抗神經氈蛋白抗體及使用方法

專利名稱：抗神經氈蛋白抗體及使用方法
技術領域：
本發明涉及抗神經氈蛋白抗體及其使用方法。
背景技術：
神經氈蛋白I(NRPl)是一種有助于神經和血管系統發育的多功能受體。NRPl最初描述為結合腦信號蛋白3A配體的受體，與叢蛋白共同受體一起起作用來調節軸突導向(He and Tessier-Lavigne, Cell (1997) 90:739-51)。后來顯示了 NRPl 還結合血管內皮生長因子(VEGF)配體家族的成員來介導血管發育(Soker et al., Cell (1998)92:735-45; Kawasaki et al.，Development (1999) 126:4895-902)。另外，數項研究提出 NRPl 通過調節血管和/或腫瘤細胞功能在腫瘤生物學中的作用(Bielenberg et al.，Exp CellRes (2006)312:584-93)。Pan et al., J Biol Chem(2007) 282:24049-56 顯示了一種結合 NRPl 的單克隆抗體在體外降低VEGF介導的內皮細胞遷移(還可參見PCT公開文本N0.W02007/056470)。在體內阻斷VEGF與NRPl的相互作用降低血管發生和血管重構。該抗NRPl抗體作為單一藥劑減緩腫瘤生長；提出這是由于抗NRPl抗體介導的對經由一種VEGF依賴性過程的血管萌芽的降低。該抗NRPl抗體增強用抗VEGF抗體進行的VEGF阻斷的抗血管發生和抗腫瘤效果。數據提示通過用抗NRPl降低血管重構， 脈管有可能保留更加未成熟的表型。因為認為未成熟脈管是更加VEGF依賴性的，所以抗NRPl處理的腫瘤中的血管可變得對抗VEGF療法更加易感，如此在組合這兩種療法時在腫瘤模型中導致組合功效(Pan et al.，CancerCell (2007) 11:53-67)。鑒于NRPl在血管發生中的作用，需要其它的檢測NRPl的存在的工具。發明概述本發明提供抗NRPl抗體及其使用方法。在一個實施方案中，本發明提供一種結合神經氈蛋白-1(NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含:(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID N0:3 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4 ;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQID N0:5。在某些實施方案中，該抗體，進一步包含:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ IDN0:8 ;(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:9 ;和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:10。還提供一種分離的結合神經氈蛋白-1(NRPl)的抗體，其中該抗體包含:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ; (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9 -M(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。在另一個實施方案中，本發明提供一種結合神經氈蛋白-1(NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含:(a) VH序列，其與氨基酸序列SEQ ID NO: 2具有至少95%序列同一性；(b)VL序列，其與氨基酸序列SEQ ID N0:7具有至少95%序列同一性；或(c) (a)中的VH序列和(b)中的VL序列。在一些實施方案中，該抗體包含VH序列SEQ ID N0:2。在某些實施方案中，該抗體包含VL序列SEQ ID NO: 7。還提供一種結合神經氈蛋白-1 (NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含VH序列SEQ ID NO: 2和VL序列SEQ ID NO: 7。在某些實施方案中，本發明的抗體為IgGl抗體。在一些實施方案中，該抗體為結合神經氈蛋白的抗體片段，例如缺少Fe部分的抗體、F(ab’)2、Fab、或Fv結構。另一方面，本發明提供包含任何本發明抗體的免疫偶聯物。本發明還提供編碼任何本發明抗NRPl抗體的分離的核酸。在一個實施方案中，提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中，提供包含該載體或包含該核酸的宿主細胞。在一個實施方案中，該宿主細胞為真核的。在一個實施方案中，該宿主細胞為CHO細胞。在一個實施方案中，提供一種生成抗NRPl抗體的方法,其中該方法包括在適合于表達編碼該抗體的核酸的條件下培養該宿主細胞從而生成抗體。在一些實施方案中，該方法進一步包括分離通過該方法生成的抗體。一方面，提供一種檢測生物學樣品中NRPl的存在的方法，該方法包括在允許抗體結合NRPl的條件下使生物學樣品與本發明抗體接觸并檢測結合的抗體的存在，例如通過檢測抗體和NRPl之間是否形成復合物來進行。如此，本文中提供本發明的抗體，其用于檢測生物學樣品中NRPl的存在。在一些實施方案中，檢測NRPl的存在通過免疫組織化學來進行。附圖簡述

圖1A-D顯示使用單克隆抗NRPl抗體7130進行的免疫組織化學的結果。(1A:經全長人NRPl轉染的HEK-293細胞(陽性對照)；1B:經空載體轉染的HEK-293細胞(陰性對照)；1C:來自腎的組織切片；1 D:來自胎盤的組織切片)。圖2A-C顯示使用單克隆抗NRPl抗體7130進行的免疫組織化學的結果。(2A:來自結腸直腸癌(CRC)患者的組織切片；2B:來自乳腺癌(BC)患者的組織切片；2C:來自非小細胞肺癌(NSCLC)患者的組織切片)。發明詳述1.定義出于本文中的目的，“受體人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定義的人共有框架衍生的輕鏈可變域(VL)框架或重鏈可變域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受體人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實施方案中，氨基酸變化的數目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實施方案中，VL受體人框架與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1:1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(Kd)來表述。親和力可以通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于測量結合親和力的具體的說明性和例示性的實施方案。
“親和力成熟的”抗體指在一個或多個高變區(HVR)中具有一處或多處改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導致該抗體對抗原的親和力改善。術語“抗神經氈蛋白抗體”、“抗NRPl抗體”和“結合NRPl的抗體”指能夠以足夠親和力結合NRP1，使得該抗體可作為診斷劑和/或治療劑用于靶向NRPl的抗體。在一個實施方案中，根據例如通過放射免疫測定法(RIA)的測量，抗NRPl抗體結合無關的、非NRPl的蛋白質的程度小于該抗體對NRPl的結合的約10%。在某些實施方案中，結合NRPl的抗體具有彡 ΙμΜ、彡 ΙΟΟηΜ、彡 ΙΟηΜ、彡 InM、彡 0.1nM、彡 0.0lnM、或彡 0.0OlnM(例如 1(Γ8Μ 或更少，例如10_8M到10_13M，例如10_9M到I(T13M)的解離常數(Kd)。在某些實施方案中，抗NRPl抗體結合在來自不同物種的NRPl中保守的NRPl表位。本文中的術語“抗體”以最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結構，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現出期望的抗原結合活性。“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體結合的抗原的部分。抗體片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。與參照抗體“結合相同表位的抗體”指在競爭測定法中將參照抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多的抗體，且相反，參照抗體在競爭測定法中將該抗體對其抗原的結合阻斷50%或更多。本文中提供了例示性的競爭測定法。術語“嵌合”抗體指其中的重和/或輕鏈的一部分自特定的來源或物種衍生，而重和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種衍生的抗體。抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區的類型。抗體有5大類:IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且 這些中的幾種可以進一步分成亞類(同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4 JgA1、和IgA2。與不同類免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、Y、和μ。在用于本文時，術語“細胞毒劑”指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包括但不限于:放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素);化學治療劑或藥物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長春花生物堿類(vinca alkaloids)(長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。“效應器功能”指那些可歸于抗體Fe區且隨抗體同種型而變化的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括:Clq結合和補體依賴性細胞毒性(CDC) ；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；和B細胞活化。藥劑(例如藥物配制劑)的“有效量”指在必需的劑量和時段上有效實現期望的治療或預防結果的量。本文中的術語“Fe區”用于定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恒定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fe區和變體Fe區。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fe區的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fe區或恒定區中的氨基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU 索弓 I,如記載于 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991。“框架”或“FR”指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。一般地，可變域的FR由4個？1 域組成疋1 1、？1 2、？1 3、和？1 4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL)中一般以如下的順序出現:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。術語“全長抗體”、“完整抗體”、和“全抗體”在本文中可互換使用，指與天然抗體結構具有基本上類似的結構或者具有含有如本文中所限定的Fe區的重鏈的抗體。術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”、和“宿主細胞培養物”可互換使用，并且指已經導入外源核酸的細胞，包括此類細胞的后代。宿主細胞包括“轉化體”和“經轉化的細胞”，其包括原代的經轉化的細胞及自其衍生的后代而不考慮傳代的次數。后代在核酸內容物上可以與親本細胞不完全相同，而是可以含有突變。本文中包括具有與在初始轉化細胞中篩選或選擇的相同功能或生物學活性的突變體后代。“人抗體”指擁有與由人或人細胞生成的或利用人抗體全集或其它人抗體編碼序列自非人來源衍生的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結合殘基 的人源化抗體。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變域序列亞組。通常，序列亞組是如 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIHPublication91-3242, Bethesda MD (1991),第1-3卷中的亞組。在一個實施方案中，對于VL，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組κ I。在一個實施方案中，對于VH，亞組是如Kabat等，見上文中的亞組III。“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)對應于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區的一部分。抗體，例如非人抗體的“人源化形式”指已經經歷人源化的抗體。在用于本文時，術語“高變區”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結構上限定的環(“高變環”)的每個區。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR ;三個在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來自高變環和/或來自“互補決定區”(CDR)的氨基酸殘基，后一種是最高序列變異性的和/或牽涉抗原識別。如本文中使用的，HVR區包含任何數目位于位置24-36 (對于Ll)、46-56 (對于L2)、89_97 (對于L3)、26-35B (對于Hl)、47-65 (對于H2)、和93-102 (對于H3)內的殘基。因此，HVR包括先前所述位置中的殘基:A)26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(Η1)、53-55(H2)、和 96-101 (H3)(Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；B)L1 的 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl 的 31-35B、H2 的 50-65、和 H3 的95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。C)除了 VH中的⑶Rl外，⑶R—般包含形成高變環的氨基酸殘基。⑶R還包含“特異性決定殘基”，或“SDR”，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在稱作縮短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R區內。例示性的 a-CDR(a-CDR-Ll、a_CDR_L2、a_CDR_L3、a-CDR-Hl、a_CDR-H2、和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 31-34、L2 的 50-55、L3 的 89-96、Hl 的 31_35B、H2 的 50-58、和 H3的 95-102 (見 Almagro 和 Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008))。除非另有指示，可變域中的HVR殘基和其它殘基(例如，FR殘基)在本文中依照Kabat等，見上文編號。“免疫綴合物”指與一種或多種異源分子，包括但不限于細胞毒劑綴合的抗體。“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養的動物(例如，牛、綿羊、貓、犬、和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類諸如猴)、家兔、和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實施方案中，個體或受試者是人。“分離的”抗體指已經與其天然環境的組分分開的抗體。在一些實施方案中，抗體純化至大于95%或99%的純度，如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)測定的。關于用于評估抗體純度的方法的綜述，見例如 Flatman 等,J.Chromatogr.B848:79-87 (2007)。“分離的”核酸指已經與其天然環境的組分分開的核酸分子。分離的核酸包括通常含有核酸分子的細胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色體外或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在。“編碼抗NRPl抗體 的分離的核酸”指編碼抗體重和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括單一載體或不同載體中的此類核酸分子，和存在于宿主細胞中的一個或多個位置的此類核酸分子。在用于本文時，術語“單克隆抗體”指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體是相同的和/或結合相同表位，除了例如含有天然存在的突變或在單克隆抗體制備物的生成期間發生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如此，修飾語“單克隆”指示抗體自一群基本上同質的抗體獲得的特性，而不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，可以通過多種技術來生成要依照本發明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文中描述了用于生成單克隆抗體的此類方法和其它例示性方法。“裸抗體”指未與異源模塊(例如細胞毒性模塊)或放射性標記物綴合的抗體。裸抗體可以存在于藥物配制劑中。“天然抗體”指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，由二硫化物鍵合的兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成。從N至C端，每條重鏈具有一個可變區(VH)，又稱作可變重域或重鏈可變域，接著是三個恒定域(CH1、CH2、和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有一個可變區(VL)，又稱作可變輕域或輕鏈可變域，接著是一個恒定輕(CL)域。根據其恒定域氨基酸序列，抗體輕鏈可歸入兩種類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。
術語“包裝插頁”用于指治療產品的商業包裝中通常包含的用法說明書，其含有關于涉及此類治療產品應用的適應癥、用法、劑量、施用、聯合療法、禁忌癥和/或警告的信肩、O關于參照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定義為比對序列并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定用于比對序列的合適參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為了本發明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2產生的。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech, Inc.編寫，并且源代碼已經連同用戶文檔一起提交給美國版權局(US Copyright Office, WashingtonD.C.，20559)，其中其以美國版權注冊號TXU510087注冊。公眾自Genentech, Inc.，SouthSan Francisco, California可獲得ALIGN-2程序,或者可以從源代碼編譯。ALIGN2程序應當編譯成在UNIX操作系統，包括數碼UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數由ALIGN-2程序設定且不變。在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:分數X/Y 乘 100其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，且其中Y是B中的氨基酸殘基總數。應當領會，若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的％氨基酸序列同一性。除非另有 明確說明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。術語“藥物配制劑”指處于如下的形式，使得容許其中含有的活性成分的生物學活性是有效的，且不含對會接受配制劑施用的受試者具有不可接受的毒性的別的組分的制劑。“藥學可接受載體”指藥物配制劑中與活性成分不同的，且對受試者無毒的成分。藥學可接受載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。如本文中使用的，術語“神經氈蛋白(neuropilin) -1”或“NRP1”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳類諸如靈長類(例如人)和嚙齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然NRPl，除非另外指明。該術語涵蓋“全長”、未加工NRPl以及源自細胞中加工的任何形式NRP1。該術語還涵蓋NRPl的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。神經氈蛋白的基本結構包含五個結構域:三個胞外結構域(ala2、blb2和C)、一個跨膜結構域、和一個胞質結構域。ala2結構域與補體成分Clr和Cls(CUB)同源，其一般含有四個半胱氨酸殘基，形成兩個二硫橋。blb2結構域與凝結因子V和VIII同源。c結構域的中央部分稱為MAM，因為它與跨膜肽酶(meprin)、A5和受體酪氨酸磷酸酶μ蛋白同源。ala2和blb2結構域負責配體結合，而C結構域對于同型二聚化或異型二聚化是至關重要的。Gu et al.(2002) J.Biol.Chem.277:18069-76;He and Tessier-Lavigne(1997)Cell90:739-51。術語“可變區”或“可變域”指抗體重或輕鏈中牽涉抗體結合抗原的域。天然抗體的重鏈和輕鏈可變域(分別為VH和VL) —般具有類似的結構,其中每個域包含4個保守的框架區(FR)和3個高變區(HVR) ο (見例如Kindt等KubyImmunology,第6版，W.H.Freeman and C0.,第91頁(2007))。單個VH或VL域可以足以賦予抗原結合特異性。此外，可以分別使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域篩選互補VL或VH域的文庫來分離結合特定抗原的抗體。見例如，Portolano 等,J.1mmunol.150:880-887 (1993) ; Clarkson等，Nature352:624-628 (1991)。在用于本文時，術語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術語包括作為自身復制型核酸結構的載體及整合入接受其導入的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作連接的核酸的表達。此類載體在本文中稱為“表達載體”。I1.組合物和方法本發明提供了結合NRPl的新穎抗體。本發明的抗體可用于例如檢測(例如在生物學樣品中)NRPl的存在。A.例示性抗NRPl抗體本發明提供可用于例如診斷應用的抗NRPl抗體。在一個實施方案中，本發明提供一種抗NRPl抗體，其具有下述重鏈和輕鏈序列:重鏈:QLVEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISNYHMSffVRQAPGKGLEfflGIIYAVSAATffSACDRlCDR2TffVKGRFTI SKTLTTVDLKMTSLTAADTATYFCARVRAPGDSTYYDLffGPGTLVTVSSGQCDR3PKAPSVFPLAPCC⑶TPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTffYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDffLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:1)重鏈可變區的氨基酸序列如下:QLVEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGFTISNYHMSffVRQAPGKGLEffIGIIYAVSAATffSATffVKGRFTISKTLTTVDLKMTSLTAADTATYFCARVRAP⑶STYYDLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:2)重鏈Kabat⑶R的氨基酸序列如下:CDRl: NYHMS (SEQ ID NO: 3) ；CDR2:11YAVSAATffSTffVKG (SEQ ID NO:4)；CDR3:VRAP⑶STYYDL(SEQ ID NO:5)。輕鏈:AVVMTQTASPVSAVVGGTVTINCQASQTISNNffLSffYQQKPGQPPKLLIYKASILASGVP
CDRlCDR2SRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCLYGHYITTSAHNAFGGGTEVWKGDPVAPTVCDR3
LIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:6)輕鏈可變區的氨基酸序列如下:AVVMTQTASPVSAVVGGTVTINCQASQTISNNWLSWYQQKPGQPPKLLIYKASILASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCLYGHYITTSAHNAFGGGTEVVVKGD(SEQ ID NO:7)輕鏈Kabat⑶R的氨基酸序列如下:CDRl: QASQTISNNffLS (SEQ ID N0:8) ； CDR2: KASI LAS (SEQ ID N0:9)；CDR3:LYGHYITTSAHNA(SEQ ID NO:10)。一方面，本發明提供一種抗NRPl抗體，其包含至少一種、兩種、三種、四種、五種、或六種選自下述的HVR: (a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3 ； (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4 ;(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5 ; (d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:8 ;(e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9 -M (f)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種、至少兩種、或所有三種選自下述的VH HVR序列:(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3 ; (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:5。在一個實施方案中，該抗體包含HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。在另一個實施方案中，該抗體包含HVR-H3和HVR-L3，該HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，該HVR-L3包含氨基酸序列SEQ IDN0:10。在又一個實施方案中，該抗體包含:(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:3 ；(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4 ;和(c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:5。

另一方面，本發明提供一種抗體，其包含至少一種、至少兩種、或所有三種選自下述的VL HVR序列:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ; (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:9;和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。在一個實施方案中，該抗體包含:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ； (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQID NO:9 -M (c)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEQ ID NO:1O0另一方面，本發明的抗體包含:(a)VH結構域，其包含至少一種、至少兩種、或所有三種選自下述的VH HVR序列:(i)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:3, (ii)HVR_H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4，和(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5 -M (b)VL結構域，其包含至少一種、至少兩種、或所有三種選自下述的VL HVR序列:(i)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:8, (ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:9，和(c)HVR_L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。另一方面，本發明提供一種抗體，其包含:(a)HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 3 ； (b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4 ； (c)HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ IDNO: 5 ;(d)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ; (e)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:9 -M (f)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEQ ID N0:10o另一方面，抗NRPl抗體包含與氨基酸序列SEQ ID NO: 2具有至少90%，91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或100%序列同一性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施方案中，具有至少90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或99%同一性的VH序列相對于參照序列(SEQ ID N0:2)包含替代(例如保守替代)、插入、或刪除，但是包含該序列的抗NRPI抗體保留結合NRPI的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID NO: 2中替代、插入和/或刪除了總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，替代、插入、或刪除發生在HVR以外的區域中(即在FR中)。任選地，抗NRPl抗體包含SEQ ID NO: 2中VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，該VH包含一種、兩種或三種選自下述的HVR:(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:4，和(c)HVR_H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。另一方面，提供一種抗NRPl抗體，其中該抗體包含與氨基酸序列SEQ ID N0:7具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,或 100% 序列同一1性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施方案中，具有至少 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,或 99% 同一性的VL序列相對于參照序列(SEQ ID NO: 7)包含替代(例如保守替代)、插入、或刪除，但是包含該序列的抗NRPl抗體保留結合NRPl的能力。在某些實施方案中，在SEQ ID N0:7中替代、插入和/或刪除了總共I至10個氨基酸。在某些實施方案中，替代、插入、或刪除發生在HVR以外的區域中(即在FR中)。任選地，抗NRPl抗體包含SEQ ID NO: 7中VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在一個特別的實施方案中，該VL包含一種、兩種或三種選自下述的HVR: (a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ； (b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQID NO:9 ;和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 10。另一方面，提供一種抗NRPl抗體，其中該抗體包含上文提供的任何實施方案中的VH和上文提供的任何實施方案中的VL。在一個實施方案中，該抗體包含分別SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 7中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。又一方面，本發明提供與本文中提供的抗NRPl抗體結合相同表位的抗體。例如，在某些實施方案中，提供與包含VH序列SEQ ID NO: 2和VL序列SEQ ID NO: 7的抗NRPl抗體結合相同表位的抗體。 在本發明的又一個方面，依照任何上述實施方案的抗NRPl抗體是單克隆抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一個實施方案中，抗NRPl抗體是抗體片段，例如Fv、 &13、？&13’、8(^1雙抗體、或？(&13’)2片段。在另一個實施方案中，抗體是全長抗體，例如完整IgGl抗體或其它抗體類或同種型，如本文中定義的。在又一個方面，依照任何上述實施方案的抗NRPl抗體可單一地或組合地摻入下文1-7節中描述的任何特征:1.抗體親和力在某些實施方案中，本文中提供的抗體具有彡ΙμΜ、≤IOOnM, ^ 1OnM, ^ InM,(0.1nM、≤ 0.0lnM、或≤0.0OlnM (例如 1(Γ8Μ 或更少，例如 1(Γ8Μ 至 10_13M，例如，10_9M 至I(T13M)的解離常數(Kd)。在一個實施方案中，Kd是通過如下述測定法所述用Fab型式的感興趣抗體及其抗原實施的放射性標記抗原結合測定法(RIA)來測量的。通過在存在未標記抗原的滴定系列的情況中用最小濃度的(125I)標記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體包被板捕捉結合的抗原來測量Fab對抗原的溶液結合親和力(見例如Chen等，J.Mo 1.Biol.293:865-881 (1999))。為了建立測定法的條件，將[VnCROin LR^ 多孔板(ThermoScientific)用 50mM 碳酸鈉(ρΗ9.6)中的 5 μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗體(Cappel Labs)包被過夜，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室溫(約23° C)封閉2-5小時。在非吸附板(Nunc#269620)中，將IOOpM或26pM125I_抗原與連續稀釋的感興趣Fab (例如與 Presta 等，Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗 VEGF 抗體，Fab-12 的評估一致)混合。然后將感興趣的Fab溫育過夜；然而，溫育可持續更長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。此后，將混合物轉移至捕捉板，于室溫溫育(例如I小時)。然后除去溶液，并用PBS中的0.1%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔閃爍液(MICR0SCINT-20 ; Packard)，然后在TOPCOUNT 伽馬計數器(Packard)上對平板計數10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結合之20%的濃度用于競爭性結合測定法。依照另一個實施方案，Kd是使用表面等離振子共振測定法使用BIAcore -2000或 LMAcore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)于 25 ° C 使用固定化抗原 CM5芯片在約10個響應單位(RU)測量的。簡言之，依照供應商的用法說明書用鹽酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIACORE, Inc.)。將抗原用IOmM乙酸鈉ρΗ4.8稀釋至5 μ g/ml (約0.2 μ M)，然后以5 μ I/分鐘的流速注射以獲得約10個響應單位(RU)的偶聯蛋白質。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應基團。為了進行動力學測量，于25° C以約25 μ I/分鐘的流速注入在含0.05%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )表面活性劑的PBS (PBST)中兩倍連續稀釋的Fab (0.78ηΜ至500ηΜ)。使用簡單一對一朗格繆爾(Langmuir)結合模型(BIACORE Evaluation Software version3.2)通過同時擬合結合和解離傳感圖計算結合速率(kon)和解離速率U。平衡解離常數(Kd)以比率I^ffZXn計算。見例如Chen等，J.Mol.Biol.293:865-881 (1999)。如果根據上文表面等離振子共振測定法，結合速率超過IO6M-1S-1,那么結合速率可使用熒光淬滅技術來測定，即根據分光計諸如配備了斷流裝置的分光光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0 分光光度計(ThermoSpectronic) 中用攪拌比色杯的測量,在存在濃度漸增的抗原的情況中，測量PBSPH7.2中20nM抗抗原抗體(Fab形式)于25°C的熒光發射強度(激發=295nm ;發射=340nm，16nm帶通)的升高或降低。2.抗體片段在某些實施方案中，本文中提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。關于某些抗體片段的綜述，見Hudson等Nat.Med.9:129-134 (2003)。關于scFv片段的綜述，見例如Pluckthiin,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113卷，Rosenburg和Moore 編，(Springer-Verlag, New York),第 269-315 頁(1994);還可見 W093/16185;及美國專利N0.5，571，894和5，587，458。關于包含補救受體結合表位殘基，并且具有延長的體內半衰期的Fab和F(ab’)2片段的討論，見美國專利N0.5，869，046。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可以是二價的或雙特異性的。見例如 EP404, 097;W01993/01161;Hudson 等，Nat.Med.9:129-134(2003);及 Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)。三抗體和四抗體也記載于 Hudson等，Nat.Med.9:129-134 (2003)。單域抗體是包含抗體的整個或部分重鏈可變域或整個或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA ;見例如美國專利 N0.6，248，516B1)。
可以通過多種技術，包括但不限于對完整抗體的蛋白水解消化及重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)的生成來生成抗體片段，如本文中所描述的。3.嵌合的和人源化的抗體在某些實施方案中，本文中提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體記載于例如美國專利 N0.4，816，567;及 Morrison 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。在一個例子中，嵌合抗體包含非人可變區(例如，自小鼠、大鼠、倉鼠、家兔、或非人靈長類，諸如猴衍生的可變區)和人恒定區。在又一個例子中，嵌合抗體是“類轉換的”抗體，其中類或亞類已經自親本抗體的類或亞類改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。在某些實施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，將非人抗體人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。一般地，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中HVR，例如⑶R (或其部分)自非人抗體衍生，而FR (或其部分)自人抗體序列衍生。任選地，人源化抗體還會至少包含人恒定區的一部分。在一些實施方案中，將人源化抗體中的一些FR殘基用來自非人抗體(例如衍生HVR殘基的抗體)的相應殘基替代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體及其生成方法綜述于例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008),并且進一步記載于例如 Riechmann等，Nature332:323_329(1988);Queen 等，Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA86:10029-10033(1989);美國專利 N0.5，821，337，7，527，791，6，982，321 和
7,087, 409; Kashmiri 等，Methods36:25-34 (2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接);Padlan, Mol.1mmunol.28:489-498 (1991)(描述了“重修表面”);Dall ’Acqua 等，Methods36:43-60 (2005)(描述了 “FR 改組”)；及 Osbourn 等,Methods36:61-68 (2005)和 Klimka 等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了 FR改組的“引導選擇”方法)。可以用于人源化的人框架區包括但不限于:使用“最佳擬合(best-fit)”方法選擇的框架區(見例如Sims等J.1mmunol.151:2296 (1993))；自輕或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列衍生的框架區(見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89:4285 (1992);及 Presta 等 J.1mmunol.，151:2623 (1993));人成熟的(體細胞突變的)框架區或人種系框架區(見例如Almagro和Fransson, Front.Biosc1.13:1619-1633 (2008));和通過篩選FR文庫衍生的框架區(見例如Baca等，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及 Rosok 等，J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。4.人抗體在某些實施方案中，本文中提供的抗體是人抗體。可以使用本領域中已知的多種技術來生成人抗體。一般地，人抗體記載于van Dijk和van de ffinkel, Curr.0pin.Pharmacol.5:368-74(2001)及 Lonberg, Curr.0pin.1mmunol.20:450-459(2008)。可以通過對轉基因動物施用免疫原來制備人抗體，所述轉基因動物已經修飾為響應抗原性攻擊而生成完整人抗體或具有人可變區的完整抗體。此類動物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替換內源免疫球蛋白基因座，或者其在染色體外存在或隨機整合入動物的染色體中。在此類轉基因小鼠中，一般已經將內源免疫球蛋白基因座滅活。關于自轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述，見Lonberg, Nat.Biotech.23:1117-1125 (2005)。還可見例如美國專利N0.6，075，181和6，150，584，其描述了 XEN0M0USE 技術；美國專利N0.5，770，429，其描述了 I IlJMAB i ,技術；美國專利N0.7，041，870，其描述T K-M MOUSE 技術，和美國專利申請公開文本N0.US2007/0061900,其描述了VELOCIMOUSLt技術)。可以例如通過與不同人恒定區組合進一步修飾來自由此類動物生成的完整抗體的人可變區。也可以通過基于雜交瘤的方法生成人抗體。已經描述了用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異骨髓瘤細胞系(見例如Kozbor J.1mmunol.，133:3001 (1984) ;Brodeur 等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc., NewYork, 1987)；及 Boerner 等,J.1mmunol., 147:86 (1991))。經由人B細胞雜交瘤技術生成的人抗體也記載于Li等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如記載于美國專利N0.7，189，826 (其描述了自雜交瘤細胞系生成單克隆人IgM抗體)和Ni，XiandaiMianyixue, 26 (4): 265-268 (2006)(其描述了人-人雜交瘤)的。人雜交瘤技術(Trioma技術)也記載于 Vollmers 和 Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3): 927-937 (2005)及Vollmers和Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)。也可以通過分離自人衍生的噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變域序列生成人抗體。然后，可以將此類可變域序列與期望的人恒定域組合。下文描述了自抗體文庫選擇人抗體的技術。5.文庫衍生的抗體可以通過對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性的抗體來分離本發明的抗體。例如，用于生成噬菌體展示文庫并對此類文庫篩選擁有期望結合特征的抗體的多種方法是本領域中已知的。此類方法綜述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiologyl78:1-37 (O’ Brien 等編,Human Press, Totowa, NJ, 2001)，并且進一步記載于例如 McCafferty 等，Nature348:552-554;Clackson 等，Nature352:624-628(1991);Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Marks 和 Bradbury,于 Methods in MolecularBiology 248: 161-175 (Lo 編，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ; Sidhu 等，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004) ; Lee 等，J.Mol.Biol.340(5): 1073-1093(2004) ; Fellouse, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl (34): 12467-12472 (2004);及 Lee 等，J.1mmunol.Methods284(1-2): 119-132(2004)。在某些噬菌體展示方法中，將VH和VL基因的全集分別通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆，并在噬菌體文庫中隨機重組，然后可以對所述噬菌體文庫篩選抗原結合噬菌體，如記載于 Winter 等,Ann.Rev.Tmmunol., 12:433-455 (1994)的。卩遼菌體通常以單鏈 Fv (scFv)片段或以Fab片段展示抗體片段。來自經免疫的來源的文庫提供針對免疫原的高親和力抗體，而不需要構建雜交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在沒有任何免疫的情況中提供針對一大批非自身和還有自身抗原的抗體的單一來源，如由Griffiths等，EMBOJ, 12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通過自干細胞克隆未重排的V基因區段，并使用含有隨機序列的PCR引物編碼高度可變的CDR3區并在體外實現重排來合成生成未免疫文庫，如由 Hoogenboom 和 Winter, J.Mol .Biol.，227:381-388 (1992)所描述的。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開文本包括例如:美國專利N0.5，750, 373、和美國專利公開文本N0.2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936 和 2009/0002360。認為自人抗體文庫分離的抗體或抗體片段是本文中的人抗體或人抗體片段。6.多特異性抗體在某些實施方案中，本文中提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點具有結合特異性的單克隆抗體。在某些實施方案中，結合特異性之一針對NRPl，而另一種針對任何其它抗原。在某些實施方案中，雙特異性抗體可以結合NRPl的兩個不同表位。也可以使用雙特異性抗體來將細胞毒劑定位于表達NRPl的細胞。雙特異性抗體可以以全長抗體或抗體片段制備。用于生成多特異性抗體的技術包括但不限于具有不同特異性的兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(見 Milstein 和 Cuello, Nature305:537 (1983))、W093/08829、和Traunecker等，EMBO J.10:3655 (1991))、和“突起-入-空穴”工程化(見例如美國專利N0.5，731，168)。也可以通過用于生成抗體Fe-異二聚體分子的工程化靜電操縱效應(W02009/089004A1);交聯兩個或更多個抗體或片段(見例如美國專利N0.4，676，980，及Brennan等，Science, 229:81 (1985));使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體(見例如Kostelny等，J.1mmunol.，148(5): 1547-1553(1992));使用用于生成雙特異性抗體片段的“雙抗體”技術(見例如 Hollinger 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993));及使用單鏈Fv(sFv) 二聚體(見例如Gruber 等，J.1mmunol., 152:5368 (1994));及如例如Tutt等J.1mmunol.147:60(1991)中所描述的,制備三特異性抗體來生成多特異性抗體。本文中還包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的工程化改造抗體，包括“章魚抗體”(見例如US2006/0025576A1)。本文中的抗體或片段 還包括包含結合NRPl及另一種不同抗原的抗原結合位點的“雙重作用 FAb” 或“DAF”(見例如 US2008/0069820)。7.抗體變體在某些實施方案中，涵蓋本文中提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的氨基酸序列內的殘基的刪除、和/或插入和/或替代。可以進行刪除、插入、和替代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特征，例如，抗原結合。a)替代、插入、和刪除變體在某些實施方案中，提供了具有一處或多處氨基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括HVR和FR。保守替代在表I中在“保守替代”的標題下顯示。更實質的變化在表I中在“例示性替代”的標題下提供，并且如下文參照氨基酸側鏈類別進一步描述的。可以將氨基酸替代引入感興趣的抗體中，并且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。表I
權利要求
1.一種結合神經氈蛋白-1 (NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含:(a)HVR-Hl，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:3 ;(b)HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4 -M (c)HVR_H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
2.權利要求1的抗體，進一步包含:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:8 ；(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID N0:9 ;和(c)HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
3.一種分離的結合神經氈蛋白-1 (NRPl)的抗體，其中該抗體包含:(a)HVR-Ll，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8 ;(b)HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9 -M (c)HVR_L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10。
4.一種結合神經氈蛋白-1 (NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含:(a)VH序列，其與氨基酸序列SEQ ID NO:2具有至少95%序列同一性；(b) VL序列，其與氨基酸序列SEQ ID NO:7具有至少95%序列同一性；或(c) (a)中的VH序列和(b)中的VL序列。
5.權利要求4的抗體，包含VH序列SEQID NO:2。
6.權利要求4的抗體，包含VL序列SEQID NO:7。
7.一種結合神經氈蛋白-1 (NRPl)的分離的抗體，其中該抗體包含VH序列SEQ ID NO: 2和 VL 序列 SEQ ID NO: 7。
8.權利要求1-7任一項的抗體，其為IgGl抗體。
9.權利要求1-7任一項的抗體，其為結合神經氈蛋白的抗體片段。
10.一種分離的核酸，其編碼權利要求1-7任一項的抗體。
11.一種宿主細胞，其包含權利要求10的核酸。
12.一種生產抗體的方法，包括培養權利要求11的宿主細胞從而生成抗體。
13.一種免疫偶聯物，其包含權利要求1-7任一項的抗體。
14.權利要求1-7任一項的抗體，其用于檢測生物學樣品中NRPl的存在。
15.權利要求14的抗體，其中檢測NRPl的存在通過免疫組織化學來進行。
16.一種檢測生物學樣品中NRPl的存在的方法，包括使生物學樣品與權利要求1-7任一項的抗體接觸并檢測結合的抗體的存在。
17.權利要求15的方法，其中NRPl的存在通過免疫組織化學來檢測。
全文摘要
本發明提供了抗NRP1抗體及其使用方法。
文檔編號C07K16/28GK103097418SQ201180043301
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月8日 優先權日2010年7月9日
發明者M.施米特, C.卡拉漢, J-A.S.宏戈, H.科彭, R.J.沃茨 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司