具有鎮痛作用并抑制asic通道的新型肽的制作方法

專利名稱：具有鎮痛作用并抑制asic通道的新型肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及引起痛覺缺失并抑制ASIC通道(酸敏感離子通道)、更具體地包含選自ASICla和ASIClb的至少一種亞基的同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道和/或異聚體通道的新型肽，涉及編碼所述肽的多核苷酸，還涉及包含其的藥物組合物、宿主細胞和載體。具體地，所述肽展現與所附序列表中的氨基酸序列SEQ ID No:1至少56%的同一性。具體地，它們是從蛇黑樹眼鏡蛇(Dendroaspis polylepis)(黑曼巴蛇)的毒液分離的兩種57 個氨基酸的肽 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)，序列分別為 SEQ ID No:2 和 SEQ ID No:3o本發明還涉及其用于獲得診斷工具或藥物、具體地鎮痛劑、和用于鑒定鎮痛劑分子或抑制ASIC通道的分子的用途。具體地，本發明在預防或治療疼痛、尤其是牽涉ASIC通道的活化的疼痛(例如炎癥性疼痛、神經病性疼痛、癌癥相關疼痛、手術后疼痛、肌肉骨骼痛、內臟痛等疼痛)、中樞神經疾病(例如，創傷后應激、抑郁、焦慮、中風、癲癇、多發性硬化、大腦炎癥、神經退行性疾病等)、和其中已經提出牽涉ASIC通道的病理狀況(例如，炎癥、癌癥、纖維肌痛、過敏性腸綜合征等)方面具有應用。在以下說明書中，方括號([])中的參考文獻是指在說明書末尾展示的參考文獻的列表。現有技術水平疼痛的考慮和治療是改進患者生活質量的必要方面。疼痛影響可觀數目的個體，每年歐洲約6000萬人，這代表用于 治療所述疼痛的鎮痛劑藥物的每年10億美元的開銷。每年全世界花在鎮痛劑藥物上的總額可評估為大約250億美元，在2010年應達到420億美元。疼痛分為兩類:急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛對應時間有限的快速和短暫疼痛。相反地，慢性疼痛是持續的疼痛，可以與例如痛覺增敏關聯，并構成巨大的疾病負擔，影響大約20 %的成年人和50 %的年長人群。疼痛的治療基本上是基于抗炎藥的處方，無論抗炎藥是非類固醇抗炎藥(NSAID)還是類固醇抗炎藥(腎上腺皮質激素)，以及弱的或是強的阿片。NSAID由于其對炎癥和對疼痛本身的大的效力，成為全世界最廣泛開處方的治療劑種類。它們用在所有類型的炎性疼痛中，無論是急性還是慢性的[Bertin和Vergne-Salle，2007] [I]。當NSAID和/或腎上腺皮質激素不足以緩解炎性疼痛時，開處方的醫師組合非抗炎性鎮痛劑，例如撲熱息痛、弱的阿片樣物質(opioid)(可待因、曲馬多)，如果疼痛繼續對治療耐受，則組合強的阿片樣物質(嗎啡、氧可酮、芬太尼)[Gutstein & Akil, 2006] [2]。盡管NSAID非常有效，然而它們仍然是不利副作用的主要提供者。在最標準的不利副作用之中，消化影響是非常常見的并限制NSAID在許多臨床情況中的應用。還存在腎、皮膚、粘膜、變應性和呼吸、血液學、肝以及最后感覺神經和心理學不利副作用[Bertin和Vergne-Salle，2007，上述][I]。此外，NSAID并非對所有類型的疼痛有效。阿片樣物質也在對抗疼痛中起主要作用，但會導致幻覺現象和心肺衰減(cardiorespiratorydepression)。鎮痛劑還可以是依賴性的來源,例如嗎啡、美沙酮等的依賴性。還存在習慣鎮痛劑的情形，即獲得恒定作用必需的劑量必須增加。這一習慣隨著時間增加，因此導致增加劑量的需要，并可導致藥物無效。事實上，緩解疼痛必需的劑量可以變得大于所述藥物的毒性劑量。最后，用阿片樣物質治療還可以伴有不利作用，諸如嚴重便秘或治療停止時痛覺增敏(例如手術后疼痛)[Gutstein & Akil, 2006,上述；Bannister & Dickenson, 2010] [2,3] ο盡管現有治療劑庫的多樣性，許多類型的疼痛仍然對已知鎮痛劑相對不敏感，諸如神經系統損傷后的神經病性疼痛(50%的患者未經歷緩解)、慢性內臟疼痛諸如過敏性腸綜合征或慢性炎性腸病、纖維肌痛、癌癥和骨轉移帶來的疼痛等。[Yennurajalingam等，2004 ；Mizoguchi 等，2009] [4，5]。因此在這一背景下，補償這些不足和缺陷的新型鎮痛劑和/或新型鎮痛劑靶的發現應代表真正的進展。制藥工業對疼痛的研究在過去數年僅獲得數個有限的發展。可提及例如，用于偏頭痛的曲坦類、和其用途仍然有限的某些新型藥物，諸如用于癌癥相關的疼痛和神經病性疼痛的四氫大麻酚和大麻二酚的組合。事實上，過去二十年取得的進展基本上來自于可獲得的鎮痛劑的更好用途和劑量的調整。由于有限的效力和/或顯著的副作用，這些鎮痛劑的主要家族都不具有最佳的益處/風險比。在過去數年鑒定的分子靶之中，離子通道占據特別重要的位置，因為它們直接參與感覺和中樞神經元對疼痛信號的檢測和傳遞。ASIC通道(酸敏感離子通道)是由細胞外介質的酸化(細胞外酸中毒)活化的陽離子通道[Waldmann & Lazdunski, 1998 ；ffemmie等，2006 ;Lingueglia等，2007] [6，7，8]。迄今已經在哺乳動物中鑒定了編碼至少七種亞基(ASICla、ASIClb、ASIClb2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3 和 ASIC4)的四種基因。不同 ASIC亞基締合為三聚體產生功能性ASIC通道[Jast`i等2007] [9]，導致同聚體或異聚體通道[Lingueglia 等，1997 ；Benson 等，2002 ；Hesselager 等，2004] [10,11,12]。ASIC 通道基本上在外周神經系統的感受傷害的感覺神經元和中樞神經系統神經元中表達[Waldmann等，1997a ;Lingueglia 等，2007，上述；Noel 等，2010] [13，8，14]。盡管 ASICla 和 ASIC2 同種型在中樞神經系統和外周神經系統二者中都存在，但ASIClb和ASIC3同種型的表達限于感覺神經兀[Waldmann 等，1997b ；Bassler 等，2001 ；Chen 等，1998] [15,16,17]。已經假設，由感覺神經元表達的ASIC通道、尤其是ASIC3通道，能夠檢測缺血、炎癥、血腫、骨折、病變、手術程序(手術后疼痛)、或某些腫瘤發展期間可能發展的細胞外酸化[Reeh和Steen，1996] [18]。當其發生時，多年來已經已知細胞外酸中毒導致疼痛[Steen等，1995a ；Issberner等，1996] [19, 20],而且對健康人類志愿者進行的實驗[Ugawa等，2002 Jones等，2004] [21，22]借助為ASIC通道的非特異性抑制劑的阿米洛利和某些NSAID已經顯示ASIC通道牽涉在酸性皮膚疼痛中[Waldmann等，1997a，上述；Voilley等，2001] [13，23]。還已經證實了中樞神經系統神經元中表達的某些ASIC通道在神經元活性(海馬、杏仁核的突觸可塑性)和脊髓神經元傳遞疼痛信息(ASICla通道)的神經調節中的重要作用[Noel 等，2010] [14]。直到最近，能夠抑制ASIC通道的活性配體的清單主要限于阿米洛利、某些NSAID和化合物A-317567 [Dube等，2005] [24]。然而，這些分子都不是對ASIC通道或對特定ASIC亞基絕對特異性的。為了鑒定對ASIC通道特異性的效應物，已經篩選了非常大量的蝎子、蜜蜂、蜘蛛、蛇或海葵毒液。最近，已經鑒定了分別抑制同聚體ASICla通道和包含ASIC3亞基的通道的兩種動物肽毒素PcTxl和APETx2 [Escoubas等，2000 ；Diochot等，2004] [25，26]。外周(皮下)注射APETx2引起大鼠中對炎性和酸性疼痛的鎮痛作用[Deval等，2008][27]，和對手術中施加APETx2后大鼠的手術后疼痛的鎮痛作用[Deval等，J.Neurosc1.，31(16) =6059-6066,2011] [36]，而中樞注射PcTxl在小鼠中引起強有力的鎮痛作用[Mazzuca等，2007] [28]。這兩種毒素的鎮痛作用使得有可能證實ASIC通道在疼痛信息的感知和傳遞中的牽涉。因此對鑒定對ASIC通道或對特定ASIC亞基特異性、能夠展現鎮痛作用而同時補償現有技術鎮痛劑的不足、缺陷和障礙的其他效應物存在實際的需要。

發明內容
發明人現在已經從蛇黑樹眼鏡蛇(黑曼巴蛇)的毒液發現和鑒定出引起痛覺缺失并抑制ASIC通道(酸敏感離子通道)、更具體地同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道、異聚體ASICla+2a通道和異聚體ASICla+lb通道的新型肽。它們具體地是肽ASICalgin-1 (J1-Dpi)和 ASICalgin-2 (Ji _Dp2)，在小鼠體內中樞(鞘內和腦室內)注射后，這些肽對不同疼痛模式(化學、熱、炎性)展現強有力的鎮痛作用，該鎮痛作用與嗎啡相當但極大地與阿片受體活化無關。此外，這些肽當被中樞注射時不展現神經中毒作用。當通過皮下外周注射施用時，這些肽還施加鎮痛作用，逆轉炎性痛覺增敏。這兩種肽是首次從黑樹眼鏡蛇(黑曼巴蛇)的毒液提取的展現鎮痛作用的肽。不受這一解釋限制，這些肽的最可能的作用機制表現為來自于ASIC離子通道的抑制，ASIC離子通道在疼痛信息的感知、傳遞和調節方面起重要作用。事實上，這些肽有效地抑制大鼠和人類的同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道和/或包含ASICla和/或ASIClb亞基的異聚體通道 。這兩種肽具體地是同聚體ASIClb和ASICla通道和異聚體ASICla+ASIClb和ASICla+ASIC2a通道的首次已知的抑制劑。ASICalgin-1 (-Dpi)和ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽還抑制感覺神經元和中樞神經元中存在的天然ASIC電流。它們對由辣椒素和由熱活化的TRPVl電流無影響，且其本身也參與疼痛感知。它們不改變處于基礎狀態的神經元的電性質，但減少響應于能夠活化ASIC通道的細胞外酸化的神經元興奮性。因此，ASICalgin-1(i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽在嚙齒類中具有與嗎啡相當的強有力的鎮痛性質，這種鎮痛性質當阿片受體被阻斷時繼續被觀察到，且可以由其特異性抑制某些嚙齒類和人類ASIC通道的能力來解釋。所述肽的中樞注射沒有引起毒性(神經毒性、抽搐等)，也沒有對運動活動的任何影響(加速轉棒試驗，acceleratingrotarod test)。因此，ASICalgin-1(-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽能夠被設想為是具有針對人類疼痛(例如，癌癥相關疼痛、神經病性疼痛、手術后疼痛等)的治療潛力的新型分子。因此，本發明的一個主題是一種肽，所述肽包括:(i)氨基酸序列LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENNKCCSTDRCNK(SEQ ID No:I)其中X4代表任何氨基酸；或(ii)展現與序列SEQ ID No:1至少56%、優選地至少70%、優選地至少80%、最優選地至少98%的同一性，并保留包括序列SEQ ID No:1的所述肽的如上所述生物特性即，引起痛覺缺失并抑制包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的至少一種ASIC通道的天然或合成序列。更具體地，根據本發明的所述肽作為包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道和/或異聚體ASIC通道、尤其是異聚體ASICla+ASIClb通道和/或異聚體ASICla+ASIC2a通道的阻斷劑起作用。為了本發明的目的，術語“阻斷劑”意為表示能夠以濃度依賴性方式抑制由上述通道產生的電流的肽。例如，阻斷劑是一種肽，其如PcTxl [Escoubas等，2000,上述][25]，能夠在InM的濃度抑制由同聚體ASICla通道產生的電流的50%，或其如APETx2 [Diochot等，2004，上述][26]，能夠在2 μ M的濃度抑制由大鼠異聚體ASICla+ASIC3通道產生的電流的50%。優選地，根據本發明的所述肽是從蛇黑樹眼鏡蛇的毒液提取的。例如，它們是借助反相極性高效液相色譜(RP-HPLC)通過連續分級分離而從毒液分離的。所述肽還可通過DNA重組方法或通過化學合成制備。優選地，根據本發明的所述肽包括具有序列SEQ ID No:1的ASICalgin-1 (i1-Dpi)或 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽，其中 X4 分別代表 Y 或 F (分別是 SEQ IDNo:2 和 3)。`本發明的一個主題還是一種多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼根據本發明的肽的核苷酸序列。優選地，根據本發明的所述多核苷酸包括核苷酸序列:atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaa
73 75
tgt txx caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgcc ttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:4)；或ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacact ggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaa taagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:22)；其中73txx75 和 10txx12 代表 tac、tat、ttt 或 ttc。優選地，根據本發明的所述多核苷酸包括的核苷酸序列使得該多核苷酸在嚴格條件下能夠與核苷酸序列SEQ ID No:4或SEQ ID No:22、或其互補序列雜交。例如，所述多核苷酸是包括展現與序列SEQ ID No:4或序列SEQ ID No:22至少76%、優選地至少80%、最優選地至少98%的同一性的天然或合成序列的多核苷酸。本發明的一個主題還是包含根據本發明的多核苷酸的一種載體。優選地，根據本發明的所述載體是表達載體。
本發明的一個主題還是一種宿主細胞，所述宿主細胞包括一種或多種根據本發明的肽、根據本發明的多核苷酸或根據本發明的載體。本發明的一個主題還是一種藥物組合物，所述藥物組合物包括一種或多種根據本發明的肽、根據本發明的多核苷酸、根據本發明的載體或根據本發明的宿主細胞。根據本發明的藥物組合物還可包含一種或多種藥學上可接受的媒介物(碳酸鈣、淀粉、滑石、乳糖、硬脂酸鎂、阿拉伯膠等)，并可為溶液、懸液、糊劑、凝膠膠囊(gel capsule)、片劑、膠囊、粉末、顆粒、真空凍干粉、控釋系統、微粒、微球(microsphere)或納米微球Oianospherehj^質體等的形式。根據本發明的藥物組合物還可口服、肌內、靜脈內、皮下、局部、經肺途徑、鼻內、含服、經直腸、舌下、皮內、腹膜內、鞘內等施用。根據本發明的藥物組合物中活性成分(根據本發明的肽、多核苷酸、載體或宿主細胞)的有效量可以變化，從而獲得有效劑量并且向哺乳動物施用鎮痛的量。向特定哺乳動物施用的劑量取決于多種因素:施用途徑、治療持續時間、哺乳動物的大小和生理狀態、活性成分的效力和哺乳動物對所述活性成分的響應。例如，鞘內施用的活性成分的有效鎮痛量通常范圍在大約5ng/kg哺乳動物體重至500 μ g/kg哺乳動物體重,優選地大約50ng/kg哺乳動物體重至50 μ g/kg哺乳動物體重,最優選地大約500ng/kg哺乳動物體重至5 μ g/kg哺乳動物體重。當使用其他施用途徑時，活性成分的有效量可改變。有效鎮痛量可通過在以下提及的一種或多種疼痛試驗中以可根據以上提及的一種或多種標準改變的劑量試驗活性成分來估計，以確定將施用于哺乳動物的活性成分的有效量。本發明的一個主題還是一種物質，所述物質選自:根據本發明的肽、根據本發明的多核苷酸、根據本發明的載體、根據本發明的宿主細胞或根據本發明的藥物組合物,該物質用作藥物。優選地，所述藥物是鎮痛劑，例如預期用于預防或治療牽涉ASIC通道、尤其是包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的ASIC通道、最具體地同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道、異聚體ASICla+ASIClb通道和/或異聚體ASICla+ASIC2a通道的活化的疼痛。例如，疼痛可(i)來源于中樞或外周ASIC通道的活化或(ii)引起其活化。例如，疼痛是選自包括炎 癥性疼痛、神經病性疼痛、癌癥相關疼痛、手術后疼痛、肌肉骨骼痛、內臟痛等的疼痛的組的疼痛，尤其是與ASIC通道活化相關的疼痛。優選地，所述藥物預期用于預防或治療牽涉ASIC通道、尤其是包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的ASIC通道、最具體地同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道、異聚體ASICla+ASIClb通道和/或異聚體ASICla+ASIC2a通道的活化的病理狀況。例如，其包括選自包括炎癥、癌癥、纖維肌痛、過敏性腸綜合征等的組的病理狀況。優選地，所述藥物預期用于預防或治療中樞神經疾病，例如選自包括以下的組的中樞神經疾病:創傷后應激、抑郁、焦慮、中風、癲癇、中樞炎癥、多發性硬化、神經退行性疾病等。優選地,所述藥物腸胃外施用，即局部區域性地(1coregionally)或中樞地(腹膜內、硬膜外、鞘內、腦室內、皮內等)和全身地(肌內、靜脈內、皮下等)、口服地、局部地(經皮地等)或經由呼吸途徑(吸入、滴注等)。最優選地，所述藥物被鞘內、硬膜外、腦室內、腹膜內或皮下施用。本發明的一個主題還是一種物質，所述物質選自:根據本發明的肽、根據本發明的多核苷酸、根據本發明的載體、根據本發明的宿主細胞或根據本發明的藥物組合物，該物質用作診斷工具。本發明的一個主題還是一種鑒定模擬根據本發明的肽的鎮痛活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:a)確定根據本發明的肽的鎮痛活性；b)確定候選化合物的鎮痛活性；c)比較步驟a)和步驟b)獲得的鎮痛活性；d)選擇具有與根據本發明的肽的鎮痛活性相當或比根據本發明的肽的鎮痛活性更大的鎮痛活性的候選化合物。本發明的一個主題還是一種鑒定模擬根據本發明的肽的鎮痛活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:a)將根據本發明的肽與樣品接觸，并測量所述肽與所述樣品的結合；b)加入候選化合物，并評價所述化合物對所述肽與所述樣品的結合的影響；

c)選擇能夠調節所述肽與所述樣品的結合的候選化合物。為了本發明的目的，表述“模擬根據本發明的肽的鎮痛活性的化合物”意為表示能夠引起痛覺缺失并能夠結合根據本發明的肽結合的ASIC通道或者能夠以與根據本發明的肽相同或相似的生理方式作用，即可逆地和以濃度依賴性方式調節(抑制或刺激)由包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的至少一種通道產生的、尤其是由同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道、異聚體ASICla+ASIClb通道和/或異聚體ASICla+ASIC2a通道產生的電流的候選化合物。例如，模擬根據本發明的肽的鎮痛活性的化合物包括一種肽，其如PcTxl [Escoubas等，2000,上述][25]，能夠在InM的濃度抑制由同聚體ASICla通道產生的電流的50%，或其如APETx2 [Diochot等，2004，上述][26]，能夠在2μΜ的濃度抑制由大鼠異聚體ASICla+ASIC3通道產生的電流的50%。為了本發明的目的，術語“樣品”意為表示預先從昆蟲或哺乳動物的完整生物體或從永生化細胞系分離的細胞或組織。術語“鎮痛活性”是指根據本發明的肽治療哺乳動物中的疼痛、或減少疼痛的能力，如由試驗疼痛或評價痛覺缺失的一種或多種常規實驗模型，諸如以下所述的那些實驗模型證實的。如此，可以確定根據本發明的肽的鎮痛活性，例如，借助于一種或多種以下體內試驗:i)縮尾/爪潛伏期(熱傷害性刺激的測量)[Abott等，1982 ；Cridland和Henry，1992] [29，30]，ii)熱/冷盤閾值(熱傷害性刺激的測量)[Woolfe和Macdonald，1944，Ankier, 1974] [31,32], iii) von Frey 纖維絲閾值或 Randall-Selitto 試驗或機械鉗試驗(instrumented pincher test)(機械傷害性刺激活性測量)[Kim 等，1993] [33], iv)動態重量分配試驗(與姿勢相關的傷害性刺激活性的測量)，V)自發傷害性刺激行為的測量，和/或一種或多種體外試驗:例如，通過競爭篩選候選化合物，其中將已經標記的(例如，以放射性標記諸如C14、H3或I125、酶諸如過氧化物酶或堿性或酸性磷酸酶、熒光標記諸如FITC或羅丹明、抗體、抗原、生物素、順磁離子、膠乳顆粒等)根據本發明的肽在允許其結合樣品的條件下與所述樣品接觸，并測量與樣品結合的所述標記的肽的結合，其中模擬所述標記的肽的活性的化合物與所述肽競爭結合受體(包含選自ASICla和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的ASIC通道)上的位點。如此，當試驗化合物通過結合受體來模擬所述肽的活性時，比當試驗化合物不模擬所述肽的活性和不結合受體或以較小親和性結合時，測量到更低量的可檢測標記。作為替代方案，競爭篩選可以標記候選化合物代替標記根據本發明的肽來進行。如此，當試驗化合物通過結合受體來模擬所述肽的活性時，比當試驗化合物不模擬所述肽的活性和不結合受體或以較小親和性結合時，測量到更高量的可檢測標記。用于鑒定模擬肽的鎮痛活性的化合物的方法的實例描述在(不被限于這一描述)，例如美國專利5877 026[34]中。其他益處在本領域技術人員閱讀以下實施例后可變得更清楚，以下實施例由附圖闡釋，通過示例的方式提供。附圖簡述-

圖1表示⑷從蛇黑樹眼鏡蛇的毒液分離的ASICalgin-1(J1-Dpi)和ASICalgin-2(31-Dp2)肽的氨基酸序列(分別是 SEQ ID No:2 和 3)，(B)編碼 ASICalgin-1的互補DNA(cDNA)的核苷酸序列(SEQ ID No:5)。標出了信號序列(斜體)和最終肽(黑體)(參見SEQ ID No:6)、以及終止密碼子O。未展示5’非編碼末端的序列(對應SEQID No:9)。-圖2 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 (-Dp2)肽在小鼠中鞘內注射后的體內鎮痛作用。化學性疼痛(甲醛):(A)以5分鐘的間隔測量的自發性疼痛行為的動力學，(B)第I階段(0-10分鐘)急性疼痛和第II階段(10-45分鐘)炎性疼痛的總持續時間。急性熱痛:(C)縮尾潛伏期的動力學，(D)對每只動物測量的曲線下面積(AUC)的平均值。炎性痛覺增敏:(E)縮爪潛伏期的動力學。相對于對照值的痛覺增敏的顯著度..#，P< 0.05 ；##,p < 0.01< 0.001 ;由 ANOVA 檢驗，隨后 Newman Keuls 多重比較進行。(F)在痛覺增敏水平(T-7min)，對每只動物測量`的曲線下面積(AUC)的平均值。示出了平均值土sem(平均值的標準差)，且試驗的動物的數目(η)在圖例中指出。相對于注射媒介物土納洛酮(naxolone) (NAL)或者按照圖中線指出的其他的顯著性:不顯著ns,p > 0.05
P < 0.05 ；**, P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由 ANOVA 檢驗，隨后 Newman Keuls 多重比較進行。-圖3表示ASICalgin-1(i1-Dpi)肽在小鼠中腦室內灃射后在急件熱痛試驗中的體內鎮痛作用:(A)縮尾潛伏期的動力學，(B)對每只動物測量的曲線下面積(AUC)的平均值。示出了平均值土sem(平均值的標準差)。試驗的動物的數目(η)在圖例中指出。相對于注射媒介物或者按照圖中線指出的其他的顯著性:不顯著ns，P > 0.05 ；*, P < 0.05廣，P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由 ANOVA 檢驗，隨后 Newman Keuls 多重比較進行。-圖4表示ASICalgin-1(J1-Dpi)肽在皮下灃射后在炎件痛覺增敏試驗中的體內鎮痛作用=(A)縮爪潛伏期的動力學。將ASICalgin-1肽與角叉菜聚糖(口)同時皮下注射到左后爪，兩個小時后再次注射(時間O或T0，□)。進行類似的程序，但在TO即在炎性痛覺增敏(■)出現后僅注射ASICalgin-1肽。(B)根據T_7min時的數值對每只動物計算的曲線下面積(AUC)的平均值。示出了平均值土sem。試驗的動物的數目(η)在圖例中指出。相對于注射媒介物的顯著性Λ P < 0.05 ；**, P < 0.01 ；***, P < 0.001 ;由ANOVA檢驗，隨后Newman Keuls多重比較進行。相對于注射角叉菜聚糖之前的對照值的顯著性:#，P < 0.05 ；##, P < 0.01 ；###, P < 0.001 ；由成對 T 檢驗進行。-圖5 表示 ASICalgin-1 ( π -Dpi)和 ASICalgin-2 ( π _Dp2)肽對由在 COS 細胞中異源表達的ASIC通道產生的電流的抑制。ASICalgin-1 (J1-Dpi)抑制的劑量響應曲線:大鼠同聚體ASICla電流，IC50 = 49nM(A)，人類同聚體ASICla電流，IC50 = 127nM(B)，大鼠同聚體 ASIClb 電流，IC5tl = 650nM (C)，大鼠異聚體 ASICla+ASIClb (比例 I: I)電流，IC50 =223nM(D)，和大鼠異聚體 ASICla+ASICa (比例 2: I)電流，IC5tl = 308nM(E)。示出了平均值土sem，η來自 4至 15 次實驗。ASICalgin-1 ( π -Dpi, 674ηΜ)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2，852ηΜ)抑制電流的原始圖在小圖中顯示。(F)電流的原始圖，顯示ASICalgin-1 (J1-Dpi，674nM)對人類異聚體ASICla+ASIC2a(比例2: I)電流的抑制。靜息電位:_60mV，白色條:pH從7.4下降至5.5,黑色條:施加肽。-圖6 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 ( π-Dp2)肽對培養的鼠的感覺神經元和中樞神經元的天然ASIC電流的抑制。(A)ASICalgin-2(J1-Dp2，852nM，□)和ASICalgin-1 ( π _Dpl，674nM，■)對大鼠(η = 34)的感覺神經元的ASIC電流的平均抑制。在右邊，在_50mV的靜息電位記錄且以pH從7.4下降至6來活化(白色條)的最初電流的實例。在感覺神經元中，總的ASIC電流來自于同聚體ASICla電流、ASIClb型電流和ASIC3型電流的混合物。(B)ASICalgin-2( ii _Dp2，852nM，□)和 ASICalgin-1 ( π _Dpl，674nM，■)對小鼠(η = 18)的背索神經元的ASIC電流的平均抑制。在右邊，在_50mV的靜息電位記錄且以pH從7.4下降至6來活化(白色條)的最初電流的實例。(C)ASICalgin-2( Ji _Dp2，293nM，852nM 和 2.9 μ Μ, □)和 ASICalgin-1 ( π -Dpi, 224ηΜ 和 2.2 μ Μ, ■)對小鼠(η =26)的海馬神經元的ASIC電流的平均抑制。在右邊，在_50mV的靜息電位記錄且以pH從
7.4下降至5.5來活化(白色條)的最初電流的實例。在中樞神經元(小鼠的背索和海馬)中，總的ASIC電流來自于同聚體ASICla電流和異聚體ASICla+ASIC2a電流的混合物。示出了平均值土 sem。-圖7 表示 ASICalgin-1 (i1-Dpi)和 ASICalgin-2 (-Dp2)肽對小鼠背部脊髓神經元的膜電位的影響。(A)神經元的膜電位,其中自發動作電位反映突觸活動(虛線:OmV)。pH從7.4下降至6對ASIC電流的活化引起去極化,其峰值觸發動作電位(放大)。ASICalgin-1肽(J1-Dpi，6 74nM)的施加不改變神經元的靜息電位和自發活性。另一方面，由酸性PH下降引起的去極化減少，且不再引起動作電位。⑶由電刺激引發的動作電位(上方展示的矩形波電流)。四種響應是疊加的(左圖):兩種閾下的去極化和兩種觸發動作電位的其他去極化(虛線:0mV)。ASICalgin-2(J1-Dp2，852nM，右圖)的施加不改變神經元的興奮性。
實施例 實施例1:從蛇黑樹眼鏡蛇的毒液分離兩種肽ASICALGIN-1 (J1-Dpi)和ASICALGIN-2(π_Dp2)毒液和肽毒素的純化凍干的毒液來自Latoxan公司(Valence, France)。在乙酸(1% )中稀釋毒液并通過將其通過含Sijphadex G50樹脂的柱來分級分離。回收肽級分，隨后在高效液相色譜(HPLC)系統上分級分離:1)將肽級分上樣到陽離子交換柱上并且以pH梯度、以溶劑1%乙酸，pH3.0、和IM乙酸銨，pH6.8從其洗脫。包含ASICalgin的級分從60%乙酸銨開始被洗脫。2)將這一肽級分上樣到C18反相柱上，并且以在溶劑水-0.1%TFA和乙腈-0.1%TFA之間的疏水性梯度洗脫其組成部分。分別在26%和27%乙腈洗脫純的ASICalgin-1和ASICalgin-2 肽。肽表征 氨基酸分析ASICalgin-1和ASICalgin-2是兩種基本的異肽(isopeptide),具有包含形成4個二硫鍵橋的8個半胱氨酸的57個氨基酸的序列(圖1A，分別是SEQ ID No:2和3)，其之前是21個氨基酸的信號序列(圖1B，參見SEQ ID No:6)。它們僅由于SEQ ID No:1、2或3的位置4 (SEQ ID No:6的位置25)的氨基酸而彼此不同。通過克隆確定氨基酸序列ASICalgin-1的完整序列(圖1B)通過從粗制毒液中以痕量存在的信使RNA(mRNA)由PCR克隆cDNA來確定。將25mg蛇黑樹眼鏡蛇的毒液(Sigma)重懸在裂解緩沖液中:IOOmM tris-HCl 緩沖液，ρΗ7.5 中的 500mMLiCl、IOmM EDTAU % (w/v)LiDS 和 5mM 二硫蘇糖醇。借助嫁接有dT25寡核苷酸的磁珠(Dynal，UK)來捕捉信使RNA。這些寡核苷酸直接用作以PrimeScript 逆轉錄酶(TaKaRa Bio Inc., Japan)進行mRNA向cDNA的逆轉錄的引物。所得的固相cDNA文庫用于以通過直接N末端測序從毒素的部分蛋白序列確定的有義(TGITTYCARCAYGGIAARGT, SEQ ID No:7)和反義(YTTIARRT TICGRAAIGGCAT，SEQ ID No:8)寡核苷酸進行簡并PCR。為了排除由于聚合酶的任何差錯，進行三次獨立PCR，這產生期望大小(89個堿基對)的片段,隨后將其亞克隆到pGEMTeasy載體(Promega)中并測序。借助這些序列，合成了具有添加的EcoRI限制性位點的特異性有義寡核苷酸(ACAC(GAATTC)GCTATCATAACACTGGCATG，SEQ ID NO:9)、以及非特異性多聚_dT30反義寡核苷酸，其也帶有添加的EcoRI位點ACAC (GAATTC) dT30，SEQ ID No:10)。這兩種寡核苷酸使得有可能為了鑒定的目的由PCR擴增完整的3’ -編碼和3’ -非編碼末端。三次獨立PCR產生大約400個堿基對的條帶，且將其亞克隆進入pGEMTeasy載體的EcoRI限制性位點使得有可能對其測序同時排除由聚合酶產生的任何差錯。基于該3’ -和5’ -非編碼序列，合成了構架編碼序列的有義寡核苷酸(ACAC (GAATTC) TCCAGAGAAGATCGCAAGATG, SEQ ID No:11)和反義寡核苷酸(ACAC (GAATTC)ATTTAGCCACTCGTAGAGCTA, SEQ ID No:12)。對固相cDNA文庫進行四次獨立PCR，并且再次將PCR產物亞克隆到pGEMTeasy載體中，以獲得ASICalgin-1毒素前體的完整核苷酸序列。狀測丨序通過在自動測序儀(LC491, Applied Biosystems, USA)上對還原的和燒基化的肽直接N末端測序，證實序列到氨基酸Asp40。酶促裂解為了證實序列，對肽進行以下酶處理:(a) V8蛋白酶，并在C18反相HPLC柱上分離消化的肽。在位置D15和E43的裂解、和在HPLC上對被完全再次測序的分子量1786.9Da(肽1-15)和部分測序的3194.0Ta (肽16-43)的兩種肽的分離，使得有可能證實N末端序列。(b)胰蛋白酶消化，由質譜直接分析。胰蛋白酶片段還證實ASICalgin的肽序列的N末端序列以及其他部分。由MS/MS分析檢測并測序的胰蛋白酶肽在以下表I中提供。表I
權利要求
1.一種肽，所述肽包括氨基酸序列LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENN KCCSTDRCNK(SEQ ID No:1)其中X4代表任何氨基酸；或展現與序列SEQ ID No:1至少56%的同一性并保留包括序列SEQ ID No:1的所述肽的生物特性的序列。
2.按權利要求1所述的肽，其中所述肽是包含選自由ASICla亞基和ASIClb亞基組成的組的至少一種亞基的至少一種ASIC通道的阻斷劑。
3.按權利要求2所述的肽，其中所述肽是同聚體ASICla通道、同聚體ASIClb通道、異聚體ASICla+ASIClb通道和/或異聚體ASICla+ASIC2a通道的阻斷劑。
4.按權利要求1至3任一項所述的肽，其中在序列SEQID No:1中，X4代表Y或F。
5.一種多核苷酸，包括編碼如權利要求1至4任一項所定義的肽的核苷酸序列。
6.按權利要求5所述的多核苷酸,包括核苷酸序列: atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaatg t73txx75caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgcc ttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:4);或ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacact ggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaa taagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(SEQ ID No:22)；其中 73txx75 和 1Qtxx12 代表 tac、tat、ttt 或 ttc。
7.按權利要求5所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴格條件下與核苷酸序列SEQID No:4或SEQ ID No:22、或其互補序列雜交。
8.按權利要求5或7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括展現與序列SEQID No:4或序列SEQ ID No:22至少76%的同一性的天然或合成序列。
9.一種載體，包含如權利要求5至8任一項所定義的多核苷酸。
10.按權利要求9所述的載體，其中所述載體是表達載體。
11.一種宿主細胞，包括一種或多種如權利要求1至4任一項所定義的肽、如權利要求5至8任一項所定義的多核苷酸、或如權利要求9和10任一項所定義的載體。
12.一種藥物組合物，包括一種或多種如權利要求1至4任一項所定義的肽、如權利要求5至8任一項所定義的多核苷酸、如權利要求9和10任一項所定義的載體、或如權利要求11所定義的宿主細胞。
13.一種物質,選自: -如權利要求1至4任一項所定義的肽； -如權利要求5至8任一項所定義的多核苷酸； -如權利要求9和10任一項所定義的載體；或 -如權利要求11所定義的宿主細胞； -如權利要求12所定義的藥物組合物； 所述物質用作藥物。
14.按權利要求13所述的物質，其中所述藥物是鎮痛劑。
15.按權利要求14所述的物質，其中所述鎮痛劑預期用于預防或治療牽涉ASIC通道的活化的疼痛或病理狀況。
16.按權利要求15所述的物質，其中所述牽涉ASIC通道的活化的疼痛和病理狀況選自包括以下的組:炎癥性疼痛、神經病性疼痛、癌癥相關疼痛、手術后疼痛、肌肉骨骼痛和內臟痛、炎癥、癌癥、纖維肌痛和過敏性腸綜合征。
17.按權利要求13所述的物質，其中所述藥物預期用于預防或治療選自包括以下的組的中樞神經病:抑郁、焦慮、中風、癲癇、中樞炎癥和神經退行性疾病。
18.按權利要求13至17任一項所述的物質，其中所述藥物被中樞地、皮下地、經皮地、全身地、口服地或經由呼吸途徑施用。
19.一種物質,選自: -如權利要求1至4任一項所定義的肽； -如權利要求5至8任一項所定義的多核苷酸； -如權利要求9和10任一項所定義的載體；或 -如權利要求11所定義的宿主細胞； -如權利要求12所定義的藥物組合物； 所述物質用作診斷工具。
20.一種鑒定模擬如權利要求1至4任一項所定義的肽的鎮痛活性的化合物的方法，包括以下步驟: a.確定如權利要求1至4任一項所定義的肽的鎮痛活性； b.確定候選化合物的鎮痛活性； c.比較步驟a.和步驟b.獲得的鎮痛活性； d.選擇具有與所述肽的鎮痛活性相當或比所述肽的鎮痛活性更大的鎮痛活性的候選化合物。
21.一種鑒定模擬如權利要求1至4任一項所定義的肽的鎮痛活性的化合物的方法，包括以下步驟: a)將如權利要求1至4任一項所定義的肽與樣品接觸，并測量所述肽與所述樣品的結合； b)加入候選化合物， 并評價所述化合物對所述肽與所述樣品的結合的影響； c)選擇能夠調節所述肽與所述樣品的結合的候選化合物。
全文摘要
本發明涉及引起痛覺缺失并抑制ASIC通道(酸敏感離子通道)的新型分離的肽，涉及編碼所述肽的多核苷酸，還涉及包含其的藥物組合物、宿主細胞和載體。具體地，所述肽從蛇黑樹眼鏡蛇(Dendroaspis polylepis)的毒液分離。本發明還涉及其用作診斷工具或用作藥物、具體地用作鎮痛劑、或用于鑒定鎮痛劑分子或抑制ASIC通道的分子的用途。
文檔編號C07K14/46GK103097404SQ201180043328
公開日2013年5月8日 申請日期2011年7月26日 優先權日2010年7月26日
發明者埃里克·林古艾格利亞, 西爾維·狄奧舒特, 安妮·巴倫-福斯特, 米格爾·薩利納斯, 米歇爾·拉茲敦斯基 申請人:國家科學研究中心