專利名稱：抗凝血肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的抗凝血肽，這些抗凝血肽本身又是開發抗凝劑有價值的試劑。
在例如急性深靜脈血栓形成、肺栓塞、四肢的急性動脈栓塞形成、心肌梗塞、和散布性血管內血凝固的藥物治療中，抗凝劑是有用的治療劑。據信抗凝劑的預防性給藥可預防患風濕性或動脈硬化性心臟病患者復發栓塞和預防某些外科血栓栓塞并發癥。抗凝劑也可用于治療冠狀動脈和腦血管疾病。動脈栓塞形成，特別是發生在供養心肌和腦的動脈中，是死亡的誘因。
水蛭素是一種分離自水蛭唾液腺的65個氨基酸殘基的多肽。它是一種抗凝血劑，即凝血酶特異性抑制劑。盡管分離自水蛭提取物的水蛭素相當有效，但其臨床應用似乎是不可能的，因為其量是有限的，昂貴，和通常在任何這一大小的外來蛋白給藥之后出現變態反應。
申請人首先發現了一個至少可部分擔負其抗凝血活性的水蛭素的特定區域。用化學方法合成了該肽區域(水蛭素的55～65個氨基酸)，該區域可與凝血酶的識別位點結合;該識別位點與酶的切割位點在空間上是截然不同的。合成肽的結合還表明可競爭性防止血纖維蛋白原與凝血酶識別位點的結合，這是血纖維蛋白產生和凝塊形成的重要的先決條件，因而其作為抗凝劑具有潛在的醫學價值。
申請人已進一步制備了在其基本序列中含有單個氨基酸缺失的這種肽的衍生物。具體講，這一系列氨基酸缺失總地看來可在位置和組成上限定肽的序列依賴性程度，并可為藥物的持久合理設計提供基礎。許多這種類型的肽類似物具有母體肽的屬性，因此也可作為對抗凝血治療有科學價值和明顯療效的輔助劑。而且，氨基酸類似物本身可具有增強的效力和持久的作用期。
下式的肽衍生物是有用的抗凝血劑，X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端殘基，選自氫、一個或兩個具有1～10個碳原子的烷基，一個或兩個具有2～10個碳原子的酰基，芐氧羰基或叔丁氧羰基;
A1是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個鍵，或含有1～11個任何氨基酸殘基的肽;
A2是Phe，SubPhe，PClPhe，Pgl，Tha，His，Nap，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-萘基)丙氨酸，Tyr，I-Tyr，或Trp;
A3是一個鍵，或是Glu，Asp，或Ala;
A4是一個鍵，或是任何氨基酸;
A5是一個鍵，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala;
A6是一個鍵，或是Pro，Hyp，3，4-dihydroPro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMePgl，Azt，Pip，或D-Ala;
A7是一個鍵，或是任何L-氨基酸;
A8是一個鍵，或是任何L-氨基酸;
A9是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有這些氨基酸或親脂性氨基酸之一的二肽;
A10是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個鍵或含有1～11個任何氨基酸殘基的肽;
Y是羧基末端殘基，選自OH，(C1-C8)烷氧基，氨基，或單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸;
其中在A3至A8中的至少一個位置是一個鍵。
本說明書中所用的(1)氨基酸及其三字母代碼，(2)修飾的和異常的氨基酸，和(3)末端氨基和羧基取代基的常用縮寫如下(1)氨基酸及其三字母代碼L-氨基酸 D-氨基酸Ala(或A)-丙氨酸 D-Ala(或a)-D-丙氨酸Arg(或R)-精氨酸 D-Arg(或r)-D-精氨酸Asn(或N)-天冬酰胺 D-Asn(或n)-D-天冬酰胺Asp(或D)-天冬氨酸 D-Asp(或d)-D-天冬氨酸Cys(或C)-半胱氨酸 D-Cys(或c)-D-半胱氨酸Gly(或G)-甘氨酸Glu(或E)-谷氨酸 D-Glu(或e)-D-谷氨酸Val(或V)-纈氨酸 D-Val(或v)-D-纈氨酸Gln(或Q)-谷氨酰胺 D-Gln(或q)-D-谷氨酰胺
His(或H)-組氨酸 D-His(或h)-D-組氨酸Ile(或I)-異亮氨酸 D-Ile(或i)-D-異亮氨酸Leu(或L)-亮氨酸 D-Leu(或l)-D-亮氨酸Lys(或K)-賴氨酸 D-Lys(或k)-D-賴氨酸Phe(或F)-苯丙氨酸 D-Phe(或f)-D-苯丙氨酸Met(或M)-蛋氨酸 D-Met(或m)-D-蛋氨酸Pro(或P)-脯氨酸 D-Pro(或p)-D-脯氨酸Ser(或S)-絲氨酸 D-Ser(或s)-D-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸 D-Thr(或t)-D-蘇氨酸Trp(或W)-色氨酸 D-Trp(或w)-D-色氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸 D-Tyr(或y)-D-酪氨酸(2)修飾的和異常的氨基酸Aba-α-氨基-正丁酸pClPhe-對氯苯丙氨酸Cha-環己基丙氨酸Chg-環己基甘氨酸Hyp-羥脯氨酸I-Tyr-3-碘代酪氨酸，5-碘代酪氨酸，3，5-二碘代酪氨酸YMeGlu-D-谷氨酸γ甲酯NMePhe-N-甲基苯丙氨酸NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸
Npa-β-(萘基)丙氨酸3，4-dihydroPro-3，4-二羥脯氨酸PNO2Phe-對硝基苯丙氨酸Nle-正亮氨酸Orn-鳥氨酸Pip-2-哌啶酸酯Pba-對氨基苯基丁酸pSubPhe-對位取代的苯丙氨酸Pgl-苯基甘氨酸Sar-肌氨酸(N-甲基甘氨酸)SubPhe-鄰，間，或對，單或雙取代的苯丙氨酸Tha-β-(2-噻吩基)丙氨酸Tiq-四氫異喹啉3-羧酸酯(3)氨基和羧基末端酸性取代基Ac-酰基Azt-氮雜環丁烷-2-羧酸酯Cin-肉桂酰3，4-dihydroCin-3，4-二氫肉桂酰Glt-戊二酰Mal-馬來酰Oac-8-氨基辛酸Oct-正辛基Suc-琥珀酰
Tfa-三氟乙酰＃-C-末端酰胺以下標明了水蛭素已知天然存在的氨基酸序列的變異水蛭素的氨基酸序列的變異12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu CysIle Thr
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys CysLys29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr GlyAsn Lys GlyGln Asp
43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glx Ser His Asn Asp Gly Asp PheAsn Glu
57 58 59 60 61 62 63 64 65Glu Glu ILe Pro Glu Glu Tyr Leu GlnPro Asp Asp Glu(Ala63Tyr64Leu/Asp64Glu65)
除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都含有手性碳原子。除特別指出者外，本文涉及的光學活性氨基酸都具有L-構型。例如，任何A1或A10組的氨基酸可具有D-或L-構型。按照習慣，本文所書寫的肽的結構是使氨基末端位于鏈的左側，羧基末端位于鏈的右側。
烷基和烷氧基的烷基部分應被看作包括直鏈、支鏈或環狀烷基，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環戊基、己基、異己基、環己基和環戊基甲基、庚基、辛基(Ot)、8-氨基辛酸(Oac)。具有2～10個碳原子的酰基應被看作包括直鏈、支鏈、環狀、飽和和不飽和酰基，每個基團上帶有1或2個羰基，例如，乙酰(Ac)、氮雜環丁烷-2-羧酸酯(Azt)、苯甲酰琥珀酰、肉桂酰(Cin)、3，4-二氫肉桂酰(3，4-dihydrocin)、馬來酰(Mal)、和戊二酰(Glt)。烷基和酰基取代基都被看作包括那些帶有鹵素取代基的基團，其中鹵素基團是氟、氯、溴或碘，例如，三氟乙酰(Tfa)。
本文所用的術語“任何氨基酸”不意欲包括任何有氨基取代基的羧酸，而是多肽衍生物領域的技術人員常用的，其包括天然存在的氨基酸以及在制備天然存在肽的合成類似物時肽化學領域的技術人員常用的其它“非蛋白質”α-氨基酸。天然存在的氨基酸都是“L-氨基酸'，有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、鳥氨酸、和賴氨酸。作為“任何氨基酸”還應包括天然存在的L-氨基酸的D-異構體(“D-氨基酸”);即D-丙氨酸、D-纈氨酸、D-亮氨酸、D-異亮氨酸、D-絲氨酸、D-蛋氨酸、D-蘇氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、D-半胱氨酸、D-脯氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-天冬酰胺、D-谷氨酸、D-精氨酸。還包括“非蛋白質”α-氨基酸，例如正亮氨酸、正纈氨酸、別異亮氨酸、高精氨酸、硫代脯氨酸、二氫脯氨酸、羥脯氨酸(Hyp)、高絲氨酸、環己基甘氨酸(Chg)、α-氨基-正丁酸(Aba)、環己基丙氨酸(Cha)、氨基苯基丁酸(Pba)、在鄰位間位或對位上被(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、鹵素或硝基中的一個或兩個基團單取代或雙取代的或被亞甲二氧基取代的苯丙氨酸，例如對位取代的苯丙氨酸(PSubPhe)和對氯苯丙氨酸，和對硝基苯丙氨酸(PNO2Phe)、β-2-和3-噻吩基-丙氨酸、β-2-和3-呋喃基丙氨酸、β-2-，3-，和4-吡啶基丙氨酸、β-(苯并噻吩-2-和3-基)丙氨酸、β-(1-和2-萘基)丙氨酸(NPa)，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的O-烷基化衍生物、谷氨酸和天冬氨酸的甲基酯、S-烷基化半胱氨酸、酪氨酸的O-硫酸酯和鹵化酪氨酸，例如3-碘代酪氨酸、5-碘代酪氨酸、3，5-二碘代酪氨酸。
關于“水蛭素或其天然變體的序列”，申請人意指見于水蛭素的氨基酸序列性質上適用。
術語“該序列的一部分”是指包括衍生于水蛭素或其變體序列的4個氨基酸的連續區域。
術語“親脂性氨基酸”包括Tyr，Phe，Leu，Met，Nle Ile，Val，和Pro。此外，術語“亞氨基酸”是指包括所有N-烷基氨基酸。亞氨基酸的實例為N-甲基苯丙氨酸(NMePhe)、N-甲基苯基甘氨酸(NMePgl)、3，4-二氫脯氨酸(3，4-dihydroPro)、對氨基苯基丁酸(Pba)、肌氨酸(Sar)、和脯氨酸(Pro)、2-哌啶酸酯(Pip)。
“含有1-11個任何氨基酸殘基的肽”是指反映出氨基酸加到核心氨基酸(A2-A9)的氨基或羧基未端可構成具有其固有活性的核心結構。
式1的多肽可與任何無毒的有機酸或無機酸形成藥物上可接受的鹽。可形成適宜鹽的無機酸實例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸及酸性金屬鹽，例如磷酸氫二鈉和硫酸氫鈉。可形成適宜鹽的有機酸實例包括一元、二元和三元羧酸。例如這類酸有乙酸、乙醇酸、乳酸、三聚氰酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、蘋果酸、馬來酸、灑石酸、檸檬酸、抗壞血酸、富馬酸、羥基富馬酸、苯甲酸、羥苯甲酸、苯基乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羥基乙磺酸。羧基末端氨基酸部分的鹽包括與任何適宜的無機堿或有機堿形成的無毒羧酸鹽。作為例證，這些鹽包括堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽;堿土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽;ⅢA族的輕金屬鹽，包括鋁鹽;和有機伯、仲和叔胺，例如，三烷基胺，包括三乙胺、普魯卡因、二芐胺、1-乙胺、N，N′-二芐基亞乙基二胺、二氫松香胺、N-(低級)烷基哌啶，和任何其它適宜胺的鹽。
對于化合物的一般基團來說，某些基團是優選的。申請人優選其中各基團定義如下的式1所示的肽衍生物X為氫、乙酰、或琥珀酰;
A1為一個鍵或為包括1-54氨基酸水蛭素或其天然變體序列或其區域;
A2為一個鍵或為Tyr，Trp，Glu，His，Leu，Phe，D-Phe，SubPhe，PclPhe，NMePhe，Tha，3，4-dihydrocin，Cin，Nap，β-(2-和3-噻吩)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，或β-(1-和2-萘基)丙氨酸;
A3是一個鍵，或Glu，Ala;
A4是一個鍵，或Glu，Asp，Pro，Ala，Azt，Pip、亞氨基酸或D-氨基酸;
A5是一個鍵，或Ile，Leu;
A6是一個鍵，或Pro，Sar，D-Ala，Hyp或NMepgl;
A7是一個鍵，或Glu，Gln，Asp或Ala;
A8是一個鍵，或Glu，Asp或Ala;
A9是一個鍵，或Ala，Pro，Cha，或二肽Ala-Tyr，Tyr-Leu，Ala-Phe，Tyr-Tyr，Ala-Leu，Tyr-Ala，Glu-Leu，D-Tyr-Leu，Leu-Phe，Sar-Cha，Pro-Cha，Cha-Leu，Ala-Cha，Tyr-Cha;
A10是一個鍵，或YMeGlu，Glu，D-Glu，Asn，D-Asn，Asn-Ol，Pro，Gln，Ala，Lys，D-Lys，Asp，Orn，Asp，或為Ala;和Y是選自OH，(C1-C8)烷氧基，氨基，單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸的羧基末端殘基，或是醇末端殘基;
其中A3至A9中至少一個位置是一個鍵。
其中各基團定義如下的式1所示的肽衍生物是特別優選的X是Suc，Mal;
A1是一個鍵;
A2是Tyr，Phe，Nap;
A3是Glu，或是一個鍵;
A4是Glu，Pro，Tiq，或是一個鍵;
A5是Ile，或是一個鍵;
A6是Pro，或是一個鍵;
A7是Glu，或是一個鍵;
A8是Glu，或是一個鍵;
A9是Ala-Cha，Tyr-Leu，Ala，Cha;
A10是Gln，D-Glu，Asn;和Y是OH，NH2。
其中A3至A8中至少一個位置是一個鍵。
合成本發明的蛋白質可用各種本領域技術人員易于得知的方法來制備。這類方法包括液相肽合成，固相連續和嵌段合成，基因克隆和這些技術的結合。固相連續法可使用所建立的自動化方法采用自動肽合成儀進行。在該程序中，肽在樹脂上構建，從C-末端被保護的氨基酸開始。所用的樹脂載體可以是任何本領域內常用的適于多肽固相制備的樹脂，最好是已與0.5至約3%二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯，已使之氯甲基化或羥甲基化以為與最初引入的α-氨基被保護的氨基酸形成酯提供位點。對于C-末端酰胺，可使用甲基二苯甲基胺樹脂。在在序列的偶聯完成之后，除去或適當保留BOC保護基或將其脫除并使N-末端氨基酰化。用適當的氨基醇從樹脂上置換出被保護的片段。
Bodanszhy等人述及了一例羥甲基樹脂〔Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)〕。氯甲基化樹脂可購自Bio Rad Laboratories，Richmond，California，Stewart等人在“固相肽合成”第一章第1-6頁述及了這種樹脂的制備(Freeman & CO，San Francisco 1969)。許多與樹脂結合的保護的氨基酸是商業上可得到的。作為一例，為了制備其中羧基末端是D-Glu殘基的本發明的多肽，可使用與芐基化，羥甲基化苯乙酰氨基甲基(PAM)樹脂結合的叔丁氧羰基(BOC)保護的D-Glu。
在α-氨基被保護的氨基酸與樹脂載體偶聯之后，用任何適宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，單獨用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脫除保護基。去保護可在0℃至室溫的某一溫度下進行。也可使用其它標準解離試劑和條件脫除特定的α-氨基保護基。在脫除α-氨基保護基之后，按所需順序將其它氨基被保護的氨基酸逐步偶聯。另外，多種氨基酸基團在與載有氨基酸序列的樹脂偶聯之前可用溶液法偶聯。
用于引入到多肽序列中的各個氨基酸的α-氨基保護基可以是任何本領域已知的這種保護基。在各類α-氨基保護基中，可考慮(1)酰基型保護基，例如甲酰基、三氟乙酰基、鄰苯二甲酰基、甲苯磺酰基、鄰硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰;(2)芳族氨基甲酸乙酯型保護基，例如芐氧羰基和取代的芐氧羰基，如對氯芐氧羰基、對硝基芐基羰基、對溴芐氧羰基、對甲氧芐氧羰基、1-(對聯苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧芐氧羰基和二苯甲氧羰基;(3)脂族氨基甲酸乙酯保護基，例如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)環烷基氨基甲酸乙酯型保護基，例如環戊氧羰基、金剛烷氧羰基和環己氧羰基;(5)硫代氨基甲酸乙酯型保護基，例如苯基硫代羰基;和(6)烷基型保護基，例如三苯甲基和芐基。優選的α-氨基保護基是叔丁氧羰基。
如固相肽合成領域所知，許多氨基酸都具有在鏈制備過程中需要保護的官能度。使用和選擇適當的保護基屬本領域的技術人員應有的能力，并應取決于欲保護的氨基酸和肽上其它被保護的氨基酸殘基的存在。這種側鏈保護基的選擇是關鍵的，其中它必須是不會在α-氨基部分保護基解離過程中被解離而除去的基團。例如，適于賴氨酸的側鏈保護基是芐氧羰基和取代的芐氧羰基，所述的取代基應選自鹵素(例如氯、溴、氟)和硝基(例如，2-氯芐氧羰基、對硝基芐氧羰基、3，4-二氯芐氧羰基)、甲苯磺酰基、叔戊氧羰基、叔丁氧羰基和二異丙氧羰基。蘇氨酸和絲氨酸的醇羥基可用乙酰基、苯甲酰基、叔丁基、三苯甲基、芐基、2，6-二氯芐基或芐氧羰基保護。優選的保護基是芐基。
選擇適當的偶聯試劑屬于本領域的技能。欲加入的氨基酸是Gln，Asn或Arg的特別適宜的偶聯試劑是N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基苯并三唑。這些試劑的使用可防止腈和內酰胺的形成。其它偶聯劑是(1)碳化二亞胺(例如，N，N′-二環己基碳化二亞胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亞胺);(2)氨基腈(例如，N，N-二芐基氨基氰);(3)乙烯酮亞胺;(4)異噁唑鎓鹽(例如，N-乙基-5-苯基-異噁唑鎓-3-磺酸鹽);(5)環中含有1-4個氮原子的具有芳族特性的單環含氮的雜環酰胺，例如咪唑酰胺、吡唑酰胺、和1，2，4-三唑酰胺。具體適用的雜環酰胺包括N，N′-羰基二咪唑和N，N-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化乙炔(例如，乙氧乙炔);(7)可與氨基酸的羧基部分形成混合酐的試劑(例如，氯甲酸乙酯和氯甲酸異丁酯)或欲偶聯氨基酸的對稱酐(例如，Boc-Ala-O-Ala-Boc);(8)在一個環氮原子上帶有羥基的含氮雜環化合物(例如，N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和1-羥基苯并三唑)和(9)Castro氏試劑(BOP)。其它活化試劑及其在肽偶聯中的應用詳見Kepoor，J.Pharm，SCi，59，PP，1-27(1970)，申請人優先使用對稱酐作為除Arg、ASn和Gln之外的所有氨基酸的偶聯試劑。
將各被保護的氨基酸或氨基酸序列以大約過量4倍的量引入到固相反應器中并在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)的介質中或單獨在二甲基甲酰胺中或最好單獨在二氯甲烷中進行偶聯。在未完全偶聯的情況下，可在脫除α-氨基保護基之前重復偶聯步驟，然后在固相反應器中進行下一個氨基酸的偶聯。在合成各階段偶聯反應是否成功由E.Kaise等人所述的茚三酮反應監測(Analyt.Biochem.34，595(1970))。
在α-氨基被保護的氨基酸與樹脂載體偶聯之后，用任何適宜的方法，例如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，單獨用三氟乙酸，或用溶于二噁烷的HCl脫除保護基。去保護可在0℃至室溫的某一溫度下進行。也可使用其它標準解離試劑和條件脫除特定的α-氨基保護基。在脫除α-氨基保護基之后，按所需順序將其它氨基被保護的氨基酸逐步偶聯。另外，多種氨基酸基團在與載有氨基酸序列的樹脂偶聯之前可用溶液法偶聯。
在獲得所需氨基酸序列之后，從樹脂上移出肽并去保護。可通過水解，例如通過在消除劑(例如茴香醚)存在下用無水液態HF處理與樹脂結合的多肽完成上述過程。一般在肽鏈合成完全后脫除保護基，但也可在任何其它適當的時間脫除保護基。
去保護肽的純化和分析可通過多種標準方法完成。適當純化和分析方法的選擇屬于本領域的技能。適宜的純化方法是制備HPLC。純化肽的分析可通過分析HPLC、氨基酸分析、快原子轟擊質譜分析、和任何其它適宜的分析手段來進行。
治療應用本發明的肽衍生物的抗凝血劑量是每天每kg患者體重0.2mg至250mg，取決于待治療患者血栓形成癥狀的嚴重程度和所選的肽衍生物。適于某一患者的劑量可容易地確定。最好每天分1-4劑給藥，一般每劑含5mg至100mg活性化合物。在體外介質如貯存的全血中抑制或防止血液凝結所需本發明肽的量可由本領域的技術人員容易地確定。
抗凝血療法可用于治療和預防各種血栓形成癥狀，特別是冠狀動脈和腦血管疾病。在這一領域有經驗的人員都易于掌握需要抗凝血治療的情況。本文所用的術語“患者”應看作是指哺乳動物如靈長類，包括人、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。血液凝結的抑制不但適用于患有血栓形成病癥個體的抗凝血治療，而且適用于任何需要抑制血液凝結的時候，例如可防止貯存全血的凝結和防止用于試驗或貯存的其它生物樣品的凝結。
盡管某些肽衍生物在口服并通過腸道后仍然存在，但申請人優選非口服給藥，例如皮下、靜脈內、肌內或皮內給藥。給藥方式有儲存注射;植入制劑;或例如在含有本發明肽衍生物的噴灑煙霧劑的容器中以噴霧或干粉形式施用于粘膜，如鼻、咽喉和支氣管粘膜。
對于非腸道使用，化合物可以可注射劑量給藥，該化合物可用藥理上可接受的稀釋劑配成溶液或懸浮液，藥物載體可為一種無菌液體如水和油類，加有或不加有表面活性劑和其它可藥用試劑。可用于這些制劑的油類實例有石油、動物、植物、或合成來源的油類，例如，花生油，豆油、和礦物油，水，鹽水、含水右施糖和相關的糖溶液、乙醇和二醇類如丙二醇或乙二醇是優選的液體載體，特別適用于可注射溶液。
化合物可以儲存注射或植入制劑形式給藥，植入制劑可以使有效成分持續釋放的方式配制。可將有效成分壓成丸粒或小圓柱體并以儲存注射或植入方式徑皮下或肌內植入。植入物可使用惰性材料，例如可生物降解的聚合物或合成硅氧烷，例如Silastic，它是Dow-Corning Corg生產的硅氧烷橡膠。
實施例本發明可用下列非限制性實例加以說明。
實施例1抗凝血肽的制備在Vega半自動肽合成儀上，用8.3mmol的0.56mmol/g Bod D-Glu(Bzl)Merrifield樹脂，通過固相法合成肽，用18.3mmol Nα-Boc-氨基酸(Peptides International)進行單對稱酐偶聯，但對于Boc-Cha，需要兩次偶聯反應才能作出陰性Kaiser試驗。將部分肽樹脂(0.7～1.5g)在3～8個周期之后取出并放在一邊;對于des-Glu57，在8個周期之后保留1.36g(0.50mmol)Boc-Pro-Ile-Pro-Glu(Bzl)-Glu(Bzl)-Ala-Cha-D-Glu(Bzl)Merrifielcl樹脂。將被保護肽片段樹脂轉移到應用生物系統反應容器中，其中加入與2.0mmol氨基酸進行雙對稱酐偶聯的Boc-Tyr(2-BrZ)，用溶于二氯甲烷的50%三氟乙酸脫除Nα-Boc保護，用溶于二氯甲烷的10%二異丙基乙胺沖洗三次進行中和，用二氯甲烷洗三次，并在氮氣流下干燥。經在二甲基甲酰胺中進行雙對稱酐偶聯使肽Nα琥珀酰化，用二甲基甲酰胺沖洗三次，用溶于二氯甲烷的10%二異丙基乙胺洗兩次進行中和，用二氯甲烷洗三次并真空干燥。將肽去保護并用含有5%茴香醚的無水HF在0℃解離60分鐘。在0℃下真空除去HF;用25%含水乙腈從樹脂中取出肽，冷凍并凍干。
在0.1%含水三氟乙酸中以29.6-31.6%乙腈線性梯度，以80ml/分的速率，歷時15分鐘，在C18Beckman50.8×150mm柱上進行制備HPLC。收集并凍干主峰(在280nm處監測)，得到281mg所需產物。用HPLC測定均勻性Vydac 218 TP54(4.6×250mm)C18柱，2.0ml/分，t0＝1.5分，以15-40%乙腈線性梯度經25分鐘洗脫至0.1%三氟乙酸的時間是17.1分鐘。
純化的標記肽的分析給出了所需的分子離子峰(FAB-MS)并根據所需肽進行了氨基酸分析。用這種方法，下列肽具有如下所示的固定的物理特性。
在凝血酶誘導的血纖維蛋白凝血塊抑制測定中試驗了樣品。所有測定溶液都是用含有0.12M氯化鈉，0.01M磷酸鈉，0.01%疊氮化鈉和0.1%牛血清白蛋白的測定緩沖液(pH7.4)配制的。將牛凝血酶滴定至適當的濃度以便能夠通過微滴板讀數器(Bio-Tek EL309)在405nm處60分鐘內監測血纖維蛋白凝塊的形成。將這種凝血酶溶液(50μl;0.2Pmol)加到含有50μl待試合成肽溶液的微滴板孔中。攪拌1分鐘并在20℃再保溫10分鐘后，加入100μl于0.1%EDTA中的稀血漿(1∶10)并渦旋20秒鐘。用自動讀數器，以5分鐘的間隔監測溶液的濁度。根據結果計算IC50，IC50被定義為相對于不含抑制劑的對照可導致觀察到的混濁度之半的肽濃度。這相當于血纖維蛋白凝塊形成時間增加兩倍。對于用人凝血酶進行的測定來說，在30分鐘內將人和牛凝血酶以同樣速率滴定到可產生血纖維蛋白凝塊的濃度。這樣，下列肽具有固定的生物學特性，在下示實例中，+表示IC50＞25μM和＜200μM，++表示IC50＜25μM。
1)Suc-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.08 1.97 0.96 0.99 0.99體外效價+2)H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OHMW 1370 FAB-MS(MH)+1371Z(5) Ile(1) Tyr(1) Gly(1) B(1) Phe(1) Leu(1)4.93 0.85 0.95 1.09 1.10 1.08 0.99體外效價+
3)Suc-Tyr-Glu-Pro-Tiq-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1278 FAB-MS(MH)+1279Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) Cha(1)4.05 0.93 0.96 0.95 1.03 1.03體外效價++4)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.94 0.96 1.01 0.95體外效價++5)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-Gln-NH2MW 1256 FAB-MS(MH)+1257Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.15 1.98 0.91 0.97 1.05體外效價++6)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-Asn-OHMW 1184 FAB-MS(MH)+1185B(1) Z(2) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)1.02 2.09 1.98 0.93 1.01 0.97體外效價++7)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Asn-OHMW 1161 FAB-MS(MH)+1162Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1) B(1)3.14 1.95 0.95 1.00 0.96 1.01體外效價++8)Mal-Tyr-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1198 FAB-MS(MH)+1198Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.06 2.01 0.95 0.99 1.01體外效價+9)Suc-Nap-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1234 FAB-MS(MH)+1234
Z(3) Pro(2) Ile(1) Ala(1)3.08 2.00 0.94 0.97體外效價++10)Suc-Tyr-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.07 0.99 0.96 0.98 0.99體外效價+11)Suc-Tyr-Glu-Pro-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1216 FAB-MS(MH)+1217Z(4) Pro(2) Tyr(1) Ala(1)4.05 1.97 0.98 1.00體外效價+12)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1232 FAB-MS(MH)+1233Z(4) Pro(1) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.10 1.01 0.94 0.96 0.99體外效價++13)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Z(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.16 1.97 0.93 0.96 0.98體外效價++14)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-D-Glu-OHMW 1176 FAB-MS(MH)+1177Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.08 1.97 0.96 0.99 1.00體外效價++
15)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Cha-D-Glu-OHMW 1258 FAB-MS(MH)+1259Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1)4.10 2.01 0.91 0.98體外效價++16)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-OHMW 1175 FAB-MS(MH)+1175Z(4) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)4.11 1.98 0.93 1.01 0.97體外效價++17)Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Gln-NH2MW 1158 FAB-MS(MH)+1159Z(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1) Phe(1)4.10 2.05 0.93 0.96 0.97體外效價+18)Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-OHMW 1200 FAB-MS(MH)+1201Glx(3) Pro(2) Ile(1) Tyr(1) Ala(1)3.10 1.94 0.98 0.99 0.99體外效價++19)Suc-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D-Glu-OHMW 1166 FAB-MS(MH)+1167Glx(4) Pro(2) Ile(1) Ala(1)4.12 1.95 0.96 0.98體外效價+
權利要求
1.下式的肽衍生物及其可作藥用的鹽的制備方法X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-Y其中X是氨基末端殘基，選自氫、1或2個具有1-10個碳原子的烷基、1或2個具有2-10個碳原子的酰基、芐氧羰基或叔丁氧羰基；A1是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分、一個鍵、或是含有1-11個任何氨基酸殘基的肽；A2是一個鍵或是Phe，Subphe，Pclphe，D-phe，NMephe，pgl，Tha，His，Cin，Nap，Leu，Gln，3，4-dihydroCin，β-(2-和3-噻吩基)丙氨酸，β-(2-和3-呋喃基)丙氨酸，β-(2-，3-，和4-吡啶基)丙氨酸，β-(苯并噻吩-2-和-3-基)丙氨酸，β-(1-和2-苯基)丙氨酸，TYr或Trp；A3是一個鍵，或是Glu，Asp，或Ala；A4是一個鍵，或是任何氨基酸；A5是一個鍵，或是Ile，Val，Leu，Nle，Phe，Ala，或D-Leu；A6是一個鍵，或是Pro，Hyp，3，4-dihydropro，噻唑烷-4-羧酸酯，Sar，NMepgl，Azt，Pip，Ala或D-Ala；A7是一個鍵，或是任何氨基酸；A8是一個鍵，或是任何氨基酸；A9是一個鍵，或是Tyr，I-Tyr，D-Tyr，His，Ala，Met，Trp，Phe，Leu，Nle，Ile，Val，Cha和Pro或是至少含有這些氨基酸或親脂性氨基酸之一的二肽；A10是水蛭素或其天然變體的序列或該序列的一部分，一個鍵，或是含有1-11個任何氨基酸殘基的肽；Y是羧基末端殘基，選自OH，(C1-C8)烷氧基、氨基、單或雙(C1-C4)烷基取代的氨基酸，或是醇末端殘基；其中A3至A9中至少一個位置是一個鍵；該方法包括以下步驟a)使用一個適當結合有其C-末端被保護的A10組氨基酸的樹脂；b)依次偶聯A9至A1組α-氨基被保護的氨基酸，以達到被保護的所要求的氨基酸序列；c)除去所說保護基并純化所需肽。
2.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A2是Tyr，Nap，phe。
3.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A3是一個鍵，或Glu。
4.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A4是一個鍵，pro，Tiq，亞氨基酸，或D-氨基酸。
5.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A5是一個鍵，Ile。
6.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A6是一個鍵，pro。
7.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A7是一個鍵，Glu或Ala。
8.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A8是一個鍵，Glu或Asp。
9.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A9是Ala，Cha，Ala-Cha，Tyr-Leu。
10.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中A10是Gln，Asn，或D-Glu。
11.權利要求1的肽衍生物的制備方法，其中X是H，或NH2。
12.一種減少需治療患者中血液凝結的方法，該方法包括施用有效抗凝血量的權利要求1-11之一的肽衍生物和藥物上可接受的載體。
13.一種減少某一介質中血液凝結的方法，該方法包括使該介質與抗凝血有效量的權利要求1-11之一的肽接觸。
14.一種為權利要求1-11的天然存在的水蛭素類似物的肽，其含有負責與凝血酶結合的結合位點，因此能作為凝血酶的競爭性抑制劑。
全文摘要
本發明涉及作為有用的抗凝血劑的肽衍生物。
文檔編號C07K14/815GK1050720SQ90108049
公開日1991年4月17日 申請日期1990年9月30日 優先權日1989年10月3日
發明者約翰·L·卡斯特南凱 申請人:默里爾多藥物公司