本發明涉及醫藥技術領域，具體地說是一種苯并咪唑酰胺類化合物、制備方法及其應用。
背景技術：
Hedgehog基因是在1980s早期由Wieschaus和Nusslein-Vollhard在果蠅中首次發現。Hedgehog(Hh)信號通路主要由分泌型糖蛋白配體Hedgehog、跨膜蛋白受體Ptched(Ptch)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、核轉錄因子Gli蛋白及下游靶基因組成。正常體內，組織Hh配體表達關閉，Ptch與Smo結合抑制Smo的活性，該通路處于關閉狀態。當Hh與Ptch結合，解除了Ptch對Smo的抑制作用，Smo將信號傳導至細胞質內，激活下游Gli轉錄因子進而活化整個信號通路。近年來，Hh信號通路與腫瘤的關系日益受到人們的重視。有文獻表明，在正常條件下，Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎時期調控組織細胞的生長和分化。胚胎發育成熟后，該通路進入關閉狀態。另有多項研究表明，Hh信號通路的異常激活與多種腫瘤密切相關，如皮膚基底細胞癌、髓母細胞瘤、肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌、胰腺癌等。因此，阻斷腫瘤細胞中的Hh信號通路將是人類治療腫瘤的一個新的有效手段。隨著研究的進行，Hh信號通路在腫瘤發生、發展過程中的作用也越來越清晰。在大量的人類腫瘤細胞中，Hh信號通路持續激活并調控下游的基因轉錄，從而參與腫瘤的增殖分化、細胞凋亡、血管新生和侵襲轉移。因此針對Hh信號通路的靶向抑制也成為抗癌治療的熱點。有文獻記載Hh信號通路的抑制劑主要分為3類：Shh抑制劑、Smo抑制劑和Gli轉錄抑制劑。其中Smo抑制劑Cyclopamine能抑制Smo的活性，阻止Hh信號通路的激活，從而發揮抗腫瘤作用。近年來，Cyclopamine及其衍生物作為抗腫瘤藥物的研究在國外發展迅速。有些已進入臨床階段，其中GDC-0449在2012年初已被FDA批準上市用于治療基地細胞癌(BCC)，而GDC-0449治療其他多種實體瘤的研究也進入臨床Ⅱ/Ⅰ期。綜上所述，Hh信號通路為抗腫瘤藥物的研發提供了一個很有前途的靶點。然而，目前唯一一個上市的Hh信號通路抑制劑GDC-0449在應用中也存在一些問題，比如無論GDC-0449的用量加到多大，在患者體內都無法達到更高的血藥濃度，而且對于某些Smo位點的突變，GDC-0449藥效降低甚至無效。
技術實現要素：
本發明的目的就是要提供一種苯并咪唑酰胺類化合物，其用于與Hh信號通路持續激活相關的腫瘤包括皮膚基底細胞癌、腦瘤，髓母細胞瘤、肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌或胰腺癌以及跟Hh信號通路有關的疾病。本發明的另一目的是提供上述化合物及其藥用鹽的制備方法。本發明的進一步的目的是提供上述化合物在制備抗腫瘤藥物上的應用。本發明的更進一步的目的是提供一種以上述化合物及其藥用鹽為有效成份的藥物組合物。為實現上述目的，本發明的技術方案為：式(Ⅰ)所示的化合物或其藥學上可以接受的鹽，其中，R1為H，鹵素，C1-6直鏈、支鏈烷基或者鹵素取代的C1-6直鏈或支鏈烷基；Ar為取代或者未取代的芳基，所述取代基包括鹵素，C1-6直鏈、支鏈烷基，鹵素取代的C1-6直鏈或支鏈烷基取代的苯；R2為:雜原子為氮或氧、雜原子數量為一個或兩個、未取代或以烷基、羥基或氨基取代的6元雜環。所述R2為所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，選自以下化合物之一：式(I)化合物的制備方法，包括下述步驟：a.化合物1的硝基被還原得化合物2；b.化合物2用對甲苯磺酰氯保護制得化合物3；c.將化合物3用硝硫混酸硝化得到化合物4；d.將化合物4脫保護得到化合物5；e.使化合物5與6-氯煙酰氯反應制得化合物6；f.化合物6在溶劑中加熱合環得到苯并咪唑化合物7；g.由苯并咪唑化合物7制得式(I)化合物。所述g步為制備方法Ⅰ或制備方法Ⅱ，其中，制備方法Ⅰ包括如下步驟：①還原苯并咪唑化合物7得到化合物14；②使化合物14酰化得到酰胺化合物16；③將酰胺化合物16取代吡啶上的氯得到式(I)化合物。制備方法Ⅱ包括如下步驟：①取代苯并咪唑化合物7中的吡啶上的氯得到化合物17；②再還原化合物17中的硝基得到化合物18；③將化合物18的氨基酰化得到式(I)化合物；反應式如下：式(I)化合物或其可藥物接受的鹽在制備抗腫瘤藥物方面的應用，其中，所述腫瘤為與Hh信號通路有關的疾病。所述腫瘤為與Hh信號通路持續激活相關的腫瘤；所述腫瘤包括皮膚基底細胞癌、腦瘤，髓母細胞瘤、肺癌、消化道腫瘤、乳腺癌或胰腺癌。再一方面，本發明提供藥物組合物，其包含本發明所述的化合物或其可藥物接受的鹽作為有效成份，以及一種或多種藥學上可接受的輔料。本發明提供的藥物組合，含有上述化合物或其在制藥學上許可的鹽、制藥學上許可的載體或以該類化合物作為活性成分的混以要用賦形劑或稀釋劑的組合。所述的本發明的用于治療腫瘤的藥物組合中藥學上可以接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如：稀釋劑如水等；賦形劑劑如淀粉、蔗糖等，粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠等；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣等；吸收劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土等；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、鎂等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發明化合物可能組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酊劑等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等，優選的形式是片劑、膠囊和注射劑。本發明藥物組合的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發明的化合物及其可藥用鹽對與Hh信號通路持續激活相關腫瘤的癌細胞生長的抑制作用與GDC-0449相當甚至優于GDC-0449，從而為相關腫瘤的治療提供新的選擇。具體實施方式下面結合具體的實施例進一步詳細描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑未標明來源、規格的均為市售分析純或化學純。所述的化合物經核磁共振譜、質譜確證其結構。實施例1合成N-{5-氯-2-[6-(4-羥基哌啶基)(3-吡啶基]苯并咪唑-6-基}-3-氯苯酰胺(I-1)實驗步驟化合物1(20.0g)溶于600ml混合溶液(EtOH∶H2O＝5∶1)，加入氯化銨(20g)，醋酸(20ml)，體系加熱至60℃，鐵粉(32.4g)分批加入。保持60℃反應1小時。降溫，乙酸乙酯萃取，旋干得到化合物2(14g,收率85％)。化合物2(14.0g)溶于吡啶(315ml)，分批加入對甲苯黃酰氯(39.3g)，升溫至75℃反應1.5小時。反應液旋干，乙酸乙酯溶解，以0.1NHCl水溶液洗三次，干燥,旋干得化合物3(29g，收率65.6％)。化合物3(21g)溶于醋酸(170ml)，反應加熱至70℃，滴加混合溶液(7ml硫酸/4.9ml發煙硝酸)，完畢后70℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，過濾，濾餅水洗三次，干燥得化合物4(14.6g，收率63％)化合物4(12g)溶于121ml硫酸(H2SO4∶H2O＝10∶1),體系加熱至85℃，反應0.5小時。反應液倒入冰水中，用氨水調PH至9，過濾得化合物5(3.0g，收率67％)。化合物5(3.0g)，N,N-二異丙基乙基胺(6.2g)，溶于四氫呋喃(75ml)，反應體系降至0℃，滴加混合液(3.4g6-氯煙酰氯/10ml四氫呋喃)，室溫反應0.5小時。旋干，EA溶解水洗，干燥，旋干得化合物6(3.3g，收率63.6％)。化合物6(3.0g)溶于醋酸(120ml)，反應體系升至100℃反應0.5小時。反應體系倒入冰水中，過濾得化合物7(2.4g，收率85％)。化合物7(1.2g)，4-羥基哌啶(0.79g)，N,N-二異丙基乙基胺(3.0g)溶于N-甲基吡咯烷酮(50ml)，加入到封管中氮氣保護下130℃過夜。將反應液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗五次，干燥,旋干得化合物8(0.8g,收率55％)。化合物8(0.5g)，咪唑(0.2g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(60ml)，0℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷(0.4g)，體系升至室溫反應過夜。將反應液倒入水中，乙酸乙酯萃取，干燥，旋干得化合物9(0.45g,收率69％)。化合物9(450mg)溶于EtOH∶H2O＝5∶1(96ml)，加入氯化銨(450mg)，醋酸(0.45ml)，體系加熱至60℃，鐵粉分批加入(258mg)。保持60℃反應1小時。降溫，乙酸乙酯萃取，旋干得到化合物10(350mg,收率83％)。LC/MS＝458(M+1)化合物10(100mg)，N,N-二異丙基乙基胺(84mg)，溶于(15ml)四氫呋喃中，反應體系降至0℃，滴加混合溶液(46mg，間氯苯甲酰氯/5ml，四氫呋喃)，室溫反應2小時。旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，旋干得化合物11(92mg，收率71％)。化合物11(90mg)，四丁基氟化銨(197mg)溶于四氫呋喃(50ml)，加熱至50℃反應3小時。加水淬滅，乙酸乙酯萃取，水洗，旋干，制備分離得化合物I-1(10mg,收率13.8％)。1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:1.46-1.51(m,2H),1.88-1.92(m,2H),3.19-3.23(m,2H),3.83-3.85(m,1H),4.12-4.18(m,2H),6.88-6.91(d,1H),7.46-7.50(m,1H),7.56-7.61(m,2H),7.82(s,1H),7.87-7.89(d,1H),7.96(s,1H),8.06-8.09(m,1H),8.72-8.73(d,1H)LC/MS＝482(M+1)實施例2合成N-{5-氯-2-[6-(4-甲基哌嗪基)(3-吡啶基]苯并咪唑-6-基}-3-氯苯酰胺(I-2)實驗步驟化合物7(500mg)，N-甲基哌嗪(488mg)，N,N-二異丙基乙基胺(1.26g)溶于N-甲基吡咯烷酮(20ml)，加入到封管中氮氣保護下130℃反應過夜。將反應液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取，水洗五次，干燥旋干得化合物12(450mg,收率75％)。化合物12(450mg)溶于EtOH/H2O＝5/1(96ml)，加入氯化銨(450mg)，體系加熱至60℃，鐵粉分批加入(408mg)。保持60℃反應1小時。降溫，乙酸乙酯萃取，旋干得到化合物13(200mg,收率48％)。化合物13(100mg)，N,N-二異丙基乙基胺(113mg)，溶于(15ml)四氫呋喃中，反應體系降至0℃，滴加混合溶液(61mg對氯苯甲酰氯/5ml四氫呋喃)，室溫反應2小時。旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，旋干，然后柱色譜分離得化合物I-2(90mg)。LCMS＝481.4(M+1)實施例3合成N-{5-氯-2-[6-(4-甲基哌嗪基)(3-吡啶基]苯并咪唑-6-基}-3-三氟甲基苯酰胺(I-3)實驗步驟化合物13(100mg)，N,N-二異丙基乙基胺(113mg)，溶于(15ml)四氫呋喃中，反應體系降至0℃，滴加混合溶液(72.6mg間三氟甲基苯甲酰氯/5ml四氫呋喃)，室溫反應2小時。旋干，乙酸乙酯溶解，水洗，旋干并柱色譜分離得化合物I-3(65mg)。LCMS＝515.9(M+1)實施例4合成N-{5-氯-2-[6-(2,6-二甲基嗎啉-4-基)(3-吡啶基]苯并咪唑-6-基}-3-氯苯酰胺(I-4)實驗步驟化合物7(1.0g)溶于EtOH/H2O＝5/1(96ml)，加入氯化銨(1.0g)，體系加熱至60℃，鐵粉(0.9g)分批加入。保持60℃反應1小時。降溫，旋干，加水、乙酸乙酯萃取，旋干得到化合物14(0.5g,56％)。化合物14(500mg)，N,N-二異丙基乙基胺(696mg)，溶于四氫呋喃(90ml)中，反應體系降至0℃，滴加混合溶液(378mg間氯苯甲酰氯/10ml四氫呋喃)，室溫反應2小時。旋干，過柱子(PE/EA＝3:1)得化合物15(200mg，收率27％)。LCMS＝417(M+1)化合物15(50mg)，2,6-二甲基嗎啉(69mg)，N,N-二異丙基乙基胺(93mg)溶于N-甲基吡咯烷酮(1ml)，加入到封管中氮氣保護下130℃過夜。將反應液倒入冰水中，過濾并水洗得化合物I-4(14mg,收率24％)。1H-NMR(400MHz,DMSO_d6)δ:1.18-1.20(d,6H),3.61-3.64(m,2H),4.29-4.33(d,2H),7.03-7.05(d,1H),7.58-7.62(m,1H),7.69-7.71(m,3H),7.98-8.00(d,1H),8.07(s,1H),8.24-8.26(d,1H),8.90(s,1H),7.96(s,1H),10.23(s,1H),12.88-12.96(m,1H)；LC/MS＝497.3(M+1)實施例5合成N-{5-氯-2-[6-(3,5-二甲基哌嗪基)(3-吡啶基]苯并咪唑-6-基}-3-氯苯酰胺(I-5)實驗步驟化合物15(50mg)，2,6-二甲基哌嗪(68mg)，N,N-二異丙基乙基胺(93mg)溶于N-甲基吡咯烷酮(1ml)，加入到封管中氮氣保護下130℃過夜。將反應液倒入冰水中，過濾,水洗得化合物I-5(13mg,收率22％)。1H-NMR(400MHz,DMSO_d6)δ:1.04-1.05(d,6H),2.32-2.38(m,2H),2.75(s,1H),4.28-4.31(d,2H),6.99-7.01(d,1H),7.57-7.99(m,4H),7.98-7.99(d,1H),8.07(s,1H),8.19-8.21(d,1H),8.86(s,1H),10.22(s,1H),12.89-12.92(s,1H)；LC/MS＝496.3(M+1)試驗實施例6本發明的具有式(I)結構的化合物及其藥學上可接受的鹽，在抗腫瘤方面有顯的效用，現通過以下藥理實驗說明：MTS細胞增殖實驗1.試驗材料1.1化合物及溶媒受試樣品前述實施例所制備的式(Ⅰ)系列化合物Ⅰ-1，Ⅰ-4，Ⅰ-5。；陽性對照品：GDC-0449從上海翰香香料有限公司購買。DMSO作為本實驗的溶媒，購自Sigma公司，貨號：D8418。1.2細胞株本實驗使用二種類型細胞株，1)人膀胱癌細胞株T24來源于中科院細胞庫。2)人慢性髓系白血病細胞株K562來源于中科院細胞庫。1.3試劑MTS檢測細胞增殖試劑粉末，購自Promega公司，貨號：G1111。PMS購自sigma公司，貨號：P9625。細胞培養基RPMI-1640和DMEM購自Gibco公司。胎牛血清購自HyClone公司，貨號：SV30087022.試驗方法2.1藥物處理劑量及配制方法空白溶媒組成：DMSO受試品式(Ⅰ)系列化合物及陽性對照品GDC-0449配制方法：稱取適量樣品，加入適量DMSO使藥物儲存濃度為20mmol/L，渦旋混合均勻。根據藥物在DMSO中的溶解度及DMSO在細胞培養中的安全濃度(DMSO在1％以下)，設置以下藥物處理濃度μmol/L：60、20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.082、0.027。2.2細胞培養T24人膀胱癌細胞株培養于DMEM完全培養基(含有10％的胎牛血清，100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。人慢性髓系白血病細胞株K562(懸浮細胞)培養于RPMI-1640完全培養基(含有10％的胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)。2.3MTS法檢測HB系列化合物對體外培養癌細胞生長的抑制作用將處于對數生長期的T24細胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，5×103/孔加入96孔細胞培養板內(150μL/孔)，三復孔，置于37℃、5％CO2孵箱內培養，次日貼壁后，按照實驗設計，每孔加入50ul系列濃度的受試化合物或對照的培液，并設置細胞對照組(僅含細胞和培養基而不含藥物的孔)、空白對照組(僅含培養基而不含細胞的)。K562懸浮細胞直接計數，1X104/孔加入96孔細胞培養板內，其他處理與T24相同。人膀胱癌細胞T24和人慢性髓系白血病細胞株K562給藥后均培養3天，培養完成后，采用MTS方法檢測細胞增殖情況并計算細胞相對于細胞對照組的細胞活力。細胞相對活力％＝(加藥組細胞吸光值-空白對照組平均吸光值)/(細胞對照組平均吸光值-空白對照組平均吸光值)×100％3.試驗結果HB系列化合物對體外培養癌細胞生長的抑制作用加藥3天后，MTS法檢測本發明系列化合物對T24和K562細胞生長的抑制作用。結果顯示其中幾個化合物的抑制作用與GDC-0449相當甚至優于GDC-0449，IC50結果見表1。表1:本發明化合物對癌細胞生長的抑制作