專利名稱：利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法
技術領域：
本發明涉及一種去甲基雷帕霉素的制備方法。
背景技術：
雷帕霉素(Rapamycin ；西羅莫司，Sirolimus)是吸水鏈霉菌AY B-994和吸水鏈 霉菌FC904發酵產生的具有免疫抑制、抗真菌、抗增殖和抗腫瘤活性的大環內酯化合物(圖 1)，哺乳動物雷帕霉素靶位(mammalian target of rapamycin Cl，簡稱mTORCl)抑制劑。 已作為腎移植抗排斥藥物、預防和治療支架植入后冠狀動脈再狹窄的雷帕霉素涂層支架應 用于臨床；正作為抑制mTOR信號傳導途徑的抗腫瘤藥物(抗白血病、乳腺癌、胃癌、腸癌、肝 癌等)進行研究或臨床試驗；最新研究表明，雷帕霉素具有延長老齡小鼠生命周期的作用。作為mTORCl抑制劑雷帕霉素衍生物的化學半合成研究也取得成效。雷帕霉素 43位分別被乙二醇、乙氧基、四氮唑取代的半合成衍生物依維莫司(Everolimus，RAD001)、 比奧莫司(BiolimusA9)、Zotarolimus均已作為藥物支架的涂層應用于臨床。依維莫司、 替西羅莫司(Temsirolimus，CCI-779，43位被丙二酯取代)已由FDA分別于2007年8月 和2009年3月批準應用于晚期腎癌的治療，對其他癌癥的治療也已進入臨床試驗階段； Deforolimus(AP23573,43位由亞磷酸取代)抗癌作用已進入臨床試驗階段，如已完成肉瘤 III期、乳腺癌II期的臨床試驗。采用與本發明類似的技術獲得去甲基雷帕霉素的報道極為有限。游動放線 菌ATCC63771 (Actinoplanes sp. ATCC 63771)將雷帕霉素轉化為7_0_去甲基雷帕 霉素和42-0-去甲基雷帕霉素(US PATENT, 5849730，1998年12月15日)；鏈霉菌 NCIMB40515 (Streptomyces sp. NCIMB40515)轉化雷帕霉素為42-0-去甲基雷帕霉素；龜 裂鏈霉菌 ATCC 28893 (Streptomyces rimosus ATCC 28893)轉化雷帕霉素為 7_0_ 去甲 基雷帕霉素、29-0-去甲基雷帕霉素和42-0-去甲基雷帕霉素(Enzyme and Microbial Technology，21 :405 412，1997) ；Streptomyces toyocaensis ATCC 39471 轉化雷帕霄 素為 42-0-去甲基雷帕霉素(Journal of Antibiotics，48 :657 666，1995)。已報道 的對雷帕霉素具有轉化能力的微生物菌株還有Gliocladium celiquescens ATCC10097, Trichothecium roseum ATCC 12519、 Syncephalastrum nigricans ATCC 12266、 Syncephalastrum racemosus ATCC 1332B、Absidiaglauca ATCC 7852、Aspergillus alliaceus ATCC 10060>Cunninghame11a baineri ATCC 36252、Botrytis elliptica ATCC 11787、Cheatomium cochliodes ATCC 10195、Thamnidium elegansATCC 8997、Streptomyce aureofaciens ATCC 10762、Streptomyce lavandulae ATCC 55209、Nocardia asteroids ATCC 3318, Saccharopolyspora eythrea ATCC 1163、游動放線菌 ATCC53771、Bacillus subtilis ATCC 55060 (Enzyme and Microbial Technology，21 :405 412，1997)及游動 放線菌 ATCC 12065 (海峽藥學，20 98 101，2008)。
發明內容
本發明的目的在于提供更方便、環保、有效的去甲基雷帕霉素，特別是雙去甲基雷 帕霉素的制備方法。本發明的目的通過如下技術方案實現將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養基培養 后，再接入種子培養基培養，然后將種子培養液接入轉化培養基。待巨大芽孢桿菌在轉化培 養基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，經巨大芽孢桿菌對雷帕霉素的轉化，獲得巨大芽孢桿菌 轉化雷帕霉素的轉化液，轉化液中包含29，42-0-雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉 素及29-0-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。本發明的優點是采用微生物轉化技術制備雷帕霉素衍生物。該技術與采用化學 半合成技術進行雷帕霉素衍生物的制備相比具有對環境污染小、作用條件溫和、無需基團 保護等優點，并可通過對微生物及其轉化雷帕霉素條件的改良提高雷帕霉素衍生物的轉化 率。此外，采用化學半合成技術難以獲得的29，42-0-雙去甲基雷帕霉素，采用本發明可以 很容易獲得。
圖1是本發明采用的巨大芽孢桿菌的電子顯微鏡掃描圖。圖2是本發明采用的巨大芽孢桿菌的進化樹。
具體實施例方式本發明公開29，42-0-雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基 雷帕霉素的制備方法。本發明包含采用巨大芽孢桿菌，在雷帕霉素存在下微生物轉化雷帕 霉素合成上述3個雷帕霉素衍生物以及分離、純化獲得上述3個化合物的方法及HPLC檢測 方法。本發明公開的巨大芽孢桿菌系分離自福建省福州市土壤樣品中的微生物，經形態 特征、生理生化特性和16srDNA序列分析鑒定為巨大芽孢桿菌(表1，附圖1，2)。表1本發明采用的巨大芽孢桿菌的形態特征和生理生化特性 本發明公開利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其步驟如下(1)將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養基，生長pH5. 5 7. 5，生長溫度20 40°C， 生長時間15 24h ；(2)將斜面培養物接入種子培養基培養，pH6. 0 8. 0，培養溫度20 40°C，培養 時間一級種子15 24h，二級種子8 12h，種子培養過程搖瓶機轉速220rpm ；(3)將種子培養液接入轉化培養基。巨大芽孢桿菌在pH5. 0 6. 5，26 32 °C，搖 瓶機轉速220rpm條件下繁殖15 24h，加入轉化底物雷帕霉素。在上述條件下，巨大芽孢 桿菌轉化雷帕霉素48 96h，獲得巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液。轉化液包含29， 42-0-雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素 衍生物。本發明采用的巨大芽孢桿菌在營養瓊脂、沙保羅瓊脂及高氏1號瓊脂、精氨酸瓊 脂、ISP3瓊脂等培養基中均能生長，最適的瓊脂培養基為營養瓊脂；生長pH5. 5 8. 0，最適 生長pH6. 5 7. 5 ；生長溫度20 40°C，最適生長溫度28 37°C ；培養時間15 24h。能夠使巨大芽孢桿菌生長的培養基均可作為該菌株的種子培養基，如營養肉湯、 沙保羅液體培養基等。為了使轉化效率提高，可以使用與轉化培養基相同的培養基進行種 子培養(見下文)。種子培養過程采用的pH6. 0 8. 0，最適pH6. 5 7. 5 ；種子培養溫度 20 40°C，最適溫度28 35°C;種子培養時間一級種子15 24h，二級種子8 12h，種 子培養過程搖瓶機轉速220rpm ；移種量1 5%。巨大芽孢桿菌微生物轉化雷帕霉素在以碳、氮源及無機離子的有機培養基中進 行。碳源(2 5克/100毫升培養基)可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等任意一種或2 3種任意量(相互搭配的每種碳源使用數量不限，只要混合 后的總量在2-5克/100毫升培養基的范圍即可)搭配使用，最適的碳源為葡萄糖和可溶性 淀粉組合。氮源(0.5 2克/100毫升培養基)可以為黃豆粉、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母 粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、棉籽粉等任意一種或2 3種搭 任意量(相互搭配的每種氮源使用數量不限，只要混合后的總量在0. 5 2克/100毫升培 養基的范圍即可)搭配使用，最適氮源為酵母浸出物和蛋白胨組合。無機鹽(0. 1 0. 2克 /100毫升培養基)選擇硝酸鈉、硝酸鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化銨、硝酸銨、鉬酸銨、硫酸鋅、 硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等任意一種或2 3種 任意量(相互搭配的每種無機鹽使用數量不限，只要混合后的總量在0. 1 0. 2克/100毫 升培養基的范圍即可)搭配使用，最適無機鹽為磷酸氫二鉀和硫酸鎂組合。轉化過程采用 的pH5. 0 6. 5，最適pH5. 5 6. 0 ；轉化過程溫度26 32°C，最適溫度28 °C ；轉化過程使 用的的搖瓶機轉速為220rpm ；根據不同的培養基及培養條件，轉化時間48 96h。巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適種子和轉化培養基均為(克/1000毫升培養 基)可溶性淀粉24、葡萄糖1、蛋白胨3、酵母浸出汁粉3、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0. 5，pH自 然。在此培養基中，種子培養和巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適溫度均為28°C，搖瓶機轉 速220rpm ；種子培養最適pH6. 5 7. 5，一級種子培養時間15h，二級種子培養時間8h ；巨大 芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適PH5. 5 6. 0，巨大芽孢桿菌在轉化培養基中培養15h時加入 雷帕霉素，轉化時間64h。轉化底物雷帕霉素母液的溶解介質為二甲亞砜、甲醇、乙醇等；母液溶度20 10mg/ml，最適溶度15mg/ml ；轉化培養基中雷帕霉素的終濃度100 200 u g/ml (即轉化培 養基中雷帕霉素的濃度)，最適終濃度125 y g/ml。為提高巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的效率，在轉化培養基中可適當添加表面活性 劑0. 01 1克/100毫升培養基，如聚乙烯醇、水溶性維生素E、吐溫80、吐溫20、泊洛沙姆 等中的任意一種，最適濃度為0. 05 0. 2克/100毫升培養基。此外，也可采用雙水相系統， 如聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分別 與磷酸鹽組成的雙水相系統；聚乙二醇系列與聚乙烯吡咯烷酮組成的雙水相系統。聚乙二 醇濃度5 20克/100毫升培養基，最適濃度為10克/100毫升培養基；磷酸鹽濃度為1 3克/100毫升培養基，最適濃度為2克/100毫升培養基；聚乙烯吡咯烷酮濃度5 15克 /100毫升培養基，最適為10克/100毫升培養基。采用島津LC-2010CHT型號的高效液相色譜儀(HPLC)，全波長掃描，二甲基18碳硅 烷(ODS C18)色譜柱(5iim)，乙腈甲醇水(55 5 40)為流動相，在柱溫50°C、流速 lml/min的條件下，轉化液中3個去甲基雷帕霉素29，42_0_雙去甲基雷帕霉素、42_0_去 甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素與雷帕霉素的相對保留時間(RRT)分別為0.53、 0. 67和0. 76。該檢測方法可以將這3個去甲基雷帕霉素及它們與雷帕霉素很好地分離。巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素轉化液用乙酸乙酯以1 1 2體積比萃取2次，每 次20分鐘后，將萃取液50 55°C減壓濃縮至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50 55°C 減壓濃縮至干。從轉化液中將3個去甲基雷帕霉素分離開來，可以用葡聚糖凝膠LH-20為 填料進行柱層析，氯仿洗脫；也可用0DSC18反向硅膠為填料進行柱層析，乙腈/水系統洗 脫，出峰順序為29，42-0_雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素。通過上述柱層析，收集到的3個去甲基雷帕霉素純度均可達90%以上。接著，以硅膠 (300 400目)為填料，以丙酮/正己烷為流動相進行柱層析，獲得純度>98%的3個去 甲基雷帕霉素。通過波譜分析確證了 3個去甲基雷帕霉素的化學結構。本發明制得的29，42-0-雙去甲基雷帕霉素理化性質見表2，與雷帕霉素主要構型 的NMR譜化學位移對比見表3，確定的化學結構式如下所示。以下是與本發明有關的3個雷 帕霉素衍生物及雷帕霉素化學結構式。 雷帕霉素29，42-0-去雙甲基雷帕霉素29-0-去甲基雷帕霉素42-0-去雙甲基雷帕霉素表229，42-0-雙去甲基雷帕霉素的理化性質 表329，42-0-雙去甲基雷帕霉素與雷帕霉素主要構型的NMR化學位移對比(in CDC13) alH和13°C匪R分別在500MHz和125MHz進行檢測實例11、將牛奶冷凍保藏的巨大芽孢桿菌接入營養瓊脂斜面，35°C培養15h，斜面菌苔豐 滿，挑取_鉬環接入種子培養基(30ml/250ml三角瓶，克/1000毫升培養基)可溶性淀粉 24、葡萄糖1、酵母浸出汁粉3、蛋白胨3、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0.5，pH自然，28°C、220rpm 振蕩培養15h后，以2. 5 %的接種量接入種子培養基(80ml/500ml三角瓶，配方同上)， 28°C、220rpm振蕩培養8h后以相同接種量接入轉化培養基(60ml/500ml三角瓶，配方同 上)，28°C、220rpm振蕩培養15h，加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使終濃度為 125mg/ml。接著在相同溫度和轉速下進行雷帕霉素的轉化培養，64h轉化結束，收集轉化液。2、取轉化液，以轉化液乙酸乙酯(1 1)的比例萃取2次，每次20分鐘。收集 乙酯相，50°C減壓濃縮去除乙酯，加入乙醇溶解，采用島津LC-2010CHT HPLC檢測儀，全波長 掃描，0DSC185iim柱，乙腈甲醇水(55 5 40)為流動相，在柱溫50°C、流速lml/min 的條件下進行檢測，轉化液中3個去甲基雷帕霉素29，42-0-雙去甲基雷帕霉素、42-0-去 甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素與雷帕霉素的比例大致為9 10 6 19。3、5L轉化液用1. 5倍的乙酸乙酯全液萃取2次，每次10分鐘，50°C減壓濃縮乙酯 相后加入100ml丙酮溶解出脂溶性成分，4#砂芯漏斗過濾去除不溶物，50°C減壓濃縮。該 濃縮液重新用2倍體積的乙酸乙酯萃取，50°C減壓濃縮獲得3ml粗品。該粗品進行反向硅 膠柱層析(YMC-C18，50iim，2X60cm)，乙腈水(50 50 55 45V/V)梯度洗脫，HPLC 檢測，收集所需的組分。各組分層析液分別于50°C減壓濃縮，去除乙腈，水層用2倍乙酸乙 酯萃取2次，合并萃取液，50°C減壓濃縮。經過反向硅膠柱層析后，分別得到純度為92%的 29，42-0_雙去甲基雷帕霉素58mg(以雷帕霉素為標準品，外標法計算)，94%的42-0-去 甲基雷帕霉素78mg(以雷帕霉素為標準品，外標法計算)和91%的29-0-去甲基雷帕霉 素32mg(以雷帕霉素為標準品，外標法計算)。各組分濃縮液分別加入少量丙酮正己烷 (25 75)溶解，進行硅膠柱(300目)層析，丙酮正己烷(25 75 33 67V/V)梯度 洗脫，TLC和HPLC跟蹤檢測，收集所需組分，50°C減壓濃縮至干。最終獲得純度達96%的29,42-0-雙去甲基雷帕霉素36mg、純度達98%的42_0_去甲基雷帕霉素56mg，純度達95% 的29-0-去甲基雷帕霉素21mg。實例21、將牛奶冷凍保藏的巨大芽孢桿菌接入營養瓊脂斜面，28°C培養24h，斜面菌苔豐 滿，挑取_鉬環接入種子培養基(30ml/250ml三角瓶，克/1000毫升培養基)玉米淀粉30、 蔗糖10、黃豆粉10、蛋白胨2、氯化鈉1、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0. 5，pH自然，28°C、220rpm振 蕩培養24h，以3%的接種量接入轉化培養基(60ml/500ml三角瓶，配方同上)，28°C、220rpm 振蕩培養18h，加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使終濃度為125mg/ml。接著在 相同溫度和轉速下進行雷帕霉素的轉化培養，72h轉化結束，收集轉化液。2、取轉化液，以轉化液乙酸乙酯(1 1)的比例萃取2次，每次20分鐘。收 集乙酯相，50°C減壓濃縮去除乙酯，加入乙醇溶解，采用島津LC-2010CHT HPLC檢測儀， 全波長掃描，0DSC185iim柱，乙腈甲醇水(55 5 40)為流動相，在柱溫50°C、流 速lml/min的條件下進行HPLC檢測，轉化液中3個去甲基雷帕霉素29，42_0_雙去甲 基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素與雷帕霉素的比例大致為 6 10 6 26。實例31、將牛奶冷凍保藏的巨大芽孢桿菌接入營養瓊脂斜面，32°C培養18h，斜面菌苔豐 滿，挑取-鉬環接入種子培養基(30ml/250ml三角瓶，g/L)糊精30、果糖5、花生餅粉10、 蛋白胨1、酵母浸汁粉3、磷酸氫二鉀1、硫酸鎂0. 5，pH自然，28°C、220rpm振蕩培養24h，以 2%的接種量接入轉化培養基(60ml/500ml三角瓶，配方同上)，28°C、220rpm振蕩培養24h， 加入用乙醇配制的雷帕霉素母液(15mg/ml)，使終濃度為125mg/ml。接著在相同溫度和轉 速下進行雷帕霉素的轉化培養，72h轉化結束，收集轉化液。2、取轉化液，以轉化液乙酸乙酯(1 1)的比例萃取2次，每次20分鐘。收 集乙酯相，50°C減壓濃縮去除乙酯，加入乙醇溶解，采用島津LC-2010CHT HPLC檢測儀， 全波長掃描，0DSC185iim柱，乙腈甲醇水(55 5 40)為流動相，在柱溫50°C、流 速lml/min的條件下進行HPLC檢測，轉化液中3個去甲基雷帕霉素29，42_0_雙去甲 基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素與雷帕霉素的比例大致為 7 10 8 40。
權利要求
一種利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法。其特征在于將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養基培養后，再接入種子培養基培養，然后將種子液接入轉化培養基；待巨大芽孢桿菌在轉化培養基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，經過巨大芽孢桿菌對雷帕霉素的轉化，獲得巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液，轉化液中包含29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。
2.根據權利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于所述的斜面培養基為營養瓊脂、沙保羅瓊脂、高氏1號瓊脂、精氨酸瓊脂和ISP3瓊脂； 巨大芽孢桿菌在斜面培養基中的生長條件為PH5. 5 8. 0，生長溫度20 40°C，培養時間 15 24小時。
3.根據權利要求1所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于所述的種子和轉化培養基均為碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可 溶性淀粉、糊精等等任意一種或2 3種搭配使用，100毫升培養基中含碳源2 5克；氮 源可以為黃豆粉、黃豆餅粉、花生餅粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解 物、玉米漿、棉籽粉等任意一種或2 3種搭配使用，100毫升培養基含氮源0. 5 2克； 無機鹽選擇硝酸鈉、硝酸鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化銨、硝酸銨、鉬酸銨、硫酸鋅、硫酸鎂、碳酸 鈣、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等任意一種或2 3種搭配使用，100 毫升培養基中無機鹽0. 1 0. 2克；種子培養過程采用的pH6. 0 8. 0，培養溫度20 40°C ； 轉化過程采用的PH5. 0 6. 5，溫度26 32°C ；移種量為1 5%。
4.根據權利要求2或3所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征 在于巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適種子和轉化培養基均為1000毫升培養基含可溶 性淀粉24克、葡萄糖1克、蛋白胨3克、酵母浸出物3克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0. 5克， pH自然。
5.根據權利要求4所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適種子培養條件為PH6. 5 7. 5，溫度28°C，培養時間 一級種子15 18小時，二級種子8 10小時，移種量為2 3%。
6.根據權利要求5所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的最適轉化培養條件為PH5. 5 6. 0，溫度28°C，加入轉化 底物雷帕霉素后，轉化周期63 65小時。
7.根據權利要求6所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素時使用的轉化底物雷帕霉素事先溶解在二甲亞砜、甲醇或 乙醇中，雷帕霉素母液濃度10 20mg/ml，最適終濃度為125y g/ml。
8.根據權利要求7所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于在100毫升轉化培養基中添加表面活性劑0. 01 1克，所述的表面活性劑為聚乙烯醇、 水溶性維生素E、吐溫80、吐溫20、泊洛沙姆等的任意一種；或采用雙水相系統，所述的雙水 相系統為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000 等分別與磷酸鹽組成的雙水相系統；聚乙二醇系列與聚乙烯吡咯烷酮組成的雙水相系統； 聚乙二醇濃度5 20% ；磷酸鹽濃度為1 3% ；聚乙烯吡咯烷酮濃度5 15%。
9.根據權利要求8所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其特征在 于巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液用乙酸乙酯以1 1 2體積比萃取2次，每次10 20分鐘，將萃取液50 55°C減壓濃縮至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50 55°C 減壓濃縮至干；從轉化液中將3個去甲基雷帕霉素分離開來，用葡聚糖葡聚糖凝膠LH-20為 填料進行柱層析，氯仿洗脫；也可用0DSC18反向硅膠為填料進行柱層析，乙腈/水系統洗 脫，出峰順序為29，42-0_雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉 素；通過上述柱層析，收集到的3個去甲基雷帕霉素純度均可達90%以上；接著，以300 400目硅膠為填料，以丙酮/正己烷為流動相進行柱層析，獲得純度> 98%的3個去甲基雷 帕霉素。
10.根據權利要求1或2或3所述的利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，其 特征在于A.制備巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液將牛奶冷凍保藏的巨大芽孢桿菌接入營養瓊脂斜面，35°C培養15h，斜面菌苔豐滿，挑 取_鉬環接入種子培養基每100毫升培養基含可溶性淀粉2. 4、葡萄糖0. 1、酵母浸出物 0.3、蛋白胨0.3、磷酸氫二鉀0. 1、硫酸鎂0. 05，pH自然，28°C、220rpm振蕩培養15h后，以 2. 5 %的接種量接入與上述配方相同的種子培養基，28°C、220rpm振蕩培養8h后以相同接 種量接入與上述配方相同的轉化培養基，28°C、220rpm振蕩培養15h，加入用乙醇配制的 15mg/ml雷帕霉素母液，使終濃度為125mg/ml ；接著在相同溫度和轉速下進行雷帕霉素的 轉化培養，64h后轉化結束，收集轉化液；B.轉化液的提取與檢測取轉化液，以轉化液乙酸乙酯為1 1的比例萃取2次，每次20分鐘；收集乙酯相， 50°C減壓濃縮去除乙酯，加入乙醇溶解，采用島津LC-2010CHT型號的高效液相色譜儀，全 波長掃描，0DSC18 5 iim色譜柱，以乙腈甲醇水為55 5 40比例的溶媒為流動相， 在柱溫50°C、流速lml/min的條件下進行HPLC檢測，轉化液中3個去甲基雷帕霉素29， 42-0-雙去甲基雷帕霉素、42-0-去甲基雷帕霉素及29-0-去甲基雷帕霉素與雷帕霉素的比 例大致為9 10 6 19 ；C.轉化產物的提取和純化5L轉化液用1. 5倍的乙酸乙酯全液萃取2次，每次10分鐘，50°C減壓濃縮乙酯相后加 入100ml丙酮溶解出脂溶性成分，4#砂芯漏斗過濾去除不溶物，50°C減壓濃縮，該濃縮液重 新用2倍體積的乙酸乙酯萃取，50°C減壓濃縮獲得3ml粗品；該粗品進行填料為YMC-C18， 50 iim，徑高分別為2和60cm反向硅膠柱層析，用體積比為50 50 55 45的乙腈 水進行梯度洗脫，HPLC檢測，收集所需的組分；各組分層析液分別于50°C減壓濃縮，去除 乙腈，水層用2倍乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，50°C減壓濃縮；經過反向硅膠柱層析后， 分別得到純度為92%的29，42-0-雙去甲基雷帕霉素58mg，94%的42_0_去甲基雷帕霉素 78mg和91%的29-0-去甲基雷帕霉素32mg;各組分濃縮液分別加入少量體積比為25 75 的丙酮正己烷溶解，進行300目硅膠柱層析，用體積比為25 75 33 67丙酮正己 烷進行梯度洗脫，TLC和HPLC跟蹤檢測，收集所需組分，50°C減壓濃縮至干；最終獲得純度 達96 %的29，42-0-雙去甲基雷帕霉素36mg、純度達98 %的42_0_去甲基雷帕霉素56mg， 純度達95 %的29-0-去甲基雷帕霉素21mg。
11.根據權利要求10所述的利用巨大芽孢桿菌制備的去甲基雷帕霉素，其特征在于 所述的去甲基雷帕霉素的名稱為29，42-0-雙去甲基雷帕霉素，其理化性質見表2，與雷帕霉素主要構型的NMR化學位移對比見表3，確定的化學結構式表229，42-0-雙去甲基雷帕霉素的理化性質 表329，42-0-雙去甲基雷帕霉素與雷帕霉素主要構型的NMR化學位移對比(in⑶Cl3) __287-P1a雷帕霉素 alH和13CNMR分別在500MHz禾口 125MHz進行檢測。
全文摘要
本發明涉及一種利用巨大芽孢桿菌制備去甲基雷帕霉素的方法，它是將將巨大芽孢桿菌接種于斜面培養基培養后，再接入種子培養基培養，然后將種子培養液接入轉化培養基。待巨大芽孢桿菌在轉化培養基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，經巨大芽孢桿菌對雷帕霉素的轉化，獲得巨大芽孢桿菌轉化雷帕霉素的轉化液，轉化液中包含29，42-O-雙去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。本發明的優點是采用微生物轉化技術獲得雷帕霉素衍生物。具有對環境污染小、作用條件溫和、無需基團保護等優點，并可通過對微生物及其轉化雷帕霉素條件的改良提高雷帕霉素衍生物的轉化率。
文檔編號C07D498/18GK101851648SQ201010146740
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者余輝, 李夸良, 楊國新, 程元榮, 金東偉, 陳夏琴, 陳有鐘, 黃捷 申請人:福建省微生物研究所