專利名稱：體內篩選法得到的肝癌組織特異性粘附肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤導向治療中的導向肽以及該導向肽的應用，尤其是涉及一種能特異性結合肝癌組織/細胞的粘附肽以及該粘附肽的應用，屬于分子藥理學技術領域。
背景技術：
肝癌作為一種最常見的惡性腫瘤對人類健康造成了極大的威脅，據估計，全世界每年死于肝癌的患者達125萬。目前用于肝癌治療的方法主要有手術療法、放射療法和化學療法等，但這些方法對人體的健康組織和器官都存在不同程度副作用。
導向治療技術為腫瘤的治療開辟了廣闊的前景。腫瘤導向治療是指應用針對腫瘤特異性或相關抗原的單克隆抗體與殺傷腫瘤細胞的活性物質如化療藥物、毒素、放射性核素等相偶聯，將活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，定向殺傷腫瘤細胞的方法。腫瘤導向治療作為近年來興起的第四種腫瘤療法即生物治療法中的重要組成部分而受到了人們很大的重視。
關于利用噬菌體肽庫技術對腫瘤組織特異性粘附肽的篩選，1996年Pasqualinii和Ruoslahti首先在Nature上報道了該方法，并且利用該方法篩選出了特異結合腦和腎的噬菌體結合肽。1997年他們成功篩選到一條對惡性黑素瘤和乳腺癌組織上的αv整合素特異性親和的包含RGD的短肽，其與腫瘤細胞結合的特異性較與腦和腎正常組織結合高20倍以上；到目前為止，人們已發現多條特異性親和人腫瘤血管的短肽，如RGD_4C，CNGRC，GSL，SMSIARL，CPGPEGAGC等，前述的兩條短肽已在動物身上進行了抗腫瘤活性測定，抗癌效果良好。
在導向治療中非常關鍵的在于如何篩選得到具有很強特異性的導向肽，目前噬菌體肽庫技術是一種比較有效的篩選方法。噬菌體肽庫技術自20世紀90年代誕生以來給探索生物大分子間相互作用的結合位點、尋找高親和力生物活性的配體分子以及給藥物篩選、新型診斷試劑和疫苗等領域的研究帶來了革命，其最大優點就是無需知道蛋白質的任何性質，就可篩選到特異性的結合肽，因而方法方便快速有效。目前用噬菌體肽庫技術篩選導向肽分為體內篩選和體外篩選兩種。體內篩選法尤其在篩選組織或腫瘤組織特異性結合肽時有其明顯的優越性其一，噬菌體肽庫進入機體的血液系統，在血液循環過程中可以去除大量與靶組織無關的噬菌體肽，經過多次重復操作后可以得到所需的組織或腫瘤特異性結合肽，其原理是不同的組織都有其特異細胞膜標志，如淋巴細胞的歸巢、腫瘤細胞定向轉移等；其二，在體內篩選到的是自然狀態下的組織或腫瘤特異性結合肽，這在診斷和導向治療中更有使用價值；其三，用體內篩選法經常能篩選到與腫瘤新生血管特異性結合的多肽，而腫瘤新生血管壁上存在著正常血管所沒有或很少有的粘附分子，這些分子與腫瘤抗原相比其異質性和調變要少得多，也無需克服腫瘤的生物屏障，因此作為導向治療的“彈頭”有更多的優越性。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能特異性結合肝癌組織/細胞粘附肽；本發明的另一目的在于提供該肝癌組織/細胞粘附肽的用途。
本發明提供的肝癌組織/細胞粘附肽，其多肽序列為序列一NH2-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH序列二NH2-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH序列三NH2-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH為得到上述肝癌組織/細胞粘附肽，本發明采取體內篩選方法。為了避免反向吸收所造成的隨機肽庫的多樣性損失，我們采用了直接用原庫進行篩選的方法。我們將噬菌體隨機12肽文庫通過尾靜脈注射輸入到荷瘤裸鼠體內，經過血液循環后，回收結合于肝癌組織上或被肝癌細胞內吞的噬菌體肽，并感染大腸桿菌ER2738細胞，震蕩培養過夜，收集和純化噬菌體，同時測定其回收效價和擴增后的效價。該噬菌體即為經第一輪篩選得到的初步與肝癌組織和細胞結合的噬菌體肽，擴增后作為第二輪篩選的起始物。在此基礎上進行第三輪的篩選，從肝癌組織回收得到與肝癌組織結合特異性強、親和力高的噬菌體多肽。與此同時裸鼠體內的不同組織也被分別保留，冰凍切片后進行免疫組化分析，作為篩選效果分析參考指標。將第三輪篩選的噬菌體單克隆化，用細胞ELISA的方法對單克隆化的噬菌體進行鑒定，以正常肝細胞作為陰性對照。得到的陽性克隆的噬菌體純化后回輸到荷瘤裸鼠體內，用免疫組化的方法來測定其組織分布特異性，驗證其導向效果，并對陽性克隆進行了序列分析，得到本發明的兩種多肽序列。
本發明還提供序列一NH2-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH、序列二NH2-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH和序列三NH2-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH的肝癌組織/細胞特異性粘附肽在制備肝癌的導向藥物中的應用。
本發明提供的肝癌組織/細胞粘附肽導向效果好，組織分布特異性強，是一個很好的肝癌導向治療中的粘附肽，具有較廣闊的應用前景。
具體實施例方式
在說明具體實施方式
前，先對本發明要用到的材料和試劑以及試劑的配置進行簡單的說明
試驗材料與試劑(一)試劑1.噬菌體隨機12-肽文庫，購自美國New England Biolab公司2.人正常肝細胞L-02購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的細胞庫3.人肝癌細胞BEL-7402購自中國科學院上海藥物研究所4.兔抗噬菌體M13抗血清、辣根過氧化物酶標記的抗M13單克隆抗體購自瑞典Pharmacia公司。
5.辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-羊抗兔IgG)、碘化丙錠(PI)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯苯胺(DAB)等購自美國SIGMA公司6.酵母提取物Yeast Extract、蛋白胨Proteous Peptone購自英國OXOID公司7.RPMI-1640干粉劑、新生小牛血清購自美國GIBCO公司8.二甲基亞砜購自德國SERVA公司9.胰蛋白酶由Difco進口分裝10.異硫氰酸熒光黃(FITC標記的山羊抗兔IgG)購自華美公司11.IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，X-gal購自華美公司)(二)試劑的配制培養基1、菌ER2738的LB培養基(1)LB液體培養基蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract)5g/L、NaCl5g/L，加入適量的dH2O充分溶解后，用1N的NaOH將pH值調到7.0-7.5之間，最后用dH2O定容至1L，分裝后高壓滅菌。
(2)LB固體培養基上述分裝好的液體培養基加入1.5％的瓊脂糖后再進行高壓滅菌即可。
(3)LB選擇培養基將高壓滅菌后的LB固體培養基加熱完全溶解，待到冷卻至50℃左右時加入四環素、IPTG、X-gal，小心搖動三角燒瓶充分混勻，注意掌握時間在培養基凝固之前澆制平板。
抗生素的配制四環素儲備液的配制四環素(tetracycline)1000×用50％乙醇溶解20mg/ml，-20℃避光保存。
(4)軟瓊脂蛋白胨(Bacto-Tyrptone)10g/L、酵母粉(Yeast Extract)5g/L；NaCl，5g/L；MgCl·6H2O，1g/L；瓊脂7g/L；2.細胞培養基(1)RPMI1640培養基基本培養基
800ml的三蒸水中加入RPMl-1640干粉劑溶解，加入2g NaHCO3，溶解后定容至1000ml。5％NaHCO3調節pH至7.0，0.22um過濾除菌，-20℃保存。
完全培養基基本培養基90％；56℃滅活30min的新生小牛血清10％；雙抗100單位/ml，用時配制，4℃保存。
(2)D-hank’s母液(10×)NaCl 10g、KCl 0.4g、KH2PO40.06g、Na2HPO40.12g、加三蒸水，定容到100ml，配好后，用5％NaHCO3調pH至7.0左右，高壓滅菌，4℃保存。
(3)胰蛋白酶消化液稱250mg胰蛋白酶(1250，Difco進口分裝)粉末于燒杯中，加入D-Hanks液至100ml，攪拌均勻，置室溫4hr或4℃過夜，經常振搖使其完全溶解。用0.22um的微孔濾膜過濾除菌，分裝，每只1ml，-20℃保存。臨用前解凍，不宜反復凍融。
(4)雙抗高溫高壓滅菌D-Hanks液，用5ml無菌D-Hanks溶解80萬單位的青霉素鈉，吸取5ml；另用5ml無菌D-Hanks溶解100萬單位的硫酸鏈霉素，吸取4ml，補充無菌D-Hanks至80ml，-20℃保存。
(5)細胞凍存液基本培養基70％、小牛血清20％、二甲基亞砜(DMSO)10％噬菌體純化、DNA提取試劑配制(1)PEG-NaClPEG8000，100g；NaCl，116.9g；加蒸餾水定容到475ml攪拌溶解(可以加熱至65℃)，高壓滅菌，終體積應為600ml，4℃避光保存(2)TBS1M Tris-HCl(pH7.5)5ml；NaCl 0.9g；加dH2O至100ml高壓滅菌(3)NaI緩沖液1M Tris-HCl Ph8.0-1mM EDTA-4M NaCl，室溫避光保存ELISA試劑配制(1)洗板液10×pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)NaCl，80g；KH2PO4，2g；Na2HPO4·12H2O29g；KCL 2g，加dH2O定容至1000ml。
洗板液PBST05和PBST5PBST05pH7.4 PBS，0.05％Tween 20PBST5pH7.4 PBS，0.5％Tween 20(2)封阻液3％BSA0.3g BSA，溶解于10ml PBST05(3)固定液4％多聚甲醛40g多聚甲醛，1000mlPBS，加熱溶解(4)OPD底物緩沖液(PCS)檸檬酸4.66g；Na2HPO4·12H2O 18.4g；dH2O加至1000ml，于4℃保存。
(5)OPD底物顯色液PCS 9ml、30％過氧化氫10μl、OPD 4mg(6)酶終止液2M H2SO4
2.2.4熒光染色液100ug/ml；TritonX-100，0.1％；檸檬酸三鈉0.1％篩選前期的準備工作1.肝癌細胞及正常肝細胞的體外培養肝癌細胞BEL-7402；正常肝細胞L-02均在含1％雙抗、10％小牛血清的RPMI-1640完全培養基中，在37℃，5％CO2條件下傳代培養。傳代時采用0.25％胰蛋白酶消化，于-70℃冰箱中冷凍保存。
2.荷瘤裸鼠動物模型的建立及飼養與中科院實驗動物中心合作完成肝癌細胞株BEL-7402荷瘤裸鼠動物模型的建立。方法是采用2周齡裸鼠，腋下注射200μl約106個腫瘤細胞BEL-7402。4-6周后選用腫瘤直徑達到1cm左右的荷瘤裸鼠進行體內篩選或體內鑒定。
本發明的噬菌體的擴增及效價測定采用如下方法噬菌體的擴增在含有四環素抗性的LB中過夜培養大腸桿菌ER2738，次日按照1∶10稀釋后，37℃、230rpm劇烈振蕩50min制備成感受態細菌。轉入待擴增噬菌體克隆后37℃、230rpm劇烈振蕩4.5～5小時。培養物4℃8000rpm離心15分鐘去除菌體，取上清夜加入1/6體積的PEG-NaCl充分混合后置于4℃下沉淀過夜。沉淀過夜后溶液于4℃ 10000rpm離心20分鐘。棄上清，加入TBS 1ml充分溶解，4℃ 10000rpm離心10分鐘以去除剩余的菌體，將上清夜轉入到另一干凈的小離心管中，加入200μl PEG-NaCl后充分混合，4℃沉淀1小時，4℃ 10000rpm離心后200μl TBS溶液溶解，60℃水浴中恒溫20分鐘。加入0.7％二甲基亞砜與0.02％疊氮化鈉-70℃保存。
噬菌體效價測定按一定比例稀釋待測噬菌體，取10μl稀釋后噬菌體懸液與200μl感受態細菌充分混合后靜置3-5分鐘，與3ml頂層瓊脂混和后迅速倒入37℃保溫的IPTG/X-Gal平板，待冷卻后37℃倒置培養過夜。次日對平板上藍斑進行計數，按照以下公式計算效價效價＝y×10x×102TU/ml，(其中10x代表稀釋度。y代表平板上藍斑數目)下面結合實施例詳細說明具體的篩選步驟1、噬菌體隨機肽庫的活體篩選挑選腫瘤直徑1cm左右的荷瘤裸鼠用乙醚麻醉后，將1011的噬菌體肽庫靜脈注射入荷瘤裸鼠體內，15分鐘后用生理鹽水對小鼠進行心臟灌流，洗去全身血液，至各組織器官顏色變白。取部分腫瘤組織，回收噬菌體。測效價并擴增純化。用4％多聚甲醛灌流固定各器官和腫瘤組織至組織全部變硬，再在離體條件下浸泡于4％多聚甲醛。24小時后換30％蔗糖浸泡。于-70℃冰箱保存，免疫組化備用。
2、將回收的噬菌體，再一次靜脈注射入荷瘤裸鼠體內，方法和第一步相同，照此方法進行3輪篩選。
3、噬菌體的單克隆化選取最后一次篩選測效價平板中藍斑數目介于10～100之間的平板，用滅菌牙簽挑取單個藍斑，隨即放入含有1ml感受態細胞的15ml指管中，37℃、230rpm劇烈振蕩4.5～5小時。培養物經PEG-NaCl純化后保存并測序。
4、免疫組化方法鑒定體內篩選結果采用間接免疫酶組織化學法對裸鼠篩選的結果加以鑒定，以期觀察各輪篩選過程中噬菌體肽在體內與腫瘤的特異性結合情況。將修剪好的組織塊從-70℃低溫冰箱中迅速移至冰凍切片機內，在冰凍狀態下切片，組織片厚度8-10um。直接貼片于涂有粘片劑的載玻片上。冷丙酮固定3％過氧化氫甲醇混合液室溫處理30分鐘，5％脫脂奶粉37℃封阻，噬菌體M13抗血清4℃孵育過夜，酶標二抗(HRP標記的羊抗兔IgG，37℃孵育2小時。DAB顯色，水洗終止顯色反應，再染色觀察。發現與腫瘤細胞特異結合的噬菌體肽得到了高水平的富集，其余組織的非特異性吸附現象降至最低。
5.用細胞ELISA法鑒定篩選選擇生長狀態良好的細胞，把人肝癌細胞BEL-740和人肝臟細胞L-02分別消化下來，記數后將細胞懸液濃度調至5×105cells/ml。分別加入96孔細胞培養板(1)使培養板上下兩個孔分別對應相同濃度的肝癌細胞和正常肝細胞；(2)細胞板每孔加100μl細胞懸濁液，37℃細胞培養箱中過夜，使細胞貼壁。D-Hanks緩沖液清洗細胞后無血清培養基培養1小時；(3)D-Hanks緩沖液清洗細胞后3％多聚甲醛固定1小時，每孔加封阻液(PBST05-3％BSA)100μl，37℃封阻1小時；(4)洗板，即細胞板去上清液，每孔加PBST05 100μl，反復3次。再每孔加PBST5100μl清洗2次；(5)每孔加噬菌體單克隆，并留一孔不加噬菌體作空白對照。在37℃溫育1小時(6)每孔加一抗(兔抗噬菌體M13抗血清，1∶1000PBST05-1％BSA稀釋)100μl，37℃溫育2小時，洗板(7)每孔加二抗(羊抗兔酶標抗體，1∶10000PBST05-1％BSA稀釋)，100μl，37℃溫育1小時，洗板(8)每孔加OPD底物顯色液，振蕩顯色(9)待反應完全后加入終止液，每孔加酶終止液，終止顯色(10)細胞板3000rpm離心3分鐘，將每孔中的上清顯色液以在細胞板上同樣位置轉移到酶標板中，酶標儀490nm波長讀數。從中挑選較高值的噬菌體。同時做空白對照及野生型噬菌體對照。
本次篩選我們采用線性12肽進行了三輪體內篩選，篩選結束后將目標噬菌體單克隆化后隨機挑取24個單克隆進行擴增、純化。分別取等量噬菌體單克隆(1011)進行細胞ELISA的篩選和鑒定即將等量體外培養的肝癌細胞BEL-7402和正常人肝臟細胞株L-02分別加入96孔細胞培養板中，使細胞貼壁并固定；將等量的目標噬菌體肽分別與肝癌細胞和正常肝細胞反應后，用免疫酶技術顯色，酶標儀讀取每個反應孔的OD490nm值了。
按下列公式計算每個目標噬菌體肽的特異結合系數 6.目標噬菌體在體內的導向效果的體內鑒定經過三輪體內篩選后，將所得的噬菌體單克隆做細胞水平上的體外鑒定。綜合ELISA特異結合系數和單克隆的序列分析，本發明選取三個噬菌體單克隆進行體內的導向鑒定。通過荷瘤裸鼠的尾靜脈注射回輸到裸鼠體內，對裸鼠進行心臟灌流，隨后取其肝及肝癌組織進行組織冰凍切片，行免疫組織化學觀察。
(1)將修剪好的組織塊從-70℃低溫冰箱中迅速移至冰凍切片機內，調整切片機的溫度在-14℃左右；(2)在冰凍狀態下切片，組織片厚度8-10um。直接貼片于涂有粘片劑的載玻片上，PBST05清洗，冷丙酮固定10分鐘，PBST05洗3遍；(3)用3％過氧化氫甲醇混合液室溫處理30分鐘，PBST05洗3遍，用5％脫脂奶粉37℃封阻1小時。
(4)用噬菌體M13抗血清，4℃孵育過夜，PBST05洗3遍；(5)用酶標二抗(HRP標記的羊抗兔IgG，效價1∶500)，37℃孵育2小時，用PBST05洗3遍；(6)DAB顯色，室溫下放置10分鐘，隨時鏡檢，水洗終止顯色反應，進行染色，蘇木素染色，最后用中性樹脂封片觀察。
結果顯示腫瘤組織結合了大量噬菌體，心、脾、肺、腦、腎五種正常組織未與噬菌體結合。肝組織上雖也結合了一些噬菌體，但比腫瘤組織少。由于肝臟組織中存在豐富的網狀內膜系統，從而產生非特異性的吸附作用，與噬菌體的特異結合無關。可見體內篩選得到的噬菌體展示肽在體內有很好的導向性。這些肽確實與肝癌細胞具有特異性的親和力。
7.噬菌體DNA的提取、測序將需要測序的噬菌體單克隆化擴增，離心取上清液500μl，加入200μlPEG/NaCL，反復顛倒至混勻，室溫靜置10分鐘，10000rpm離心去上清，然后低速離心，去除剩余上清。加100μl Iodide緩沖液將沉淀溶解，再加250μl無水乙醇室溫孵育10分鐘，這樣可以使單鏈的噬菌體DNA沉淀而溶解噬菌體蛋白，10000rpm離心去上清，用70％乙醇清洗沉淀，真空干燥，加30μl TE緩沖液溶解沉淀。樣品送華大基因上海鼎安生物科技有限公司測序，結果經GENGRUNNER、CLONE MANNAGER等軟件翻譯、分析，得到三種多肽序列序列一NH2-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH序列二NH2-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH序列三NH2-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH
權利要求
1.一種肝癌組織特異性粘附肽，其特征在于多肽序列為序列一NH2-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH序列二NH2-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH序列三NH2-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH
2.序列一NH2-A-G-K-G-T-P-S-L-E-T-T-P-COOH、序列二NH2-A-H-Q-A-N-F-P-S-S-S-A-I-COOH和序列三NH2-T-P-R-A-E-L-H-F-G-Q-S-S-COOH的肝癌組織特異性粘附肽在制備肝癌的導向藥物中的應用。
全文摘要
一種腫瘤導向治療中的能特異性結合肝癌組織/細胞的粘附肽以及該粘附肽的應用，屬于分子藥理學技術領域。本發明提供的三種肝癌組織/細胞的粘附肽的多肽序列為序列一NH
文檔編號C07K7/08GK1563077SQ200410017048
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優先權日2004年3月19日
發明者錢旻, 周忠良, 章平, 杜冰, 于靜, 郁萌 申請人:華東師范大學