黑框蟾蜍抗氧化肽及其基因和在制藥中的應用的制作方法

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種從動物組織得到的蛋白以及在生物制藥中的用途。

背景技術：
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生物分子的氧化是一個氧自由基介導的過程，它對食品和生物系統會造成許多不利的影響。在好氧器官內，與動脈硬化、癌癥等多種疾病相關的游離自由基不可避免的隨著氧代謝的過程而產生。另外，氧化應激被認為與多種疾病，例如老年癡呆癥、帕金森氏癥、糖尿病、類風濕性關節炎和肌萎縮性脊髓側索硬化癥引發的神經退行性變有關(Food Chemistry,2008,107,1485–1493)。在食品中，營養成分的氧化會產生過氧化物，其不僅會影響食品營養價值，造成食品品質的下降，嚴重的甚至還會導致攝入者的身體疾病(Journal of Food Science,1999,64,1000–1004)。因此尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產生一直是生化營養學的研究熱點。由于BHT、BHA和沒食子酸丙酯等化學合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價格，因此被廣泛應用于食品行業中。但是，目前有研究發現合成抗氧化劑對人體肝、脾、肺等器官有積蓄性致癌作用，從而引起了人們對其安全性的擔憂，并且開始慢慢限制其在食品中的使用，于是讓人們把目光轉向天然的抗氧化劑(Food Processing,1993,12,54–56)。α-生育酚是一種普遍適用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩定性，但卻不利于食品保存。因此有必要尋找其他來源的天然抗氧化劑。由于兩棲動物居住環境的特殊性，他們有時會受到自由氧等損害，這些活性自由氧能通過氧化脂肪、變性蛋白、破壞核酸，導致對代謝的嚴重后果和對組織和細胞的大量破壞。為了抵消這種氧化損害生存下來，兩棲動物已經進化形成了抗氧化防御系統，抗氧化多肽是其中的一類重要組分。目前，從R.pleuraden、R.catesbeiana、O.livida等物種中鑒定了十幾種具有抗氧化活性的多肽(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此，兩棲動物皮膚是天然抗氧化多肽的重要來源。能作為藥物遞呈的載體的凝集素已經被研究了幾十年，很少從兩棲動物皮膚中被鑒定，但是具有海藻糖結合活性的odorranalectin已經從O.grahami皮膚中被鑒定(PLoS One.2008,3(6):e2381)，意味著兩棲動物皮膚也是凝集素樣肽的重要來源。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,serpin)的最基本功能是防止蛋白質水解，調節絲氨酸蛋白酶的水解平衡。通過對絲氨酸蛋白酶的調節，絲氨酸蛋白酶抑制劑對生物體內的生理生化功能都有重要的影響。如，它們在血液凝固、補體形成、纖溶、蛋白質折疊、細胞遷移、細胞分化、細胞基質重建、激素形成及轉運、細胞內蛋白質水解、血壓調節、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑調節如此眾多的生理過程導致它們有廣泛的臨床應用價值，如，抑酶肽aprotinin除在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術中用于抗纖溶、抑制接觸性激活、抗炎癥等(Br J Anaesth.2013,110(5):675-8)。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein、tryptase在風濕性關節炎以及鼻炎、結膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統炎癥等炎癥發生中起著重要的作用(Biol Chem.2004,385(11):989-96)。因此，絲氨酸蛋白酶抑制肽已成為國際研究的熱點，其研究與開發則蘊含著巨大的臨床治療藥物的制備價值。

兩棲動物一直以來都是傳統藥物的源泉。中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)、黑斑蛙(pelophylax nigromaculata)、沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等兩棲類動物被作為中國的傳統中藥材而被廣泛的應用。現代研究表明：這些兩棲動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性，如，廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮痛、免疫調節、對心血管系統的作用等(Dongwuxue Yanjiu,2015,36(4):183-222)。傳統中藥藥物成分的復雜性及其炮制方法的局限性造成藥物活性成分不能更好發揮作用，從這些傳統藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現代化的重要內容之一。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經成為新藥發明的熱點。目前有許多分子量小于10kDa的蛋白酶抑已經從兩棲動物皮膚中被鑒定。這些多肽包括ranacyclin-B、KPHTI、HV-BBI、HJTI、hylaserpin S2、OGTI、PYR、PSKP-1、PSKP-2、BOTI、BVTI、BMTI、BPTI、pLR和BSTI等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。

我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質研究不多。黑框蟾蜍(Duttaphrynus melanostictus)是我國特色資源動物之一。其耳后腺及疣粒均藏毒液可制成名貴中藥“蟾酥”，可用于解毒消腫等。另外其自然蛻下的角質衣膜制成的“蟾衣”亦有藥用效果。此外把黑眶蟾蜍除去內臟后加工制成的“干蟾”亦是中藥材的一種。

發明人將本發明的黑框蟾蜍抗氧化肽的全序列氨基酸結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽。發明人將本發明的黑框蟾蜍抗氧化肽編碼基因經基因數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同基因。

技術實現要素：
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本發明的目的是基于上述技術背景，提供一種新的具有凝集素、蛋白酶抑制劑活性和抗氧化作用的黑框蟾蜍抗氧化肽及其基因和它作為制備胃炎、胰腺炎藥物和美容護膚品的應用。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

本發明一個方面提供了一種黑框蟾蜍肽，所述多肽的序列如SEQ ID No.1所示

KPCKGWLCKLKLRGGYTLIGSATNLNRPTYVRA SEQ ID NO.1。

本發明另一個方面提供了一種黑框蟾蜍肽，其特征在于，所述黑框蟾蜍肽是由33個氨基酸組成的環肽，分子量3678.14道爾頓，等電點10.33，其氨基酸序列為：Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro Thr Tyr Val Arg Ala(KPCKGWLCKLKLRGGYTLIGSATNLNRPTYVRA)(SEQ ID NO.1)，其第三位半胱氨酸和第八位半胱氨酸形成分子內二硫鍵。

本發明再一個方面提供了黑框蟾蜍肽基因的核苷酸序列，其特征在于：cDNA由495個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列如下SEQ ID NO.4所示

本發明再一個方面提供了一種編碼權利要求1所述的黑框蟾蜍肽的核苷酸。

本發明再一個方面提供了權利要求1所述的黑框蟾蜍肽在制備病原胃炎、胰腺炎藥物、神經退行性疾病和美容護膚品應用。

本發明再一個方面提供了如前所述的黑框蟾蜍肽在制備清除自由基藥物或美容用品中的用途。

本發明再一個方面提供了如前所述的黑框蟾蜍肽在制備抗氧化藥物或美容用品中的用途。

本發明再一個方面提供了如前所述的黑框蟾蜍肽在制備預防或治療與胃炎或胰腺炎的藥物中的用途，優選，所述胃炎或胰腺炎為炎癥相關的胃炎或炎癥相關的胰腺炎。

本發明再一個方面提供了如前所述的黑框蟾蜍肽在制備靶向藥物載體中的用途。

本發明的有益效果在于:

由黑框蟾蜍抗氧化肽編碼基因推導其氨基酸結構，合成的黑框蟾蜍抗氧化肽具有顯著的凝集素、蛋白酶抑制劑活性和抗氧化作用。該黑框蟾蜍抗氧化肽具有結構簡單、人工合成方便、活性強的有益特點。

附圖說明：

圖1為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽HPLC純化鑒定結果；

圖2為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽質譜鑒定結果；

圖3為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽清除DPPH和ABTS自由基的“量-效”關系曲線；

圖4為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽在不同濃度是清除ABTS自由基的“時-效”關系曲線；

圖5為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽凝集雞血紅細胞結果；

圖6為本發明黑框蟾蜍抗氧化肽抑制絲氨酸蛋白酶對發色底物水解的“量-效”關系曲線；

具體實施方式：

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明：

本發明的黑框蟾蜍抗氧化肽，所述的黑框蟾蜍抗氧化肽是由33個氨基酸組成的環肽，分子量3678.14道爾頓，等電點10.33，其氨基酸序列為：Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro Thr Tyr Val Arg Ala(KPCKGWLCKLKLRGGYTLIGSATNLNRPTYVRA)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第八半胱氨酸形成分子內二硫鍵。

所述黑框蟾蜍抗氧化肽的基因序列SEQ ID NO.4的第394-492位核苷酸編碼。本發明的黑框蟾蜍抗氧化肽及其基因的制備過程包括如下步驟：

實施例1，黑框蟾蜍抗氧化肽基因克隆：

I、黑框蟾蜍皮膚總RNA提取：活體黑框蟾蜍用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為黑框蟾蜍皮膚總RNA。

II、黑框蟾蜍皮膚mRNA的純化：黑框蟾蜍皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取黑框蟾蜍皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的黑框蟾蜍皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到黑框蟾蜍皮膚mRNA。

III、黑框蟾蜍皮膚cDNA文庫構建：采用CLONTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質粒cDNA文庫構建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl黑框蟾蜍皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達到5μl。混勻離心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉錄酶。混合離心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈：95℃預熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應。在PCR儀中按以下程序擴增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個循環。循環結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。

C.PCR產物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產物的轉化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl黑框蟾蜍cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態細胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過的LB培養基890μl，37℃緩慢振蕩培養60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養基上37℃培養16h，形成單菌落。每個LB平皿用5m1LB液體培養基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構建的cDNA大約含1×10⁶個單獨克隆。

Ⅳ、黑框蟾蜍抗氧化肽基因克隆篩選：擴增引物長度為24個核苷酸，其序列為5’ATGAGGAGCTGGAGGCTGTCTCTG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應在如下條件下進行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個循環。

首先滴定構建的細菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基稀釋至適當的細菌濃度(大約5000個細菌/毫升和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過夜培養。按行、列分別合并細菌培養液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。

Ⅴ、黑框蟾蜍抗氧化肽基因序列測定和結果：提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems 373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TMSequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)。基因測序結果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

黑框蟾蜍抗氧化肽基因核苷酸的序列表為：序列長度為359個堿基；序列類型：核酸；鏈數：單鏈；拓撲學：直鏈狀；序列種類：cDNA；來源：黑框蟾蜍皮膚。

根據黑框蟾蜍抗氧化肽的基因推斷編碼具有功能的成熟肽為第394-492位核苷酸，氨基酸序列為：KPCKGWLCKLKLRGGYTLIGSATNLNRPTYVRA(見序列SEQ ID NO.1)

實施例2，黑框蟾蜍抗氧化肽的制備：

Ⅰ、黑框蟾蜍抗氧化肽的制備方法：根據黑框蟾蜍抗氧化肽的基因推斷編碼由功能的成熟活分泌肽氨基酸序列后用自動多肽合成儀合成多肽。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫攪拌過夜。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，B液濃度梯度15min為20-40％，檢測波長為220nm，多肽出現在11.670分鐘。

Ⅱ、分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的黑框蟾蜍抗氧化肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。

黑框蟾蜍抗氧化肽是中國兩棲類動物黑框蟾蜍抗氧化肽基因編碼的一種環狀多肽，分子量3678.14道爾頓，等電點10.33，其氨基酸序列為：Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro Thr Tyr Val Arg Ala(KPCKGWLCKLKLRGGYTLIGSATNLNRPTYVRA)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的第三位半胱氨酸和第八位半胱氨酸形成分子內二硫鍵使多肽成環。

實施例3，黑框蟾蜍抗氧化肽的活性實驗

Ⅰ、抗氧化能力測定

1)DPPH自由基清除能力的測定

利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強。

清除率(％)＝{1-(A_i-A_j)/A₀}*100％

式中，A₀為2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品試劑，空白對照，A_i為2ml,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品，A_j為2ml的無水乙醇+2ml的樣品。

2)ABTS自由基清除活性的測定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45nmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30秒鐘，暗處反應10分鐘，然后在734nm下測定反應液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清除率(％)＝(A_i-A_j)/A₀*100％

式中，A₀為2.9ml ABTS試劑與0.1ml蒸餾水混合液的吸光值，A_j為2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。從圖3、4所示黑框蟾蜍抗氧化肽能清除DPPH和ABTS自由基，對ABTS和DPPH自由基清除的EC₅₀分別是3.48μM和3.12μM，并且這種清除能很快發生。自由基氧化在老年癡呆癥、帕金森氏癥、糖尿病、類風濕性關節炎和肌萎縮性脊髓側索硬化癥引發的神經退行性疾病中有重要作用。黑框蟾蜍抗氧化肽能很好的清除自由基能說明其能應用于自由基氧化導致的相關疾病的治療。另外，為了防止自由基對皮膚造成的損害，在美容護膚品中添加自由基清除劑比不可少。因此，黑框蟾蜍抗氧化肽也可以應用于美容護膚品中。

Ⅱ、紅細胞凝集活性

在96孔血凝板中，初始濃度為3mg/ml的黑框蟾蜍抗氧化肽用25μl PBS倍比稀釋，室溫靜置5-10min，加入75μl 1％雞紅細胞懸液，在4℃靜置1h，陽性對照每孔加入75μg/ml odorranalectin，陰性對照孔假如等體積的PBS，觀察血凝結果如圖5所示，黑框蟾蜍抗氧化肽能凝集紅細胞，凝集常數為156.25μg/ml。黑框蟾蜍抗氧化肽具有凝集素樣活性，能夠凝集紅細。凝集素通常能特異性識別哺乳動物細胞表面的糖基序將藥物遞呈到特定的靶點促進藥效，因此他們能作為藥物的載體使用。Odorranalectin納米顆粒對帕金森病的治療有很好的促進作用。因而從凝集紅細胞功能的角度看，黑框蟾蜍抗氧化肽對治療帕金森病等神經退行性疾病的治療有很好的促進作用。

Ⅲ、絲氨酸蛋白酶抑制劑活性測定

不同量的黑框蟾蜍抗氧化肽溶解于0.05M Tris-HCl緩沖液與一定量的胰蛋白酶(最終濃度為40μg/ml)于0.05M Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫2min，最后加入發色底物S-2238(終濃度為40μg/ml)啟動反應，應用PERKIN ELMER(美國)公司生產的分光光度計于處監測吸收值變化2min,加入同樣體積的0.05M Tris-HCl緩沖液與空白對照,抑制常數Ki＝[I]/(V0/VI+1)計算。[I]為沼水蛙多功能絲氨酸蛋白酶抑制劑的摩爾濃度，V0為空白對照是胰蛋白酶與發色底物的反應速度，V1為加入黑框蟾蜍抗氧化肽后胰蛋白酶與發色底物的反應速度。此試驗重復六次，取平均值。

結果如圖6所示，黑框蟾蜍抗氧化肽能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述試驗條件下抑制半數胰蛋白酶活性所需要的黑框蟾蜍抗氧化肽濃度為2.365μM，對胰蛋白酶的抑制常數Ki是12.1×10^-6M。絲氨酸蛋白酶抑制劑對生物體內的生理生化功能都有重要的影響。如，它們在血液凝固、補體形成、纖溶、蛋白質折疊、細胞遷移、細胞分化、細胞基質重建、激素形成及轉運、細胞內蛋白質水解、血壓調節、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等方面都有重要作用。黑框蟾蜍抗氧化肽能很有效地抑制胰蛋白酶，證實其能在體內調節眾多的生理過程和有廣泛的臨床應用價值。胃炎、胰腺炎的發病過程涉及許多絲氨酸蛋白水解作用，因此抑制這些酶的水解能防止疾病的發生和減低隨后的炎癥因子對機體造成的損害。具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的黑框蟾蜍抗氧化肽能應用與炎癥相關的胃炎、胰腺炎中。