；四環素，5μg ml-1。除非另外說明，所有細菌培養都在37℃和150轉/分振搖下進行。
細菌裂解物制備在蛋白酶抑制劑(Complete∑，不含EDTA的片劑，Roche)存在下，通過在37℃下溶葡萄球菌素消化(100μg ml-1，在PBS中)30分鐘，制備總細菌裂解物。除了酶消化之外，也利用微型超聲破碎儀(BandelinSonopuls，HD 2200，德國)超聲處理，破壞細胞。離心后，回收可溶性級分，用Bredford法(Bio-Rad蛋白質測定法)測定蛋白質濃度。
重組HarA的表達利用摻入BsaI位點的基因特異性寡核苷酸HARA1和HARA2，由金黃色葡萄球菌COL基因組DNA擴增編碼HarA的cDNA(表1)。將限制性內切酶消化的PCR產物克隆到BsaI酶切的pASK-IBA4載體中，位于編碼Strep-tag II(IBA，Gottingen)的序列的下游。獲得的基因缺乏位于sortase酶切位點(LPKT，G)下游的對應于信號肽和C端部分的序列(QAQA，AENT)。通過StrepTactin親和層析(根據廠商說明)，從無水四環素誘導的BL21大腸桿菌的細菌提取物中純化重組蛋白。除了全長蛋白質之外，擴增對應于預測的D1和D2結構域的DNA序列也產生HarA的兩種截短形式。分別使用寡核苷酸引物MOL1031和MOL1032或MOL1033和MOL1034，產生聚合酶鏈反應產物(表1)，然后用BamHI-SalI消化，以插入BamHI-SalI消化的pGEX-4T-3(AmershamBiosciences)中。通過超聲處理(緩沖液50mM Tris-HCl pH8.0，100mMNacl，1mM EDTA)從IPTG誘導的BL21大腸桿菌細胞中提取GST融合蛋白，在谷胱甘肽Sepharose 4B親和柱(Amersham Biosciences)上從可溶性細菌級分中純化。通過凝血酶消化(50U ml-1，室溫下3小時)或使用10mM谷胱甘肽，洗脫重組蛋白。
表1.引物列表名稱核苷酸序列 限制酶切位點以下劃線標出人血漿蛋白質的親和純化首先，通過與Ultralink固定的蛋白質G珠(PIERCE)結合，使人血漿耗盡IgG。簡言之，將用PBS(pH7.4)1∶2稀釋的1ml血漿分兩次加到蛋白G Sepharose柱上，收集流過液。IgG耗盡的血漿(～60mg總蛋白質)與固定于StrepTactin瓊脂糖(IBA，Gottingen)上的20ug StrepII-標記的重組蛋白溫育。用PBS充分洗珠后，用100μl等電聚焦樣品緩沖液(IEF10M尿素，4％CHAPS，0.5％SDS，100mM DTT)洗脫蛋白質。
使用純化觸珠蛋白的金黃色葡萄球菌蛋白質的親和純化通過200μg生物素化的觸珠蛋白(Hp∶生物素=1∶10)與40μl鏈霉抗生物素蛋白凝膠Ultralink Plus(PIERCE)結合，制備觸珠蛋白親和柱。從在RPMI中培養到穩定期的金黃色葡萄球菌8325-4細胞中提取總蛋白質，將2mg加到Hp柱上。充分洗滌后，結合的蛋白質用100μl IEF緩沖液洗脫，40μl洗脫物通過SDS-PAGE隨后通過免疫印跡法分析。
二維凝膠電泳高分辨率二維凝膠電泳如別處所述進行(Hochstrasser等人，1988)，其使用mini-Protean電泳系統(Bio-Rad)。為了分析IgG耗盡的血漿，用IEF樣品緩沖液稀釋1μl樣品，可達10μl。樣品緩沖液中的洗脫級分直接加到凝膠上。一維等電聚焦在2625V-h下在1mm×10cm管式凝膠中分步進行(10min，500V，3.5h，750V)，其中使用4％丙烯酰胺(Gerbu，Gaiberg，德國)/0.1％PDA，0.035％Nonidet P-40和2％兩性電解質(pH3.5-10∶pH4-8∶pH5-7＝1∶1∶2；Merck，Darmstadt，德國)，用脫氣的20mM NaOH作為陰極電解質，6mM H3PO4作為陽極電解液。管式凝膠置于1.0mm 12％SDS-PAGE平板凝膠之上。用3％SDS，70mM Tris堿，0.001％溴酚藍平衡3分鐘后，使用0.1％SDS，25mMTris堿和200mM甘氨酸作為電極緩沖液，在15℃下進行第二維電泳。凝膠用考馬斯藍染色。在該系統中可以檢測的蛋白質的范圍是10-220-kDa，pI3.5-7.5。
抗HarA抗體的產生從經ELISA確定含有高水平抗rHarA抗體的健康供體的血漿中分離人抗HarA IgG。50ml血漿用ImmunoPure IgG結合緩沖液(PIERCE)1∶2稀釋，加到UltraLink固定的蛋白G珠(PIERCE)上。與該柱結合的IgG用ImmunoPure IgG洗脫緩沖液(PIERCE)洗脫，用1M Tris-HClpH8.0中和。合并洗脫級分，在4℃下對PBS透析過夜。150mg IgG與40mg生物素標記的HarA溫育，后者固定于50μl UltraLink Plus固定的鏈霉抗生物素蛋白凝膠(PIERCE)上。在充分洗滌后，用ImmunoPure IgG洗脫緩沖液洗脫級分。這種純化產生～20μg IgG，使用rHarA和幾種無關金黃色葡萄球菌重組蛋白，通過ELISA和免疫印跡法檢測其特異性，作為陰性對照。用代表全長HarA或含有單結構域D1和D2的截短形式的重組蛋白免疫兔，產生超免疫的多克隆免疫血清。在采血前，新西蘭白兔以3周的間隔免疫三次，每只兔每次注射250μg蛋白質。有效的免疫和特異性抗體的存在使用各自的重組蛋白通過ELISA和免疫印跡法證實。
免疫印跡利用mini-Protean電泳系統(Bio-Rad)通過一維和二維SDS-PAGE分離蛋白質，并利用半干轉移系統(Bio-Rad)將其轉移到硝酸纖維素膜(ECL，Amersham Biosciences)上，通過麗春紅S染色顯示。用5％牛奶封閉過夜后，加入100ng ml-1濃度的純化的人抗HarA IgG或1∶10000稀釋的兔免疫前或免疫血清，HarA蛋白的特異性檢測使用HRP標記的山羊抗人IgG(Southern Biotech)或HRP標記的山羊抗兔IgG(Amersham Biosciences)。用ECL檢測系統(Amersham Biosciences)檢測信號。
利用抗HarA抗體的細胞表面染色在含有或不含作為鐵源的25μM FeCl3的情況下，在RPMI培養基中培養到對數晚期的5×106金黃色葡萄球菌細胞(OD600為0.8-1.0；在RPMI中的最大OD600～1.6)用多克隆兔抗HarA抗血清染色。在加入1∶500稀釋的兔超免疫血清之前，與10μg樣品-1的人IgG Fc片段(Jackson ImmunoResearch)溫育，阻止抗體的非特異性結合。用PBS洗滌后，加入第二種試劑——FITC標記的抗兔IgG/Fab特異性片段(Jackson ImmunoResearch)。所有步驟都在冰上進行，每步30分鐘。最后，用PBS洗滌細胞，用2％PFA固定，用FACScan(Becton Dickinson)定量熒光。
觸珠蛋白結合測定基于ELISA的體外測定以兩個不同的設置進行。首先，我們使用從合并的人血漿(SIGMA和FLUKA)中純化的觸珠蛋白作為包被試劑，它在包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.3)中濃度為10μg ml-1，并且以2.5-12pmoles(2-10μg ml-1)的量使用GST-D1和GST-D2作為結合配偶體。用1∶5000稀釋的生物素標記的山羊抗GST mAbs(Abcam，UK)和1∶10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Roche)檢測Hp與D1或Hp與D2之間的相互作用。其次，rHarA、D1和D2結構域蛋白以10μg ml-1的濃度在包被緩沖液中包被，加入含量為0.08-4.0pmoles的配體觸珠蛋白、觸珠蛋白-血紅蛋白復合物或血紅蛋白。在室溫下以1∶1摩爾比輕輕混合觸珠蛋白與血紅蛋白(Sigma)45分鐘，制備觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。復合物的形成通過非變性PAGE凝膠的CBB染色顯示。使用1∶2000稀釋的抗人觸珠蛋白(SIGMA)和抗人血紅蛋白(Abcam，UK)單克隆抗體，和HRP標記的抗小鼠IgG作為第二種試劑，檢測配體蛋白質的結合。根據用自動ELISA讀板器(Wallace Victor 1420)讀取的OD405nm，測定底物(ABTS)向有色產物的轉化，由此定量抗原-抗體復合物。以10∶1的生物素與觸珠蛋白比，用純化的生物素標記的觸珠蛋白(EZ-連接磺基-NHS-LC生物素，PIERCE)進行基于FACS的測定，在室溫下30分鐘。在用Nanosep 10K離心裝置(Pall，Life Sciences，USA)除去游離生物素后，使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP作為檢測試劑，通過免疫印跡證實觸珠蛋白的標記。在存在或不存在作為鐵源的25μM FeCl3的情況下，金黃色葡萄球菌細胞在RPMI培養基中培養，直到對數晚期(OD600＝0.8-1.0)。向5×106細胞中加入生物素化的觸珠蛋白(5-30μg)，在室溫下溫育30分鐘。用PBS洗滌后，加入1∶100稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-FITC(DAKO)，然后用2％PFA固定細胞。通過用FACScan(Becton Dickinson)測定熒光強度定量觸珠蛋白的表面結合。
依賴鐵的生長生長研究使用鐵耗盡的RPMI培養基。RPMI的鐵消耗通過與Chelex100(Sigma)成批溫育實現。簡言之，向1L培養基中加入10gChelex100，在室溫下攪拌4小時。然后向培養基中補充二價離子至10μM CaCl2和100μM MgSO4。從BHI平板上接種金黃色葡萄球菌8325-4和harA突變細胞，在RPMI完全培養基中溫育過夜。收集細胞，洗滌，重懸浮于鐵耗盡的RPMI培養基中，達到OD600＝0.05。在鐵饑餓3小時后，收集細胞，用補充不同鐵源的鐵耗盡RPMI稀釋為OD600＝0.02。使用下列鐵源濃度為25mM的三氯化鐵，0.5mM Hb和1μM和0.5μM濃度的Hp-Hb(2∶1)復合物。通過用Hitachi U-2001分光光度計測量600nm的光密度監測細菌的生長。
harA插入滅活突變體的構建使用以前(Chakraborty等人，1992)描述的pAUL-A載體(SimonFoster惠贈)構建用于插入滅活harA的質粒。使用分別添加SalI/KpnI和KpnI/EcoRI限制酶切位點的基因特異性引物MOL1313、MOL1314和MOL1315、MOL1316(表1)，PCR產生harA開放閱讀框的5′和3′側翼區。將1kb片段克隆到SalI-EcoRI消化的pAUL-A載體中，產生質粒pAUL-AD。使用摻入KpnI限制酶切位點的引物MOL1317和MOL1318(表1)，由pDG1513(Guerout-Fleury等人，1995；Simon Foster惠贈)擴增四環素抗性盒。然后將KpnI消化的含有1.5kb四環素抗性盒(Tc)的PCR片段克隆到pAUL-AD內。通過電穿孔法用50微克獲得的pAD02質粒轉化金黃色葡萄球菌RN4220限制缺陷轉化受體。在質粒復制的許可溫度(30℃)下鑒定紅霉素抗性轉化子。通過將溫度轉變為42℃篩選單交換Campbell型染色體插入，并在四環素上篩選。pAD02質粒向染色體DNA內的整合通過PCR分析證實。四環素抗性標記向金黃色葡萄球菌8325-4染色體內的整合通過用噬菌體11轉導實現。根據紅霉素和林可霉素抗性的丟失進一步選擇轉導的菌落，通過使用基因特異性引物的PCR，以及利用Southern印跡法，檢查harA基因的缺乏。
結果實施例1.LPXTGp5是在不同金黃色葡萄球菌感染過程中在體內表達的高度免疫原性的新細胞壁蛋白質1/A.LPXTGp5作為抗原的鑒定特異性抗細菌抗體是相應抗原體內表達的分子證據。抗原特異性血清抗體的鑒定廣泛用于對某些病原體(特別是不可培養的病原體)的血清診斷。
通過細菌表面展示以及使用不同金黃色葡萄球菌感染患者的人血清進行的蛋白質組學，LPXTGp5被鑒定為一種重要的抗原(參見WO02/059148 A，Etz等人，2002，Vytvytska等人，2002)。通過表面展示鑒定了該蛋白質的5個不同的B細胞表位區，全部位于N端。根據這些數據，LPXTGp5在人金黃色葡萄球菌感染期間表達，在許多患者中用多個表位產生廣泛的免疫原性。生物信息學分析鑒定了一種不知道功能的新型蛋白質。
1/B.LPXTGp5基因和蛋白質根據TIGR注釋(SA1781，InterCell ORF01361；Kuroda等人，2001)(SEQ.ID.No 1)，LPXTGp5基因的預測的開放閱讀框位于金黃色葡萄球菌COL株的1824064與1821380 bps之間。預測的ORF編碼一種長895個氨基酸的蛋白質，其在N端含有一個典型的信號肽序列，在C端含有典型的革蘭氏陽性錨定基序，含有LPXTG基序、疏水跨膜區和帶正電的尾(SEQ.ID.No 2)。一級氨基酸序列和預測的二級結構分析都提示，結構域的所有β折疊結構中存在兩個同源結構域(D1和D2)，它們被螺旋或卷曲區分開(圖1)。這兩個結構域含有～145個氨基酸殘基，顯示52％的同一性和71％的相似性。
令人感興趣的是，序列同源性搜索在其它三種金黃色葡萄球菌蛋白質中鑒定了類似的單結構域，我們稱之為LPXT-Gp6、LPXTGp7和p7。顯然，這三種蛋白質是金黃色葡萄球菌染色體上直接相鄰的基因。LPXTGp7和p7似乎被轉錄為一種mRNA。而且，p7基因之后是三個預測的膜蛋白，它們顯示與蛋白質的鐵ABC轉運家族同源。包括p5在內的所有四種蛋白質在5種金黃色葡萄球菌株之間高度保守，其基因組信息是可以獲得的。令人感興趣的是，發現使用人血清，所有四種蛋白質都是免疫原性的(參見，例如WO 02/059148 A)。類似于LPXTGp5，p6和p7/p7樣含有fur盒序列，在最近的公開文本中，證實這些蛋白質是鐵調節的(Mazmanian等人，2002)。預測的同源結構域的結構非常相似(PhD)，盡管其具有～40％的適中的氨基酸同一性。另外，在其它革蘭氏陽性菌中也存在含有同源結構域的蛋白質，它們全部屬于梭菌屬(Clostridium)。單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocyotgenes)含有一種蛋白質，稱為p64，它含有三個這樣的結構域。蛋白質組學分析提示，p64的表達是鐵調節的(Borezee等人，2000)。Bacillus halodurans基因組含有一個預測的含有該結構域的開放閱讀框。
1/C.產生重組蛋白由金黃色葡萄球菌COL株基因組DNA擴增編碼LPXTGp5的cDNA，其中分別使用基因特異性寡核苷酸5′-CGTAGCTGGAGCCACCGCAGTTC-3和5′-AAAATGCTACCAAAAACTTGA-3′。將限制性內切酶消化的PCR產物克隆到pASK-IBA4載體的BamHI-SalI位點內，位于編碼Strep-tagII的序列下游(IBA，Gottingen)。獲得的基因缺乏位于sortase酶切位點(LPXTG)下游的對應于信號肽和C末端的序列。通過Streptactin親和層析(根據廠商說明)，從氨芐青霉素誘導的BL21大腸桿菌的細菌提取物中純化重組蛋白。盡管該895aa蛋白質的預測分子量是101-kDa，但是重組全長LPXTGp5作為一種～130-kDa蛋白質遷移。細菌細胞壁蛋白質的遷移速度通常慢于其實際大小。
除了全長蛋白質之外，也產生LPXTGp5的兩種不同截短形式，方法是擴增對應于預測的D1和D2結構域的DNA序列，并插入BamHI-SalI消化的pGEX4T-3內。通過溶菌酶消化(緩沖液50mM TrispH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)，從IPTG誘導的DH10B大腸桿菌細胞中提取GST-融合蛋白，利用谷胱甘肽親和柱從可溶性細菌級分中純化。通過凝血酶消化，或者使用10mM谷胱甘肽，洗脫重組蛋白。因此，可以獲得長145aa的D1和D2重組截短形式，其含或不含GST尾。
1/D.LPXTGp5在人類中具有廣泛免疫原性在一系列免疫印跡和ELISA實驗中，測定來自不同金黃色葡萄球菌感染患者以及健康個體的人血清是否含有抗LPXTGp5抗體(圖2)。在不同血清之間，抗LPXTGp5 IgG(圖3)與IgA(數據未顯示)的水平存在差異，金黃色葡萄球菌創傷感染患者顯示最高水平。使用D1和D2蛋白的ELISA證明，這些結構域也具有高度免疫原性(圖4)。
實施例2.血清觸珠蛋白作為LPXTGp5的結合配體的鑒定2/A.用重組LPXTGp5對人血漿蛋白質的親和純化為了鑒定LPXTG-p5的結合配偶體和功能，將StrepII-標記的重組蛋白固定到Streptactin瓊脂糖(IBA)上，加IgG耗盡的人血漿。血漿樣品的選擇取決于通過ELISA獲得的抗rLPXTGp5的低IgG和IgA滴度，以避免不希望的免疫作用。與LPXTGp5柱結合的人血漿蛋白質的洗脫級分，以及只有Streptactin的對照柱的級分，進行2D-PAGE分析。2D凝膠的考馬斯藍染色顯示一組蛋白質斑點，其具有40-到45-kDa和pI 4.5-5.5的特征(圖5A)。對照柱的洗脫物(圖5B)以及單獨的rLPXTGp5凝膠(圖5C)中沒有這些斑點。未分級的血漿樣品的分離顯示同一組斑點(圖5D)，有助于相應蛋白質的鑒定。根據2D凝膠中蛋白質斑點的特征，借助于可從瑞士-2DPAGE數據庫(http//us.expasy.org/ch2d/)中獲得的蛋白質組學信息，純化的40-45-kDa蛋白質被鑒定為人血漿/血清糖蛋白——觸珠蛋白的亞基。特有的“珠位于帶上”的外觀是由于在前述Asn殘基的4個可能的糖基化位點處N連接的糖基化。為了證實這一發現，來自LPXTGp5親和柱的洗脫級分用抗人觸珠蛋白抗體進行2D免疫印跡分析，并且用純化的人血清觸珠蛋白作為陽性對照。2D凝膠相同區域中信號特有的5個斑點外觀再次證實。
為了提供確切的證據，購買可以作為商品獲得的從合并人血漿中純化的觸珠蛋白(cat# 51325，Fluka)，檢測它與LPXTGp5親和柱結合的能力。類似于使用血漿的實驗，純化的Hp通過與LPXTGp5相互作用保留在柱上，因為對照Streptactin瓊脂糖的洗脫物不含觸珠蛋白。也進行逆轉實驗，其中使用通過生物素標記固定于鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖珠上的純化的觸珠蛋白，以及由在耗盡鐵(含有Chelex 100)的RPMI培養基中生長到對數期的金黃色葡萄球菌8325-4spa株制備的總裂解液。來自觸珠蛋白偶聯珠的洗脫物的免疫印跡分析進一步證實，直接從細菌細胞中分離的天然LPXTGp5實際上是這種胞外宿主糖蛋白的結合配偶體(圖6)。
2/B.與LPXTGp5的D1和D2結構域結合的配體的定位在大腸桿菌中產生重組LPXTGp5總是產生降解產物(圖2)，這可能是由于蛋白質大小較大，以及這種革蘭氏陽性細胞壁蛋白在革蘭氏陰性大腸桿菌中表達的部分不相容性。為了鑒定識別觸珠蛋白所必需的蛋白質部分，如上所述產生GST標記的缺失突變LPXTGp5蛋白。同源結構域是配體結合的有吸引力的候選者。使用通過D1和D2蛋白免疫產生的超免疫兔血清顯示了這兩個結構域的細胞表面位置，證實它們可用于細胞外配體結合。用重組結構域蛋白質和純化的觸珠蛋白或IgG耗盡的血漿重復親和層析。GST-D1和GST-D2蛋白固定于谷胱甘肽Sepharose柱上，人血漿或純化的觸珠蛋白作為配體來源，類似于全長LPXTGp5使用的。洗脫物的2D分析鑒定觸珠蛋白為結構域的結合配偶體。盡管該實驗的設置不適于親和測定，但是似乎GST-D1比GST-D2更好地結合。
實施例3.LPXTGp5/SAHpR表達的調節3/A.在應激培養基中的優先表達用抗LPXTGp5抗體對由金黃色葡萄球菌8325-4 spa-(蛋白A缺陷株)制備的細菌提取物進行免疫印跡分析，顯示一條約130-kDa分子量的蛋白帶(圖7)。重要的是，純化的人IgG和兔免疫血清顯示相同的帶。盡管這種895aa蛋白質的預測分子量為101-kDa，但是細菌細胞壁蛋白質通常比其實際大小更慢地遷移。支持這一觀點，重組全長LPXTGp5實際上類似于天然形式作為一種～130-kDa的蛋白質遷移(圖2)。
令人感興趣的是，由在成分已知的、貧乏、低鐵培養基(RPMI 1640)中培養的細菌制備的提取物含有LPXTGp5，而在豐富培養基，如腦心浸液(BHI)中培養的細菌的提取物不含(圖7)。而且，蛋白質的表達只在細胞生長的對數后期和穩定期觀察到，而在對數早期觀察不到。眾所周知，離子濃度類似于人血漿的成分已知的、貧乏培養基比豐富培養基使病原體表達更多的體內相關的蛋白質，通常用于細菌的實驗室生長。
3/B.鐵和Fur對表達的調節LPXTGp5 ORF上游的核苷酸序列對應于位于起始ATG密碼子上游-53與-35bps之間的共有fur結合盒(圖8A)。該DNA基序的存在高度預示了依賴鐵的表達抑制，如同革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中的幾種基因所顯示的一樣(Escolar等人，1999)。
基因中存在fur盒序列引起了比較LPXTGp5蛋白在低和高鐵濃度培養基中培養的細菌中表達的興趣。由在補充RPMI培養基中培養的8325-4野生型金黃色葡萄球菌株制備的細菌裂解物進行免疫印跡分析，顯示鐵將表達抑制到不可檢測的水平(圖8B，左圖)。在一種金黃色葡萄球菌株中沒有這種調節，其中fur基因通過插入誘變滅活。Fur是一種依賴鐵濃度的轉錄抑制蛋白，因此在不存在時，預期靶基因解除抑制，從而上調。實際上，LPXTGp5在fur缺失突變金黃色葡萄球菌株(具有8325-4背景)中在每個生長階段組成型表達(圖8B，右圖)。根據這些結果，明確了LPXTGp5的表達處于Fur介導的鐵調節之下。
相反，agr和sar是與大量葡萄球菌毒力蛋白的調節有關的關鍵基因座(Arvidson和Tegmark，2001)，它們似乎不調節LPXTGp5的表達，根據單敲除株(agr-，sar-)的提取物的結果，相對于用野生型株獲得的結果，顯示類似的130-kDa帶的染色強度(數據未顯示)。
實施例4.篩選和發展LPXTGp5-觸珠蛋白相互作用抑制劑的試驗4/A.使用重組LPXTGp5蛋白的基于ELISA的體外測定發展了一種基于ELISA的測定，其使用觸珠蛋白作為包被試劑(10μg/ml，在包被緩沖液中)，GST-D1和GST-D2作為結合配偶體。Hp-D1與-D2的相互作用用生物素標記的抗GST mAbs(cat# ab6648，Abcam)和鏈霉抗生物素蛋白-HRPO(cat# 1089153，Roche)檢測。含量升高的D1和D2導致更高的OD讀數，直到在大約250pmol時達到飽和水平。相同摩爾含量(根據實際分子量校正)的GST相對于背景不產生可檢測的信號(圖9)。這些結果進一步支持LPXTGp5內Hp結合的定位。這也提供了一種篩選LPXTGp5與Hp相互作用抑制劑的容易、可能的高通量測定。
4/B.使用活金黃色葡萄球菌細胞的基于FACS的體外測定純化的觸珠蛋白用生物素標記(10∶1生物素與觸珠蛋白比)，并以逐漸升高的濃度加入活的野生型和fur突變金黃色葡萄球菌細胞中，該細胞在含或不含作為鐵源的25μM FeCl3的RPMI培養基中培養。利用鏈霉抗生物素蛋白-FITC(cat# F0422，DAKO)作為第二試劑檢測觸珠蛋白的結合，通過FACS定量分析。在允許LPXTGp5表達的條件下培養的金黃色葡萄球菌的表面染色證實了觸珠蛋白的顯著結合(圖10A)。使用在富含鐵的培養基中培養的金黃色葡萄球菌，無法檢測到觸珠蛋白的結合(圖10B)，這與使用抗LPXTGp5抗體的免疫印跡上信號的缺乏相一致。重要的是，無論環境中的鐵濃度如何均過量表達LPXTGp5的fur突變體顯示最明顯的觸珠蛋白結合(圖10C，D)。為了檢驗配體與LPX-TGp5結合的特異性，也在重組GST-D1結構域的存在下添加觸珠蛋白。提高GST-D1的摩爾過量可以以濃度依賴的方式降低用觸珠蛋白實現的表面染色。9倍過量的GST-D1已經使觸珠蛋白的結合幾乎降低到背景水平，而相同摩爾過量的GST不顯著影響結合(圖11)。該競爭實驗強烈提示，存在一種葡萄球菌觸珠蛋白受體，觸珠蛋白結合功能不是多余的。因此，破壞劑，無論是抗體、模擬位還是中斷觸珠蛋白-LPXTGp5相互作用的小藥物，都可能對Hp-金黃色葡萄球菌的相互作用有害。
實施例5.金黃色葡萄球菌對來自Hp-Hb復合物的鐵的應用在人體內生長的金黃色葡萄球菌不得不從體內，即從宿主的鐵結合蛋白中“竊取”鐵。最豐富的含鐵蛋白質是血紅蛋白(Hb)。由于細胞外血紅蛋白立即被觸珠蛋白復合，實際上是Hp-Hb復合物，它是血漿中的鐵源之一。檢測在鐵耗盡的RPMI培養基中生長的金黃色葡萄球菌8325-4株在體外利用來自Hp-Hb復合物的鐵的能力。只加入觸珠蛋白和只加入血紅蛋白作為陰性對照，FeCl3作為生長增加的陽性對照。金黃色葡萄球菌的生長在復合物存在下受到刺激，提示鐵的獲取通過Hp-Hb復合物(圖12)。
實施例6一種LPXTGp5插入滅活突變體的構建為了研究LPXTGp5的作用，制備了一種插入滅活的LPXTG-p5突變體。使用在引物上分別添加SalI、KpnI、KpnI和EcoRI限制酶切位點的基因特異性引物，通過PCR擴增LPXTGp5開放閱讀框的1kb 5′和3′側翼區，構建一種用于破壞LPXTGp5的質粒。PCR產物用SalI-KpnI和KpnI-EcoRI酶切，克隆到用SalI-EcoRI酶切的pAUL-A載體中，在大腸桿菌DH10B中產生質粒pAUL-AD。使用摻入KpnI限制位點的MOL1317和MOL1318引物，由pDG1513擴增1.5kb四環素抗性盒。含有四環素抗性盒的KpnI片段去磷酸化，克隆到去磷酸化的pAUL-AD的KpnI位點內，在大腸桿菌DH10B中產生pAD02。通過電穿孔用pAD02的質粒DNA(50μg)轉化金黃色葡萄球菌RN4220，在質粒復制的許可溫度(30℃)下鑒定紅霉素抗性轉化子。通過將溫度轉變為42℃選擇單交換Campbell-型染色體插入，而在四環素上篩選。使用LPXTGp5內部引物通過PCR證實克隆02中滅活的和完整拷貝的LPXTGp5的存在。02的噬菌體裂解物由Φ11原種制備，轉導金黃色葡萄球菌8325-4，在四環素平板上篩選。檢測所有回收的轉導子的紅霉素和林可霉素敏感性。使用LPXTGp5內部引物通過PCR證實，并且用四環素和LPXTGp5 N端片段作為探針通過Southern印跡分析證實LPXTGp5∷Tc標記向這些轉導子47之一的金黃色葡萄球菌染色體內的成功整合。Southern印跡法按照標準程序進行，按照廠商說明用PCRIDG探針合成試劑盒(Roche)制備的DNA探針發出信號。簡言之，在轉移后，膜在高嚴格條件下預雜交和雜交(DIG Easy Hyb溶液，42℃)。用低嚴格緩沖液(2×SSC+0.1％SDS)洗滌兩次，用高嚴格緩沖液(0.5×SSC+0.1％SDS)洗滌兩次。這些雜交條件可以檢測與根據試劑盒所帶廠商手冊的探針＞80％同源性的基因。Southern印跡分析證實野生型株中存在LPXTGp5基因，而在敲除株中不存在。在這些條件下，探針也檢測一條在兩個菌株中都存在的對應于LPXTGp6的帶。
實施例7HarA偏好結合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物觸珠蛋白的主要生理作用是復合血漿中的細胞外血紅蛋白。假定該相互作用有極高的親和力，觸珠蛋白捕獲釋放的血紅蛋白幾乎是同時發生。為了解決當HarA與血紅蛋白結合時是否能夠識別觸珠蛋白為一種配體的問題，我們使用rHarA以及HarA-D1和HarA-D2結構域蛋白進行了體外結合研究。在這些測定中，通過包被ELISA板固定蛋白質，然后加入含量逐漸提高的觸珠蛋白、觸珠蛋白-血紅蛋白復合物和血紅蛋白，用抗觸珠蛋白或抗血紅蛋白單克隆抗體檢測信號。觸珠蛋白與血紅蛋白之間有效復合物的形成通過非變性凝膠分析證實(圖14A)。通過比較相同摩爾含量的不同配體產生的信號強度，我們檢測到觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的結合顯著高于觸珠蛋白。在低配體濃度下較高水平的結合暗示較高的親和相互作用，使用全長HarA以及結構域蛋白質是明顯的(圖14B和C，上圖)。重要的是，增強的復合物的結合不是HarA結構域與血紅蛋白高親和力相互作用的結果，盡管我們也能夠證明Hb的直接結合(圖14C，下圖)。當我們使用配體蛋白包被并且使用GST標記結構域蛋白檢測時，在結合測定中獲得非常相同的結果(數據未顯示)。這些數據提示，觸珠蛋白和血紅蛋白都能夠被HarA結構域識別為結合配偶體，其親和力低于Hp-Hb復合物。然而，假定血漿中游離血紅蛋白的濃度極低，生理相關的相互作用似乎介于HarA與觸珠蛋白-血紅蛋白復合物之間，以及與豐富的觸珠蛋白之間。
圖例圖1(A)LPXTGp5是一種典型的革蘭氏陽性細胞壁蛋白質，在N端含有信號肽(SP)，在C端含有胞外域和LPXTG細胞分類信號，之后是一個疏水距膜域(TM)和帶正電的尾(++)。在該蛋白質的細胞外部分內鑒定了兩個高度同源的結構域(D1、D2)。(B)顯示了LPXTGp5/SA1552/結構域與其它金黃色葡萄球菌蛋白質LPXTGp6/SA0976/和LPXTGp7/SA0977/之間二級結構的相似性。
圖2(A)重組LPXTGp5的考馬斯藍染色的10％SDS-PAGE凝膠。第1道——分子量標準，第2道——BSA(2mg/mL)，第3道——BSA(1mg/mL)，第4道——LPXTGp5。(B)重組LPXTGp5與分離的抗LPXTGp5抗體的免疫印跡。(C)用ELISA測定的人血清抗LPXTGp5抗體滴度(上圖)與rLPXTGp5的免疫印跡信號(下圖)相比較。
圖3利用標準ELISA測定的健康供體(實心灰色圓形)和金黃色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，創傷感染——實心正方形，其它感染——實心三角形)的抗LPXTGp5 IgG滴度。
圖4利用標準ELISA測定的健康非攜帶者(灰色實心圓形)、鼻攜帶者(黑色實心圓形)和金黃色葡萄球菌感染患者(血液感染——空心菱形，創傷感染——實心正方形，其它感染——實心三角形)的抗D1(A)和抗D2(B)IgG抗體滴度。
圖5考馬斯藍染色的2D電泳凝膠。IgG耗盡的人血漿與20μg重組LPXTGp5蛋白結合。特異性結合配偶體用100μl樣品緩沖液-9M尿素，4％CHAPS，100mM DTT，0.5％SDS洗脫。與LPXTGp5結合的血漿蛋白質偶聯Stretpactin瓊脂糖(A)、單獨的Streptactin瓊脂糖(B)、純化的StrepII標記的rLPXTGp5(C)，IgG耗盡的人血漿(D)。
圖6將在RPMI中生長至對數期的8325-4 spa-細胞的金黃色葡萄球菌裂解物加到通過將生物素標記的觸珠蛋白固定到鏈霉抗生物素蛋白基質上制成的親和柱上。裂解蛋白質與鏈霉抗生物素蛋白珠的非特異性結合被認為是背景(第4道)。使用人抗LPXTGp5抗體的免疫印跡顯示，從Hp-鏈霉抗生物素蛋白柱上洗脫的天然LPXTGp5(第3道)是觸珠蛋白的一種結合配偶體。用重組LPXTGp5(第1道)和金黃色葡萄球菌8325-4spa-裂解物(第2道)作為免疫印跡的陽性對照。
圖7金黃色葡萄球菌野生型(8325-4)株在RPMI 1640或腦心浸液(BHI)培養基中培養，生長到所述的OD600nm。通過溶葡萄球菌素消化和超聲處理制備總細菌裂解物。20μg總蛋白質加樣到7.5％聚丙酰胺凝膠上。利用半干系統將電泳分離的蛋白質轉移到Hybond ECL膜上。該膜用親和純化的人抗LPXTGp5 IgG探針雜交，用ECL檢測系統檢測信號。
圖8(A)已知的Fur盒核苷酸序列與推斷的位于LPXTGp5基因上游的Fur盒的比較。(B)在不同培養基(RPMI、RPMI+FeCl3)上培養后，從野生型8325-4(wt)和fur突變(fur-)株分離的金黃色葡萄球菌總裂解物的免疫印跡分析。將10μg總蛋白質加樣到7.5％聚丙烯酰胺凝膠上。利用半干系統將電泳分離的蛋白質轉移到ECL膜上。該膜用親和純化的抗LPXTGp5 IgG探針雜交，用ECL檢測系統檢測信號。
圖9在基于ELISA的測定中進行觸珠蛋白與GST-D1和GST-D2的結合。Polysorb ELISA板用觸珠蛋白包被，然后加入濃度逐漸增加的GST-D1、GST-D2和單獨的GST作為陰性對照。用生物素標記的抗GST mAb和鏈霉抗生物素蛋白-HRPO檢測特異性信號。
圖10利用基于FACS的測定法檢測觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌細胞的結合。生物素標記的Hp(30μg、12.5μg、5μg)與在RPMI(A，C)或補充25μM FeCl3的RPMI(B，D)中培養的5×106金黃色葡萄球菌野生型8325-4株(A，B)或fur-(C，D)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后，加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。對照細胞的熒光強度(灰色)與結合30μg Hp(1)、12.5μg Hp(2)和5μg Hp(3)的細胞的熒光相比較。
圖11利用基于FACS的測定法檢測觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌細胞的結合。12.5μg單獨的生物素標記的Hp(1)或與9倍摩爾過量的D1-GST(2)或與GST(2)的復合物與在RPMI中生長的5×106金黃色葡萄球菌細胞(野生型8325-4株)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。
圖12利用基于FACS的測定比較觸珠蛋白與金黃色葡萄球菌8325-4野生型株(wt)、LPXTGp5敲除株(LPXTGp5 KO)的結合。生物素標記的Hp(20μg，，5μg)或與在RPMI(A，C，D)或在補充25μM FeCl3的RPMI(B)中生長的5×106金黃色葡萄球菌細胞(野生型8325-4株)(A，B)、LPXTGp5 KO(C)或fur-(D)在室溫下溫育30分鐘。洗滌后加入鏈霉抗生物素蛋白-FITC，在室溫下30分鐘，然后用2％Pfa固定細胞，用FACScan分析樣品。對照細胞的熒光強度(灰色)與結合20μg Hp(1)和5μg Hp(2)的細胞的熒光相比較。
圖13在含有不同鐵源的培養基中的生長率。金黃色葡萄球菌野生型8325-4細胞在耗盡鐵的RPMI培養基(空心圓形)或重新補充25mMFeCl3的培養基(實心圓形)中培養，含有1mM Hp(空心三角形，虛線)，含有0.5mM Hb(實心三角形，虛線)，含有Hp∶Hb復合物(空心三角形，實線)。在指定的時間點，測量細菌培養物的OD600nm。
圖14 HarA結合觸珠蛋白-血紅蛋白復合物。A.通過觸珠蛋白(Hp)和血紅蛋白(Hb)以1∶1的摩爾比溫育，形成觸珠蛋白-血紅蛋白復合物(Hp-Hb)，用CBB染色的非變性PAGE凝膠顯示。B.在基于ELISA的測定中，將純化的觸珠蛋白(●)和血紅蛋白(■)的結合與觸珠蛋白-血紅蛋白復合物的結合(▲)相比較，其中使用重組HarA作為包被試劑，抗觸珠蛋白mAb作為檢測試劑。C.GST-D1(填充的符號)和GST-D2(空心符號)蛋白質包被ELISA板，以逐漸升高的含量添加Hp、Hb和Hp-Hb復合物(如B所示)。用單克隆抗觸珠蛋白(上圖)或抗血紅蛋白抗體(下圖)檢測信號。
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序列表<110>Intercell AG<120>治療葡萄球菌感染的藥物<130>R 41506<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2685<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>1atgaacaaac atcacccaaa attaaggtct ttctattcta ttagaaaatc aactctaggc 60gttgcatcgg tcattgtcag tacactattt ttaattactt ctcaacatca agcacaagca120gcagaaaata caaatacttc agataaaatc tcggaaaatc aaaataataa tgcaactaca180actcagccac ctaaggatac aaatcaaaca caacctgcta cgcaaccagc aaacactgcg240aaaaactatc ctgcagcgga tgaatcactt aaagatgcaa ttaaagatcc tgcattagaa300aataaagaac atgatatagg tccaagagaa caagtcaatt tccagttatt agataaaaac360aatgaaacgc agtactatca ctttttcagc atcaaagatc cagcagatgt gtattacact420aaaaagaaag cagaagttga attagacatc aatactgctt caacatggaa gaagtttgaa480gtctatgaaa acaatcaaaa attgccagtg agacttgtat catatagtcc tgtaccagaa540gaccatgcct atattcgatt cccagtttca gatggcacac aagaattgaa aattgtttct600tcgactcaaa ttgatgatgg agaagaaaca aattatgatt atactaaatt agtatttgct660aaacctattt ataacgatcc ttcacttgta aaatcagata caaatgatgc agtagtaacg720aatgatcaat caagttcagt cgcaagtaat caaacaaaca cgaatacatc taatcaaaat780acatcaacga tcaacaatgc taataatcaa ccgcaggcaa cgaccaatat gagtcaacct840
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<210>2<211>895<212>PRT<213>金黃色葡萄球菌<400>2Met Asn Lys His His Pro Lys Leu Arg Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys1 5 10 15Ser Thr Leu Gly Val Ala Ser Val Ile Val Ser Thr Leu Phe Leu Ile20 25 30Thr Ser Gln His Gln Ala Gln Ala Ala Glu Asn Thr Asn Thr Ser Asp35 40 45Lys Ile Ser Glu Asn Gln Asn Asn Asn Ala Thr Thr Thr Gln Pro Pro50 55 60Lys Asp Thr Asn Gln Thr Gln Pro Ala Thr Gln Pro Ala Asn Thr Ala65 70 75 80Lys Asn Tyr Rro Ala Ala Asp Glu Ser Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp85 90 95Pro Ala Leu Glu Asn Lys Glu His Asp Ile Gly Pro Arg Glu Gln Val100 105 110Asn Phe Gln Leu Leu Asp Lys Asn Asn Glu Thr Gln Tyr Tyr His Phe115 120 125Phe Ser Ile Lys Asp Pro Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Lys Lys Lys Ala130 135 140Glu Val Glu Leu Asp Ile Asn Thr Ala Ser Thr Trp Lys Lys Phe Glu145 150 155 160Val Tyr Glu Asn Asn Gln Lys Leu Pro Val Arg Leu Val Ser Tyr Ser165 170 175Pro Val Pro Glu Asp His Ala Tyr Ile Arg Phe Pro Val Ser Asp Gly180 185 190
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權利要求
1.與觸珠蛋白受體或配體結合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于所述分子破壞觸珠蛋白受體配體結合。
3.根據權利要求1或2的用途，其特征在于所述分子選自觸珠蛋白受體抗體，與根據SEQ ID No.2的肽結合的觸珠蛋白模擬位，其它的觸珠蛋白受體，或其片段。
4.根據權利要求3的用途，其特征在于觸珠蛋白受體抗體或觸珠蛋白模擬位結合于一種選自SEQ ID No.4或SEQ ID No.6或其片段的肽。
5.根據權利要求1或2的用途，其特征在于所述分子是一種反義核酸，它結合觸珠蛋白受體基因或觸珠蛋白受體基因表達的調節元件，特別是根據SEQ ID No.7的Fur盒。
6.根據權利要求5的用途，其特征在于所述分子是一種抑制化合物，它結合根據SEQ ID No.7的Fur盒。
7.一種核酸分子，它在嚴格條件下可與具有根據SEQ ID No.7的序列的核酸分子雜交。
8.分離的多核苷酸，其含有選自SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的核酸序列。
9.分離的多肽，其含有選自SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的多肽序列。
10.合成偶聯物，其含有根據SEQ ID No.4的肽，該肽通過非天然存在的接頭與根據SEQ ID No.6的肽連接。
11.根據權利要求10的合成偶聯物，其特征在于所述非天然存在的接頭是多肽。
12.分離與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-在固體表面上提供觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段，-使標記的觸珠蛋白結合于該固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段，形成固定的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段與標記的觸珠蛋白的復合物，-使這種復合物接觸含有候選分子的庫，-確定該庫中替代該復合物中的標記觸珠蛋白的分子，和-分離替代該復合物中所述標記觸珠蛋白的所述分子。
13.分離與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-提供固定于固體表面上的觸珠蛋白，-使標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段與所述固定的觸珠蛋白結合，形成固定的觸珠蛋白與標記的觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段的復合物，-使該復合物接觸含有候選分子的庫，-確定該庫中替代該復合物中的標記觸珠蛋白受體多肽或其觸珠蛋白結合片段，并與固定的觸珠蛋白結合的分子，-分離該庫中與固定的觸珠蛋白結合的所述分子。
14.分離與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子的方法，其特征在于下列步驟-提供候選分子庫，-從該庫中提取并分離與固定的觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結合片段結合的分子，-從該庫中提取并分離與固定的觸珠蛋白結合的分子，-使其余的候選分子庫接觸觸珠蛋白與觸珠蛋白受體或其觸珠蛋白結合片段形成的固定的復合物，-分離與所述固定的復合物結合的分子。
15.根據權利要求12-14中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白結合片段選自SEQ ID No.4、SEQ ID No.6及其片段，或這些片段的組合。
16.根據權利要求12-15中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白受體是金黃色葡萄球菌觸珠蛋白受體。
17.根據權利要求12-16中任何一項的方法，其特征在于所述觸珠蛋白是人觸珠蛋白。
全文摘要
本發明提供可與觸珠蛋白受體配體結合相互作用的分子在制備預防和治療葡萄球菌感染的藥物中的用途。
文檔編號C07K14/31GK1649626SQ03809474
公開日2005年8月3日 申請日期2003年6月18日 優先權日2002年10月3日
發明者E·納吉, A·德拉, D·蓋爾曼 申請人:英特塞爾股份公司