可促進傷口愈合、膠原蛋白增生、血管新生、活化免疫細胞并降低傷口感染的勝肽及其應用的制作方法

本發明是關于一種勝肽，尤其是關于一種能應用于促進傷口愈合、膠原蛋白增生、血管新生、活化免疫細胞并降低傷口感染的勝肽。
背景技術：
：一般人受傷或經手術之后，無論是傷口的復原以及氣力的恢復，都需要較長時間的靜養，并配合適當的飲食，才能達到最好的恢復效果。若欲提早康復，最常見者就是食用能夠讓傷口快速愈合的食品、補品或藥品，例如鱸魚湯等鱸魚萃取物。2013年臺灣的鱸魚(Latescalcarifer)產量約為26,094噸，總產值高達21.8億元，除一般家庭、餐廳的直接食用外，有多數鱸魚被為加工制品，而其再制后產生的副產物，其中魚皮與魚骨所占比例竟高達30％，若能妥善加以應用，不但可增進臺灣漁業的附加價值，更可有效解決鱸魚加工副產物的處理問題。技術實現要素：為獲悉鱸魚萃取物中具效果的成分，本發明確認其中有效的勝肽成分，遂提供一種可促進傷口愈合、膠原蛋白增生、血管新生、活化免疫細胞并降低傷口感染的勝肽，該勝肽包括選自SEQIDNO:1至SEQIDNO:11的序列，及其組合的勝肽所組成的群組。在本發明的一實施例中，該鱸魚萃取物是萃取自鱸魚的魚皮、鱗片、魚骨或魚肉。在本發明的一實施例中，該鱸魚萃取物是以角蛋白酶(Keratinase)、胰蛋白酶(Trypsin)、菠蘿蛋白酶(Bromelain)、木瓜蛋白酶(Papain)、胃蛋白酶(Pepsin)、堿性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、復合蛋白酶(Protamex)以及風味 蛋白酶(Flavourzyme)所組成的群組萃取后而獲得。在本發明的一態樣中，提供一種勝肽用于促進傷口愈合的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發明的另一態樣中，提供一種傷口愈合促進劑，包括如前所述的勝肽。在本發明的一態樣中，提供一種勝肽用于促進膠原蛋白增生的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發明的另一態樣中，提供一種膠原蛋白增生促進劑，包括如前所述的勝肽。在本發明的一態樣中，提供一種勝肽用于促進血管增生的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發明的另一態樣中，提供一種血管增生促進劑，包括如前所述的勝肽。在本發明的一態樣中，提供一種勝肽用于活化免疫細胞的用途，該勝肽包括如前所述的勝肽。在本發明的另一態樣中，提供一種免疫細胞活化劑，包括如前所述的勝肽。藉由本發明實施例的勝肽，可誘發TNF-α與IL-1β的表現量，因此可對抗病毒、細菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡，促進傷口的修復。此外，藉由本發明實施例的勝肽，亦可誘發IL-8與CXCL12的表現，使促進傷口處能夠招集更多的免疫細胞，并活化更多的免疫細胞。再一方面，本發明實施例的勝肽，能夠抑制IL-10的表現，因而能有效促進纖維組織分泌膠原蛋白，幫助傷口的修護與愈合。同時，藉由本發明實施例的勝肽，還可因為活化TNF-α與IL-1β的表現，進一步可活化纖維母細胞與角質細胞，而具有促進血管新生的效用。由于本發明所提供的勝肽具有前述的功效，因此在本發明的一實施例中，可進一步利用本發明的勝肽應用于制備相關功效的組合物或試劑，例如傷口愈合促進劑、膠原蛋白增生促進劑、血管增生促進劑或免疫細胞活化劑。附圖說明圖1是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-1β其 mRNA表現影響的結果圖；圖2是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞TNF-α其mRNA表現影響的結果圖；圖3是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-8其mRNA表現影響的結果圖；圖4是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞CXCL12其mRNA表現影響的結果圖；圖5是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-10其mRNA表現影響的結果圖；圖6是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-1β其mRNA表現影響的結果圖；圖7是本發明實施例的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞TNF-α其mRNA表現影響的結果圖。具體實施方式本發明實施例勝肽的取得，首先須先處理鱸魚樣本，將其以酸處理后進行萃取，萃取出的混合物再以復合型酵素進行水解，然后將水解產物過濾純化后即可獲得。后續則針對該些勝肽進行定序以及相關的功效試驗，以下將進一步詳細說明。實施例1鱸魚萃取物的制備方法首先，將鱸魚以切片機剪切為約2至6cm大小作為原料，其中該鱸魚部位包含魚皮、鱗片、魚骨與魚肉；之后以2至5倍體積的RO逆滲透水進行原料清洗，重復清洗鱸魚2至3次以去除血水與雜質。之后，以1:5的鱸魚與酸液(w/v)比率進行酸處理，其中酸的種類與濃度為質量百分濃度為1～5％鹽酸、質量百分濃度為1～5％硫酸或質量百分濃度為1～5％磷酸。將鱸魚于15至20℃浸泡10至48小時后，以2至5倍體積RO逆滲透水清洗酸處理后的原料，重復清洗2至3次進行去酸，最后并以碳酸鈣調整pH值 為4至8之間。鱸魚樣本備妥后，開始以55至100℃熱水進行萃取1至6小時；之后以3000rpm離心10分鐘，進行脫渣過濾；再以0.2-1％的碳酸鈣或石灰去雜質并澄清化；然后以1-10μm的濾膜進行過濾；之后再以離子交換樹脂管柱吸附過濾，去除雜質與石灰，以進一步將效性勝肽分離純化；純化后的效性勝肽經由活性碳脫臭與脫色處理，置于50至60℃下進行減壓濃縮，濃縮其10至20倍。接著，添加復合型酵素并于40至60℃進行水解1至5小時，其中該復合型酵素包含0.01wt％-0.1wt％的角蛋白酶(Keratinase)與菠蘿蛋白酶(Bromelain)；0.1-5wt％的木瓜蛋白酶(Papain)、胰蛋白酶(Trypsin)與胃蛋白酶(Pepsin)、0.1-5wt％堿性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、復合蛋白酶(Protamex)以及風味蛋白酶(Flavourzyme)。水解完成后，于85至95℃下反應10至30分鐘進行酵素失活；之后將其冷卻；冷卻后以硅藻土與活性碳進行過濾，使勝肽萃取液澄清化與脫臭，之后再進行一次過濾，將過濾后產物進行超高溫滅菌(Ultra-hightemperature，UHT)，于135至140℃下進行殺菌3至5秒；最后以0.2μm濾膜過濾除菌與去除細小雜質后即可獲得本發明所需包含多種勝肽的鱸魚萃取物。實施例2鱸魚萃取物中勝肽的測序鱸魚勝肽萃取物經適當稀釋后，經離心(13000rpm,2min)吸取200μl上清液，以C18-ZipTip(Millpore)去鹽濃縮，樣品回溶后取1/2體積，以下列條件進行LC-MS/MS分析。MS/MS圖譜利用Mascot分析程序進行數據庫檢索分析以得到分析結果。反應條件：質譜儀:LTQXL(ThermoScientific)LC系統:Agilent1200Series緩沖溶液A:ddH2O/0.1％甲酸緩沖溶液B:100％乙腈/0.1％甲酸分析管柱:C18反相柱梯度表:時間(min)B％0.00510.02510.05545.004050.008560.008563.00575.02575.05590.005經氨基酸測序后，確認其中11種勝肽，其氨基酸序列如表1所示的SEQIDNO:1～11。表1實施例3免疫細胞的基因表現量分析將人類THP-1細胞(人類單核球細胞株)分養在6孔細胞培養盤(5*105cell/well)，并將其分組個別進行脂多醣(Lipopolysaccharide，以下簡稱LPS)處理，處理方式如表2所示。表2將各組經不同反應物與時間處理后的細胞加以搜集后，以RNA分離套組(GeneMarkRNAisolationkit)分離細胞中的RNA，再經由cDNA合成套組(RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthhesisKit)合成出cDNA，之后利用實時聚合酶連鎖反應套組(SYBRGreenMasterMix,KAPA公司)測定目標基因，并由ABIStepone軟件進行基因表現的分析，以從基因表現層面探討鱸魚萃取物對免疫細胞的影響與功效，其結果如圖1至圖7所示。請先參閱圖1，該圖是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-1β其mRNA表現影響的結果圖。由圖1顯示，以LPS處理THP-1細胞株的IL-1β表現量會上升，在LPS誘導6小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時的IL-1β表現量分別為對照組(LPS_6hr)的4.8與7.9倍，而在LPS誘導9小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時的IL-1β表現量則分別為對照組(LPS_9hr)的4.3與8.7倍。請再參閱圖2，該圖是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞TNF-α其mRNA表現影響的結果圖。由圖2結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的TNF-α表現量會上升，在LPS誘導6小時下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時的TNF-α表現量分別為對照組(LPS_6hr)的3與3.5倍，而在LPS誘導9小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時的TNF-α表現量分別為對照組(LPS_9hr)的2.3與4倍，而誘發TNF-α與IL-1β對于傷口修護扮演著重要角色，其表現量的增加可對抗病毒、細菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡。請參閱圖3，該圖是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-8其mRNA表現影響的結果圖。由圖3結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的IL-8表現量會上升，在LPS誘導6小時下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時的IL-8表現量分別為對照組(LPS_6hr)的7.6與6.3倍，而在LPS誘導9小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時的IL-8表現量分別為對照組(LPS_9hr)的4.7與7.9倍。請參閱圖4，該圖是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞CXCL12其mRNA表現影響的結果圖。由圖4結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的CXCL12表現量會上升，在LPS誘導6小時下再以1％與2％鱸魚勝肽處理3小時的CXCL12表現量分別為對照組(LPS_6hr)的1.9與3倍，而在LPS誘導9小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理6小時的CXCL12表現量分別為對照組(LPS_9hr)的1.7與3.2倍，而誘發IL-8與CXCL12表現量可促進免疫是統于傷口處招集更多免疫細胞，并同時活化更多免疫細胞。請參閱圖5，該圖是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-10其mRNA表現影響的結果圖。由圖5結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的IL-10表現量會下降，在LPS誘導27小時下再以1％與2％鱸魚勝肽處理24小時的IL-10相較于對照組(LPS_27hr)分別減少了54％與30％的表現量，而抑制IL-10表現的效果，是能有效促進纖維組織分泌膠原蛋白，因此能幫助傷口的修護與愈合。請同時參閱圖6、7，該二圖分別是本發明實施例鱸魚萃取物中的勝肽于細胞模擬傷口發炎下，對細胞IL-1β與TNF-α其mRNA表現影響的結果圖。由圖6結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的IL-1β表現量會上升，在LPS誘導27小時下，再以1％與2％鱸魚勝肽處理24小時的IL-1β表現量分別為對照組(LPS_27hr)的3.3與5.1倍，而由圖7結果顯示，以LPS處理THP-1細胞株的TNF-α表現量會上升，在LPS誘導27小時下再以2％鱸魚勝肽處理24小時的TNF-α表現量為對照組(LPS_27hr)的2.3倍，而活化TNF-α與IL-1β的表現量，亦可同時活化纖維母細胞與角質細胞，因而具有促進血管新生的功效。因此，透過前述細胞模擬傷口發炎狀態下，IL-1β、TNF-α、IL-8、IL-10以及CXCL12表現量的變化影響，可確知本發明所提供的勝肽，能夠使傷口處能夠招集更多的免疫細胞，并活化更多的免疫細胞，具有對抗病毒、細菌、降低傷口感染，并清理壞死組織、幫助傷口清瘡，促進傷口的修復的功效。同時因為可有效促進纖維組織分泌膠原蛋白，更加能夠幫助傷口的修護與愈合。此外，由于該勝肽可活化TNF-α與IL-1β的表現，而能進一步活化纖維母細胞與角質細胞，因此亦具有促進血管新生的效用。由于本發明所提供的勝肽具有前述的功效，因此可進一步利用本發明的勝肽應用于制備相關功效的組合物或試劑，例如傷口愈合促進劑、膠原蛋白增生促進劑、血管增生促進劑或是免疫細胞活化劑。該些組合物或試劑可包括有效劑量的本發明勝肽以及賦形劑或載劑等，因此該組合物或試劑形式可為藥錠、膠囊、液狀、凝膠、漿液、懸浮液、粉包、敷料、乳液、噴劑、膜狀物，并未設有特別的限制。進一步，前述組合物或試劑依其利用方式，亦可制備成飲食品應用于保健相關食品，或是輔助用作外用品。當前第1頁1 2 3