本發明提供一種富含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂及其制備方法。
背景技術：
長鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs）指含有兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸，如EPA、DHA、DPA和ARA等對人體具有重要的生理活性，具有其他脂肪酸不可替代的作用。甘三酯和磷脂是PUFAs兩種主要的天然載體，其中，甘三酯型PUFAs主要來源于深海魚類脂肪和微生物發酵，磷脂型PUFAs則主要從南極磷蝦以及深海魚類的器官組織中進行提取。最近一些研究表明，磷脂型PUFAs比甘三酯型PUFAs具有更好的氧化穩定性和生物利用性，磷脂型PUFAs大部分可以不被水解直接被細胞吸收，具有磷脂和PUFAs的雙重生理活性，因此在維持人體生理功能方面比甘三酯型PUFAs具有明顯優勢，磷脂型PUFAs可廣泛用于食品添加劑、保健品和醫藥等方面。
然而，受來源限制，磷脂型PUFAs受到磷蝦捕撈季節的影響以及可能存在的重金屬污染等威脅，而來源豐富的大豆磷脂和蛋黃磷脂則其天然脂肪酸組成中不含PUFAs，因此，基于普通磷脂利用酶法合成含有PUFAs結構磷脂的研究正在逐步展開。
CN101701229B公開了將濃縮磷脂和不飽和油脂混合加入脂肪酶催化磷脂酯交換制備質構磷脂和卵磷脂的方法。該法以磷脂或濃縮磷脂和不飽和油脂作為原料，用脂肪酶進行催化轉酯化反應，但該方法反應效率較低，反應時間長達60h左右。
CN102181498A應用高純度海豹油游離型Ω-3不飽和脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰膽堿型Ω-3不飽和脂肪酸產品。該專利使用溶劑體系，反應時間長，同時在催化反應過程中，水解副反應發生嚴重，造成產物得率較低。
CN101195637B提供一種在亞臨界R134a體系中制備富含多不飽和脂肪酸磷脂的工藝，但該方法需要高壓密閉反應釜及制備亞臨界氣體的相關裝置，設備投入大，同時反應介質R134a是一種化工原料，不適合用于食品的生產。
CN104531790A公開了一種將陰/陽離子表面活性劑溶于疏水性的烷類溶劑中制備得到微反應體系，采用磷脂酶進行催化反應即得到磷脂DHA的方法。
另外國內其它一些關于酶法制備磷脂型PUFAs的文獻，也主要集中在在溶劑體系中使用固定化脂肪酶或固定化磷脂酶A1催化磷脂進行酸解或酯—酯交換的反應來進行，如金華麗等（脂肪酶催化大豆磷脂改性的研究[J]）用novozym435催化大豆磷脂與EPA-DHA酯交換，反應時間長達60h，EPA-DHA的插入率為24%左右；孫兆敏（酶法制備n-3多不飽和脂肪酸型磷脂的工藝）在無溶劑體系中用固定化磷脂酶A1催化大豆磷脂和乙酯型魚油進行酯交換反應，EPA和DHA的插入率為25%，但磷脂水解副反應發生非常嚴重。
US2005282033A提供了一種酶催化制備含PUFAs的改進方法，該法在反應過程中添加胺類物質，提高了反應速率，但PUFAs的插入率和磷脂最終得率并未提高。
WO2005038037A2使用磷脂酶A1和A2進行酯化和轉酯化反應制備結構磷脂，該法反應時間長，插入率不高，水解副反應發生嚴重。
EP0494881B1使用磷脂酶A2在溶劑體系中催化酯化反應，該法除存在以上方法的弊端外，還存在酶的來源有限而且固定化后活性不穩定等缺點。
技術實現要素：
本發明的一個目的是提供含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法，包括：
（1）將原料磷脂、油脂和溶劑接觸，加入酶制劑進行反應；
（2）除去溶劑后，加入固定化酶進行反應，其特征在于，在步驟（1）之后具有加入碳酰胺的步驟。
根據本發明的制備方法，其中，所述原料磷脂不含長鏈多不飽和脂肪酸。
根據本發明的制備方法，其中，所述原料磷脂是植物來源的磷脂或動物來源的磷脂。
根據本發明的制備方法，其中，所述植物來源的磷脂選自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，所述動物來源的磷脂是蛋黃磷脂。
根據本發明的制備方法，其中，所述油脂含5～60重量％的長鏈多不飽和脂肪酸。
根據本發明的制備方法，其中，所述油脂選自深海魚油和微生物油脂中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，所述油脂選自金槍魚油、鯡魚油、三文魚油、沙丁魚油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，所述溶劑是乙醇溶液。
根據本發明的制備方法，其中，所述溶劑是95％乙醇溶液。
根據本發明的制備方法，其中，以重量比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1～1：15。
根據本發明的制備方法，其中，以重量比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：2～1：10。
根據本發明的制備方法，其中，以重量比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：4～1：8。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：5～1：80。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：8～1：40。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：10～1：30。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：12～1：18。
根據本發明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑為游離酶形式。
根據本發明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑選自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，步驟（1）中所述的酶制劑來源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南極假絲酵母（Candida antarctic）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）、嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假單胞細菌屬（Pseudononas sp. ）中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為10：1～200：1。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為20：1～100：1。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為40：1～80：1。
根據本發明的制備方法，其中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為50：1～60：1。
根據本發明的制備方法，其中，相對于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計，所述碳酰胺的加入量為100重量份～800重量份。
根據本發明的制備方法，其中，相對于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計，所述碳酰胺的加入量為200重量份～600重量份。
根據本發明的制備方法，其中，相對于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計，所述碳酰胺的加入量為250重量份～350重量份。
根據本發明的制備方法，其中，所述步驟（2）在溫度為60～80℃下進行。
根據本發明的制備方法，其中，所述步驟（2）的固定化酶為固定于大孔吸附樹脂或堿性離子交換樹脂載體的脂肪酶或磷脂酶的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為10：1～200：1。
根據本發明的制備方法，其中，以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為20：1～150：1。
根據本發明的制備方法，其中，所述步驟（2）在抽真空或保護氣體氣氛下進行反應。
根據本發明的制備方法，其中，所述步驟（2）的保護氣體氣氛是惰性氣體氣氛。
根據本發明的制備方法，其中，所述步驟（2）中加入吸水劑。
根據本發明的制備方法，其中，所述吸水劑選自分子篩或高分子吸水樹脂中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，所述高分子吸水樹脂選自丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯物和淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯物中的至少一種。
根據本發明的制備方法，其中，所述原料磷脂的磷脂酰膽堿含量為15～60重量％。
根據本發明的制備方法，所述長鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個以上雙鍵且碳原子數為18～22的直鏈脂肪酸。
根據本發明的制備方法，所述長鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
根據本發明的制備方法，所述的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的磷脂酰膽堿含量為70～85重量％。
根據本發明的制備方法，所述的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量%。
根據本發明的制備方法，所述的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為25～52重量%。
本發明的另一個目的是提供含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其是通過權利要求100～135中任意一項所述的制備方法制備的。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量％。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為25～52重量%。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，所述長鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個以上雙鍵且碳原子數為18～22的直鏈脂肪酸。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，所述長鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
本發明的另一個目的是提供含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為30～60重量%。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，所述長鏈多不飽和脂肪酸是含有兩個以上雙鍵且碳原子數為18～22的直鏈脂肪酸。
根據本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，所述長鏈多不飽和脂肪酸是選自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一種。
發明效果
本發明主要有以下優點：(1) 無需高純度長鏈多不飽和脂肪酸酰基供體和高純度的磷脂酰膽堿（或溶血磷脂酰膽堿）作反應原料，大大減少了價格成本。(2) 反應產物中長鏈多不飽和脂肪酸和磷脂酰膽堿含量顯著提高，實現了磷脂中長鏈多不飽和脂肪酸的接入和磷脂酰膽堿提純的目的，顯著提升產品附加值。
本方法無需采用高純度磷脂酰膽堿（PC）和高純度的長鏈多不飽和脂肪酸原料，工藝簡單，反應產物中長鏈多不飽和脂肪酸插入率高且磷脂酰膽堿含量提高到70%以上，大大提升了產品的附加值。
具體實施方式
多不飽和脂肪酸（PUFA）按照從甲基端開始第1個雙鍵的位置不同，可分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3不飽和脂肪酸中對人體最重要的兩種不飽和脂肪酸是DHA和EPA。EPA是二十碳五烯酸的英文縮寫，具有清理血管中的垃圾（膽固醇和甘油三酯）的功能，俗稱"血管清道夫"。DHA是二十二碳六烯酸的英文縮寫，具有軟化血管、健腦益智、改善視力的功效，俗稱"腦黃金"。
含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法
本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法，包括：
（1）將原料磷脂、油脂和溶劑接觸，加入酶制劑進行反應；
（2）除去溶劑后，加入固定化酶進行反應，其特征在于，在步驟（1）之后具有加入碳酰胺的步驟。
本發明中，所述長鏈多不飽和脂肪酸是指含有兩個以上雙鍵且碳原子數為18～22的直鏈脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
在本發明中，所述原料磷脂是植物來源的磷脂或動物來源的磷脂。所述植物來源的磷脂選自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一種。所述動物來源的磷脂是蛋黃磷脂。本發明中的原料磷脂不含長鏈多不飽和脂肪酸。
本發明中“不含長鏈多不飽和脂肪酸”是指通過本發明的中所述的測定方法未檢測出長鏈多不飽和脂肪酸。本發明的“原料磷脂”是指反應中作為原料使用的磷脂。本發明的“含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂”是指通過上述含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備獲得的磷脂。在本發明中，所述油脂含5～60重量％、優選10～55重量％、更優選20～45重量％的長鏈多不飽和脂肪酸。在本發明的具體實施方式中，所述油脂含16.2重量％、22.7重量％、27重量％、28.6重量％、40重量％或50重量％的長鏈多不飽和脂肪酸。
所述油脂選自深海魚油和微生物油脂中的至少一種。所述油脂選自金槍魚油、鯡魚油、三文魚油、沙丁魚油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一種。
在本發明中，所述溶劑是乙醇溶液，優選是95％乙醇溶液。
在本發明的優選實施方式中，以重量比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1～1：20，優選為1：1～1：15，更優選為1：2～1：10，進一步優選為1：4～1：8。
在本發明的具體實施方式中，以重量比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比為1：1、1：2、1：4、1：5、1：8、1：10、1：15。
在本發明的優選實施方式中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：2～1：100，優選為1：5～1：80，更優選為1：8～1：40，進一步優選為1：10～1：30，特別優選為1：12～1：20，最優選為1：12～1：18。
在本發明的具體實施方式中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述溶劑之比為1：5、1：8、1：10、1：12、1：18、1：20、1：30、1：40。
在本發明的優選實施方式中，步驟（1）中所述的酶制劑為游離酶形式。步驟（1）中所述的酶制劑選自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一種。
在本發明的優選實施方式中，步驟（1）中所述的酶制劑來源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南極假絲酵母（Candida antarctic）、皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）、嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假單胞細菌屬（Pseudononas sp. ）中的至少一種。
在本發明的優選實施方式中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為10：1～200：1，優選為20：1～100：1，更優選為40：1～80：1，進一步為50：1～60：1。
在本發明的具體實施方式中，以重量/體積（g/mL）比計，步驟（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述酶制劑之比為20：1、30：1、45：1、55：1、60：1、80：1、100：1。
在本發明的優選實施方式中，相對于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計，所述碳酰胺的加入量為100重量份～800重量份，優選為200重量份～600重量份，更優選為250重量份～350重量份。
在本發明的具體實施方式中，相對于所述原料磷脂和所述油脂的加入總量100重量份，以重量比計，所述碳酰胺的加入量為100重量份、200重量份、267重量份、300重量份、350重量份、400重量份、600重量份。
本發明中，所述步驟（1）的反應條件沒有特別限定，只要能夠實現本發明的目的即可。例如可以在30～40℃、例如35℃下進行。反應時間例如為1～10小時，優選為2～6小時。
在加入碳酰胺進行反應之后，可以在0～4℃下進行結晶處理，分理出過濾液。結晶處理的時間例如是1～6小時，優選2～4小時。隨后將過濾液通過蒸餾（例如旋蒸）除去溶劑。
本發明中，所述步驟（2）在溫度為60～80℃下進行。反應時間例如為2～10小時，優選為4～8小時。所述步驟（2）在抽真空或保護氣體氣氛下進行反應。抽真空例如為0.1～5KPa。所述步驟（2）的保護氣體氣氛是惰性氣體氣氛，例如是氮氣氣氛。
在本發明的優選實施方式中，所述步驟（2）的固定化酶為固定于大孔吸附樹脂或堿性離子交換樹脂載體的脂肪酶或磷脂酶的至少一種。所述脂肪酶或磷脂酶是毛霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、嗜熱真菌屬、假單胞細菌屬以及假絲酵母來源的微生物生產的脂肪酶或磷脂酶。所述固定化酶可以通過商購獲得，例如，novozyme 435、Lipozyme RM IM，或者通過CN201310307403.6以及文獻Vikbjerg， Huiling Mu， Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等中記載的方法獲得，例如固定化磷脂酶A1、固定化磷脂酶A2等。
在本發明的優選實施方式中，以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為10：1～200：1，優選為20：1～150：1，更優選為40：1～100：1，進一步為50：1～60：1。
在本發明的具體實施方式中，以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述固定化酶的重量比為25：1、29：1、30：1、50：1、55：1、60：1、67：1、100：1。
在本發明中，所述步驟（2）中加入吸水劑。所述吸水劑的加入量可以適當確定，以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述吸水劑的重量比為10：1～50：1，優選為15：1～40：1。例如以重量比計，所述原料磷脂和所述油脂的加入總量與所述吸水劑的重量比為16：1、17：1、22：1、30：1。
所述吸水劑選自分子篩或高分子吸水樹脂中的至少一種。所述分子篩例如為3A分子篩。所述高分子吸水樹脂選自丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯物和淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯物中的至少一種。
在本發明中，所述原料磷脂的磷脂酰膽堿含量為15～60重量％，例如為16重量％、18重量％、22重量％、60重量％。
反應結束后，通過常規方法過濾除去固定化酶，加入溶劑（例如丙酮等）進行洗滌，然后通過離心處理（例如在8000～10000r/min下）。
通過上述本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備，可以制備含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂。
通過上述本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％，例如為70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
通過上述本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％，優選為30～60重量%，例如為24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本發明中的原料磷脂不含長鏈多不飽和脂肪酸，因此本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是多不飽和脂肪酸含量提高率。
本發明通過上述本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的制備方法制備的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，DPA為12.9重量％、DHA為38.7重量％；EPA為5.5重量％、DHA為21.6重量％；EPA為3.8重量％、DHA為27.3重量％；ARA為40.2重量％；EPA為28.6重量％、DHA為32.4重量％；DPA為8.9重量％、DHA為20.7重量％；EPA為8.6重量％、DHA為30.2重量％；EPA為2.7重量％、DHA為25.2重量％；或EPA為7.6重量％、DHA為12.4重量％。
含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂
本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰膽堿含量為70～85重量％，例如為70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為15～60重量％，優選為25～52重量%，例如為20重量％、27.1重量％、27.9重量％、29.6重量％、31.1重量％、38.8重量％、40.2重量％、51.6重量％、61重量％。由于本發明中的原料磷脂不含長鏈多不飽和脂肪酸，因此本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是相對于原料磷脂，產物磷脂的多不飽和脂肪酸含量提高率。本發明中，所述長鏈多不飽和脂肪酸是指含有兩個以上雙鍵且碳原子數為18～22的直鏈脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸組成中，DPA為12.9重量％、DHA為38.7重量％；EPA為5.5重量％、DHA為21.6重量％；EPA為3.8重量％、DHA為27.3重量％；ARA為40.2重量％；EPA為28.6重量％、DHA為32.4重量％；DPA為8.9重量％、DHA為20.7重量％；EPA為8.6重量％、DHA為30.2重量％；EPA為2.7重量％、DHA為25.2重量％；或EPA為7.6重量％、DHA為12.4重量％。
含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿
從本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂將磷脂酰膽堿進行分離（分離方法參照文獻Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730），分離得到磷脂酰膽堿（有時也稱為本發明的磷脂酰膽堿或本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿），然后將分離得到的磷脂酰膽堿進行預處理和脂肪酸測定，方法分別參照國家標準GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
在上述的磷脂酰膽堿的脂肪酸組成中，多不飽和脂肪酸含量為20～80重量％，優選為30～60重量%，例如為24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本發明中的原料磷脂不含長鏈多不飽和脂肪酸，因此本發明的磷脂酰膽堿的多不飽和脂肪酸含量也可以看作是相對于原料磷脂，分離得到的磷脂酰膽堿的多不飽和脂肪酸含量提高率。
本發明的含長鏈多不飽和脂肪酸的磷脂酰膽堿，其脂肪酸組成中，DPA為18.1重量％、DHA為45.2重量％；EPA為7.4重量％、DHA為30.6重量％；EPA為9.1重量％、DHA為35.6重量％；ARA為57.1重量％；EPA為36.2重量％、DHA為40.1重量％；DPA為12.8重量％、DHA為28.7重量％；EPA為10.3重量％、DHA為35.6重量％；EPA為3.2重量％、DHA為26.8重量％；或EPA為8.9重量％、DHA為15.8重量％。
本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分數、比率、比例、或份數按重量計。
本發明中的重量體積百分比中的單位是本領域技術人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質的重量。
除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例
下述實施例中使用的磷脂酶A1、磷脂酶A2、脂肪酶TLL、脂肪酶Candida cylindracea、脂肪酶pseudononas sp.、脂肪酶Rhizopus oryzae分別為商品化的Lecitase? Ultra，Lecitase 10L、Lipozyme? TL 100L、 Lipase AY“Amano” 30、Lipase from Pseudononas sp.、Lipase F-AP 15。
下述實施例中使用的固定化脂肪酶Novozyme 435購自Novozymes公司，固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶A2是以現有公開專利方法得到，如CN201310307403.6以及文獻Vikbjerg，Huiling Mu，Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等。
下述實施例中，使用的原料來源如下：大豆粉末磷脂和蛋黃磷脂購自北京美亞斯磷脂技術有限公司；DHA藻油和ARA油脂購自廈門匯盛生物有限公司；金槍魚油、鯡魚油和沙丁魚油購自Norsk Hydro A/S。
磷脂酰膽堿（PC）含量的測定方法是按照國家標準GB/T 21493-2008中的方法測定的；磷脂脂肪酸組成的測定方法是按照國家標準GB/T 24894-2008中的方法測定的，其中預處理方法是按照國家標準GB/T 17376-2008的方法進行的；PC脂肪酸組成測定首先將PC從產物中分離出來，分離方法參照文獻Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730，然后進行預處理和脂肪酸測定，方法分別參照國家標準GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
實施例1
稱取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反應4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶2h，過濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應6h。待反應完成后，過濾除去Novozyme 435（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表1。
表1
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比較實施例1
（1）稱取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）和150mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1，反應4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；（2）稱取30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和300mL 95%乙醇于反應瓶中，加入1mL脂肪酶TL L，反應4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶2h，過濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇；（3）將步驟（1）和步驟（2）所得產物混合后，加入1.5g novozyme 435，70℃條件下抽取真空5KPa~0.1KPa，反應6h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物，檢測結果如下表2所示。
表2
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比較實施例2
稱取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反應4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應6h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表3。
表3
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比較實施例3
稱取5g大豆卵磷脂（PC含量為60%）和15g DHA濃縮液（DPA和DHA總含量為97.2%），加入2g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應6h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表4。
表4
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實施例2
稱取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、100g金槍魚油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和2.2L 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Candida cylindracea，反應2h后，加入440g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于4℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g的固定化磷脂酶A1和5g 3A分子篩，充氮條件下60℃反應8h。待反應完成后，過濾除去固定化磷脂酶A1（可回收重復利用），加入20mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表5。
表5
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實施例3
稱取10g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、80g鯡魚油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和720mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.8mL磷脂酶A2和1.2mL脂肪酶Pseudononas sp.，反應4h后，加入270g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水樹脂（丙烯酰胺-丙烯酸鹽共聚交聯物），充氮條件下70℃反應8h。待反應完成后，過濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表6。
表6
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實施例4
稱取20g大豆粉末磷脂（PC含量為16%）、100g ARA油脂（ARA 40%）和2.16L 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反應3h后，加入240g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于2℃環境中結晶3h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，80℃反應4h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入40mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表7。
表7
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實施例5
稱取20g大豆粉末磷脂（PC含量為22%）、160g 沙丁魚油（DHA 16.8%，EPA 10.2%）和900mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和2mL脂肪酶TL L，反應4h后，加入480g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa ，75℃反應4h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入35mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表8。
表8
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實施例6
稱取15g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、15g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和360mL 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.1mL磷脂酶A1和0.2mL脂肪酶TL L，反應6h后，加入30g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶5h，過濾分離出濾液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入0.45g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應8h。待反應完成后，過濾除去novozyme 435（可回收重復利用），加入15mL丙酮洗滌3次，10000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表9。
表9
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實施例7
稱取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、150g金槍魚油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和4.8L 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入1mL磷脂酶A1和7mL脂肪酶TLL，反應2h后，加入960g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于2℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入5.6g的固定化磷脂酶A1和10g 3A分子篩，充氮條件下60℃反應8h。待反應完成后，過濾除去固定化磷脂酶A1（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表10。
表10
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實施例8
稱取10g大豆粉末磷脂（PC含量為18%）、40g鯡魚油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和2L 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Pseudononas sp.，反應5h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水樹脂（淀粉接枝丙烯酸鹽共聚交聯物），充氮條件下65℃反應8h。待反應完成后，過濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表11。
表11
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實施例9
稱取10g蛋黃磷脂（PC含量為60%）、40g三文魚油（DHA9.5%，EPA6.7%）和2L 95%乙醇于反應瓶中，在35℃條件下攪拌均勻后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反應3h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，將反應瓶置于0℃環境中結晶4h，過濾分離出濾液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃條件下反應6h。待反應完成后，過濾除去固定化磷脂酶A2（可回收重復利用），加入30mL丙酮洗滌3次，8000r/min離心得到丙酮不溶物。檢測結果見表11。
表12
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以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。