一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體及制備方法和應用與流程

本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體，同時還涉及一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體的制備方法，還涉及一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體的用途。

背景技術：

中華鱘(Acipenser sinensis)屬于洄游距離長、生長快、體形大及卵徑最大的鱘種，具有重要的科研價值，被列為我國國家一級重點保護動物。由于過度捕撈、水工建設等因素影響，目前種群數量大幅減少，中華鱘物種目前的生存問題十分嚴峻。中華鱘的全人工繁殖技術的突破，可擺脫人工增殖放流苗種對野生中華鱘的依賴，實現可持續的中華鱘資源增殖。截至目前中華鱘全人工繁殖技術體系尚存在很多問題亟待解決，人工養殖中華鱘性腺發育成熟的問題，仍然是一個較大的科學難題。理論上人工養殖的中華鱘需要耗時十余年的時間才能性成熟，加之成魚個體大，所需要的養殖成本巨大，人工養殖中華鱘性腺從II期發育到III-IV期(卵黃形成期)的規律和調控機理成為目前研究難點，也是探索促進中華鱘性腺成熟的人工調控和培育技術的關鍵所在。

卵黃是魚類胚胎發育過程中的主要能量及物質來源，是后續的個體發育物質基礎，卵黃積累過程是魚類性腺發育中的重要生理過程。卵黃的主要成分是卵黃蛋白，魚類的卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)是卵黃蛋白的前體，通常是由兩個170-220kDa的同源二聚體組成，在雌激素的作用下由肝細胞合成,后經血液循環運輸到卵巢，經過卵母細胞吸收加工后形成卵黃蛋白。因此血清中卵黃蛋白原含量與卵巢的發育程度相關，被認為是一種理想的雌激素和類雌激素標志物，可將其作為中華鱘卵巢發育程度的輔助檢測指標，因此制備中華鱘VTG蛋白及抗體并應用于人工養殖中華鱘體外檢測具有重要的現實意義。

VTG是動物體內一種具有種特異性的高分子量磷脂蛋白，雖然VTG的結構在許多動物中具有一定的保守性和同源性，但在免疫學上仍具有高度的特異性，甚至同科不同屬的魚類之間的VTG和其他抗體也很少發生免疫交叉反應。目前沒有市售的鱘科魚類的VTG抗體，同時其他科魚類的VTG抗體對中華鱘VTG的免疫效果不佳，因此有必要發明一種針對中華鱘VTG蛋白的特異性抗體應用于體外檢測。

技術實現要素：

本發明的目的是在于提供了一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體，該蛋白抗原為中華鱘VTG基因編碼序列分析截短后翻譯的重組蛋白pet32a(+)-VTG，其序列為SEQ ID NO.1所示。該中華鱘VTG蛋白抗體與VTG蛋白抗原免疫性好，效價能達到1：1000，使檢測反應更為特異和穩定。

本發明的另一個目的是在于提供了一種中華鱘VTG蛋白抗原及其抗體的制備方法，方法易行，操作簡便，通過轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株進行原核表達可制備大量的中華鱘VTG蛋白抗原。對日本大耳兔進行多次免疫最終獲得中華鱘VTG蛋白特異性抗體。

本發明的最后一個目的是在于提供了一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在雌性中華鱘血清VTG含量檢測中的應用。該應用方法直接、操作快速、檢測結果陽性率高，具有良好的臨床適用性。

為了達到上述的目的，本發明采取以下技術措施：

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體的制備方法，其步驟是：

1.重組中華鱘VTG蛋白抗原的制備：

首先以高首鱘和西伯利亞鱘VTG序列為基礎設計引物擴增得到中華鱘VTG部分序列，然后根據得到的中華鱘VTG序列設計特異性引物，采用RACE PCR(購自Clontech公司)獲得了中華鱘VTG基因的編碼區序列。通過對編碼序列進行功能結構域分析，選擇卵黃蛋白原核心功能區域，根據該片段的基因序列設計引物進行PCR擴增，獲得截短的VTG序列，連接到Pet32a(+)(購自Novagen公司)表達載體，構建重組表達質粒pet32a(+)-VTG，然后將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株并加入IPTG誘導，收集大量誘導表達的包涵體沉淀，溶解純化得到可溶VTG重組蛋白。截短后的VTG功能結構域片段為SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。該氨基酸序列通過BLASTP比對數據庫及DNAStar Protean軟件分析為脂蛋白氨基末端區，該蛋白家族包括卵黃蛋白原、微粒體甘油三酸酯轉運蛋白和載脂蛋白b-100等都具有參與脂質運輸的功能。

上述重組表達質粒pet32a(+)-VTG的構建方法具體為：

1)設計上游引物5'-GAATTCCAACAGACAAAGTATGAACCAA-3'(含EcoRⅠ酶切位點)，下游引物5'-CTCGAGGTCAAACACCAGTTCAGCAGCC-3'(含XhoⅠ酶切位點)，擴增結構域截短序列，擴增產物回收后連接到pMD-18T(購自TaKaRa公司)中并轉化DH5a感受態細胞，然后涂于含有氨芐青霉素的LB培養基上進行培養，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行接種培養提取質粒并進行測序；

2)將測序正確的pMD-18T-VTG質粒以及Pet32a(+)空載體分別采用EcoRI和XhoI進行酶切后純化目的片段，然后將二者連接為Pet32a(+)-VTG轉化DH5a(購自TransGen Biotech公司)，涂于含有氨芐青霉素的LB培養基上培養，提取質粒后酶切鑒定為陽性的質粒進行測序；

上述VTG重組蛋白的誘導表達及溶解純化的具體方法為：

1)將測序正確的Pet32a(+)-VTG質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞，涂于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上培養，挑取菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃培養至菌液OD值約為1.0時，加入終濃度為0.5mM的IPTG(購自捷誠生物公司)于30℃誘導2-4h，收集誘導表達菌體進行SDS-PAGE分析(圖1)，結果顯示Pet32a(+)-VTG重組蛋白主要以包涵體形式大量表達。

2)將收集的菌體沉淀經過3-6次超聲洗滌后收集沉淀，然后用含8M尿素的蛋白緩沖液重懸沉淀，室溫(20-25℃，以下相同)放置28-32min后15000×g離心28-32min收集上清，最后以孔徑0.45mm的NC膜過濾收集上清得到可溶VTG重組蛋白。

2.兔抗中華鱘VTG蛋白多克隆抗體的制備：

選擇日本大耳兔作為免疫動物，將純化目的蛋白與弗氏完全佐劑充分乳化，進行皮下注射，共免疫5次后分離血清獲得多克隆抗體。

3.中華鱘VTG多克隆抗體特異性檢測：

將誘導的菌體及分離的上清和沉淀分別提取蛋白進行western blot檢測，結果顯示，多克隆抗體在誘導后的菌體及分離出的沉淀中均明顯檢測到VTG蛋白特異性條帶(圖2)，說明制備的中華鱘VTG多克隆抗體特異性好。

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在雌性中華鱘血清VTG含量檢測中的應用，其步驟是：

1.中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在ELISA檢測最佳工作濃度及稀釋比例的測定：

用棋盤滴定法測定，用經倍比稀釋的VTG蛋白，橫向包被酶標板，陰性對照不包被VTG蛋白，按間接ELISA方法將不同稀釋濃度的抗血清縱向逐孔加入板孔，對最適工作濃度評判的標準為陽性孔的A450值約為1，陰性對照孔的A450值小于0.1，而抗原抗體濃度最低即為最適工作濃度。棋盤滴定的結果顯示，當抗體濃度為1：1000時，8.13ug/mL與0.13ug/mL之間曲線的靈敏度和檢測范圍較好，因此在ELISA檢測中采用1：1000的抗體濃度。

2.檢測血清VTG蛋白含量間接ELISA方法的建立：

將重組VTG蛋白以8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13μg/mL包被酶標板100μl/孔，同時將待檢血清稀釋5倍后包被酶標板100μl/孔，于4℃過夜，洗滌5次拍干；加入100μl/孔封閉液，37℃封閉1h，洗滌5次拍干，加入最佳工作濃度的VTG抗血清100μl/孔，37℃溫浴1h，洗滌5次拍干，加入1：5000稀釋辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG100μl/孔，37℃反應1h，洗滌5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反應10-20min，最后加入100μl 2M硫酸終止反應，15min內用酶標儀在450nm波長下測定OD值。

3.中華鱘血清樣品VTG蛋白含量的檢測：

運用建立的ELISA法對II期、III期、IV期共18尾雌性中華鱘血清進行VTG含量的檢測，樣本OD₄₅₀值≥陰性樣本OD450值的平均值(X)+3(SD)＝0.192時，可判為陽性。結果發現檢測血清OD450值均顯示陽性值，說明建立的間接ELISA特異性良好。且IV期雌魚樣品OD450值含量最高且與其他發育期存在顯著性差異，說明建立的間接ELISA具有良好的臨床適用性。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：

1.以pet32a(+)為表達載體進行原核表達，培養簡單，可實現規模化生產。

2.選擇中華鱘VTG基因結構域并截短構建表達質粒，制備簡單并有利于重組目的蛋白的大量表達。

3.制備VTG的特異性抗體，與VTG蛋白抗原免疫性好，效價能達到1：1000，使檢測反應更為特異和穩定。

4.制備的抗原與抗體可用于建立間接ELISA法，應用于中華鱘血清VTG含量的檢測。該方法直接、操作快速，當天即可得到檢測結果，且檢測結果陽性率高達100％，具有良好的臨床適用性。本發明可為將來制定完善的不同發育期中華鱘血清卵黃蛋白原含量標準范圍提供技術支持。

附圖說明

圖1為一種重組質粒蛋白誘導表達檢測及純化結果示意圖。

圖中M為標準蛋白，1為誘導前的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物；2為添加IPTG誘導表達的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物的上清；3為添加IPTG誘導表達的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物的沉淀；4為包涵體沉淀經溶解純化后的可溶性目的蛋白。

圖2為一種VTG重組蛋白的Western-blotting檢測示意圖。

其中：1為誘導前的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物；2為添加IPTG誘導表達的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物；3為添加IPTG誘導表達的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物的上清；4為添加IPTG誘導表達的含Pet32a(+)-VTG的BL21(DE3)產物的沉淀。

具體實施方式

下面結合具體實施方式進一步詳細說明本發明。

實施例1：

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體的制備方法，其步驟是：

1)雌性中華鱘肝臟總RNA的提取和逆轉錄：

取出于RNAlater保存的雌性中華鱘肝臟組織，置于玻璃勻漿器中勻漿，然后按RNA提取試劑盒說明提取總RNA，以提取的總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明反轉錄為cDNA。反應體系為：42℃1hr，70℃加熱10min，終止反應后-20℃保存。

2)中華鱘VTG基因目的片段的擴增和克隆：

通過BLASTP比對數據庫對中華鱘VTG氨基酸序列進行功能檢索，發現中華鱘VTG蛋白氨基酸序列44-612aa區域為卵黃脂蛋白核心功能區，并通過DNAStar Protean軟件分析選擇功能區中親水脂性及抗原性較強的44-442aa區間序列，根據該序列設計上游引物為5'-GAATTCCAACAGACAAAGTATGAACCAA-3'(含EcoRⅠ酶切位點)，下游引物為5'-CTCGAGGTCAAACACCAGTTCAGCAGCC-3'(含XhoⅠ酶切位點)，PCR擴增截短的VTG目的片段，PCR反應體系為：94℃預變性5min，94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸2min反應45個循環。擴增產物回收后連接到pMD-18T中并轉化DH5a感受態細胞，然后涂于含有氨芐青霉素的LB培養基上進行培養，經菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行接種培養提取質粒并進行測序。

3)pet32a(+)-VTG重組質粒構建及酶切鑒定：

將測序正確的pMD-18T-VTG質粒以及Pet32a(+)空載體分別采用EcoRI和XhoI進行酶切后純化目的片段，然后將二者連接為Pet32a(+)-VTG并轉化DH5a，涂布于含有氨芐青霉素的LB培養基上，37℃培養過夜，挑取3-4個克隆接種培養后提取質粒，然后分別用EcoRI和XhoI對提取質粒進行雙酶切鑒定，將電泳檢測正確的質粒進行測序。最后獲得一種截短后的VTG功能結構域片段的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。該氨基酸序列相關蛋白家族包括卵黃蛋白原、微粒體甘油三酸酯轉運蛋白和載脂蛋白b-100等都具有參與脂質運輸的功能。

4)Pet32a(+)-VTG重組質粒的誘導表達：

將測序正確的Pet32a(+)-VTG質粒轉化BL21(DE3)感受態細胞，涂于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上培養，挑取菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃培養過夜；取1ml培養物接種至200ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃培養至菌液OD值約為0.5時，取1ml培養物作為對照菌液，剩余菌液溫度降至室溫后加入終濃度為0.5mM的IPTG于30℃誘導2或3或4h，收集誘導表達菌體超聲洗滌分離出上清和沉淀，并與對照菌液進行SDS-PAGE分析，結果顯示Pet32a(+)-VTG重組蛋白以包涵體沉淀的形式大量表達。

5)Pet32a(+)-VTG重組蛋白的溶解純化：

收集誘導表達的包涵體沉淀，經過多次超聲洗滌后收集沉淀，然后用含8M尿素的蛋白緩沖液重懸沉淀，室溫放置30min后15000×g離心30min收集上清，最后以孔徑0.45mm的NC膜過濾收集上清得到可溶VTG重組蛋白，用紫外分光光度計測定純化后的蛋白濃度。

6)兔抗中華鱘VTG蛋白多克隆抗體的制備：

將1ml純化蛋白(約1mg/ml)與等體積弗氏完全佐劑充分震蕩乳化，在日本大耳兔的背部皮下多點注射，每點注射劑量約0.2mL。第一次注射2周后加強免疫4次，以弗氏不完全佐劑乳化樣品，每次劑量為第一次注射的一半，每次間隔2周。在第4次注射后10天自心臟抽取血液。將兔血放在37℃靜置1h后，沿管壁攪動一圈，利于血細胞沉降。再于4℃靜置過夜，室溫3000g離心10min，吸取多抗血清，分裝后保存于-80℃冰箱。

實施例2：

中華鱘VTG多克隆抗體特異性檢測：

將誘導的菌體及分離的上清和沉淀分別提取蛋白進行western blot檢測，結果顯示，多克隆抗體在誘導后的菌體及分離出的沉淀中均明顯檢測到VTG蛋白特異性條帶(圖2)，說明制備的中華鱘VTG多克隆抗體特異性好。

實施例3：

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在ELISA檢測最佳工作濃度及稀釋比例中的應用，其過程是：

將重組VTG蛋白用pH為9.6的0.05M的碳酸鹽稀釋成為32.5、16.25、8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13、0.06μg/mL10個濃度以100μl/孔包被酶標板，陰性對照不包被VTG蛋白，每個濃度包被1列，放置于4℃包被過夜。用含0.1％(v/v)Tween-20的PBS-T洗滌5次后拍干，每孔加0.5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封閉液300μl，37℃封閉1h；然后將抗血清按1：250、1：500、1：1000、1：2000、1：4000、1:8000、1:16000和1:32000倍比稀釋，分別以100μl/孔橫向加入酶標板中，37℃反應1h后，洗滌5次，用1：5000稀釋辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG100μl/孔加入酶標板，37℃反應1h，洗滌5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反應10或14或18或20min，最后加入100μl 2M硫酸終止反應，15min內用酶標儀在450nm波長下測定OD值；記錄結果如下：

表1 VTG與VTG抗血清棋盤滴定結果

對最適工作濃度評判的標準為陽性孔的A450值約為1，陰性對照孔的A450值小于0.1，而抗原抗體濃度最低即為最適工作濃度。結果表明，當抗體濃度為1：1000時，8.13ug/mL與0.13ug/mL之間曲線的靈敏度和檢測范圍較好。

實施例4：

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在間接ELISA方法建立中的應用：其過程是：

將重組VTG蛋白以8.13、4.06、2.03、1.02、0.5、0.25、0.13μg/mL包被酶標板100μl/孔，同時將待檢血清稀釋5倍后包被酶標板100μl/孔，于4℃過夜，洗滌5次拍干；加入100μl/孔封閉液，37℃封閉1h，洗滌5次拍干，加入最佳工作濃度的VTG抗血清100μl/孔，37℃溫浴1h，洗滌5次拍干，加入1：5000稀釋辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG100μl/孔，37℃反應1h，洗滌5次后拍干，加入TMB底物溶液100μl/孔，37℃避光反應10-20min，最后加入100μl 2M硫酸終止反應，15min內用酶標儀在450nm波長下測定OD值。

實施例5：

一種中華鱘VTG蛋白抗原及抗體在ELISA檢測雌性中華鱘血清VTG含量中的應用：其過程是：

采用實施例4方法對II期、III期、IV期共18尾雌性中華鱘血清進行VTG含量的檢測，樣本OD₄₅₀值≥陰性樣本OD450值的平均值(X)+3(SD)＝0.192時，可判為陽性。結果發現檢測血清OD450值均顯示陽性值，說明建立的間接ELISA特異性良好。且IV期雌魚樣品OD450值含量最高且與其他發育期存在顯著性差異，說明建立的間接ELISA具有良好的臨床適用性。如下表：

表2：中華鱘血清檢測結果

以上所述僅是本發明的非限定實施方式，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明創造構思和不作出創造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水產科學研究院長江水產研究所

<120> 一種中華鱘vtg蛋白抗原及抗體及制備方法和應用

<130> 一種中華鱘vtg蛋白抗原及抗體及制備方法和應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 407

<212> PRT

<213> 中華鱘

<400> 1

Gln Gln Thr Lys Tyr Glu Pro Ser Phe Ser Gly Ser Lys Thr Tyr Gln

1 5 10 15

Tyr Lys Tyr Glu Gly Val Ile Leu Thr Gly Leu Pro Glu Lys Gly Leu

20 25 30

Ala Arg Ala Gly Leu Lys Val His Cys Lys Val Glu Ile Ser Glu Val

35 40 45

Ala Gln Lys Thr Tyr Leu Leu Lys Ile Leu Asn Pro Glu Ile Gln Glu

50 55 60

Tyr Asn Gly Ile Trp Pro Lys Ala Pro Phe Tyr Pro Ala Ser Lys Leu

65 70 75 80

Thr Gln Ala Leu Ala Ser Gln Leu Thr Gln Pro Ile Lys Phe Gln Tyr

85 90 95

Arg Asn Gly Gln Val Gly Asp Ile Phe Ala Ser Glu Asp Val Ser Asp

100 105 110

Thr Ile Leu Asn Ile Gln Arg Gly Ile Leu Asn Met Leu Gln Leu Thr

115 120 125

Ile Lys Thr Thr Gln Asn Val Tyr Gly Leu Gln Glu Asn Gly Ile Ala

130 135 140

Gly Ile Cys Gly Ala Ser Tyr Val Ile Gln Glu Asp Arg Lys Ala Asn

145 150 155 160

Lys Ile Ile Val Thr Lys Ser Lys Asp Leu Asn Asn Cys Asn Glu Lys

165 170 175

Ile Lys Met Asp Ile Gly Met Ala Tyr Ser His Thr Cys Ser Asn Cys

180 185 190

Arg Lys Ile Arg Lys Asn Thr Arg Gly Thr Ala Ala Tyr Thr Tyr Ile

195 200 205

Leu Lys Pro Thr Asp Ala Gly Thr Leu Ile Thr Gln Ala Thr Ser Gln

210 215 220

Glu Val His Gln Leu Thr Pro Phe Asn Glu Met Thr Gly Ala Ala Ile

225 230 235 240

Thr Glu Ala Arg Gln Lys Leu Val Leu Glu Asp Ala Lys Val Val His

245 250 255

Val Thr Val Pro Glu Gln Glu Leu Lys Asn Arg Gly Ser Ile Gln Tyr

260 265 270

Gln Phe Ala Ser Glu Ile Leu Gln Thr Pro Ile Gln Leu Phe Lys Thr

275 280 285

Arg Ser Pro Glu Thr Lys Ile Lys Glu Val Leu Gln His Leu Val Gln

290 295 300

Asn Asn Gln Gln Gln Val Gln Ser Asp Ala Pro Ser Lys Phe Leu Gln

305 310 315 320

Leu Thr Gln Leu Leu Arg Ala Cys Thr His Glu Asn Ile Glu Gly Ile

325 330 335

Trp Arg Gln Tyr Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Arg Arg Trp Ile Leu Asp

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Ala Ala Thr Pro Thr Ala Phe Arg Phe Ile Ser Gln

355 360 365

Arg Ile Met Lys Arg Asp Leu Thr Asp Ala Glu Ala Ile Gln Thr Leu

370 375 380

Val Thr Ala Met His Leu Val Gln Thr Asn His Gln Ile Val Gln Met

385 390 395 400

Ala Ala Glu Leu Val Phe Asp

405