一種紅曲色素的發酵制備方法與流程

本發明屬于生物發酵制備領域，具體涉及一種高色價兼具高生物安全的紅曲色素發酵制備方法。

背景技術：

紅曲色素是由紅曲霉屬的絲狀真菌經發酵產生的次級代謝產物，其因性質穩定、著色性好、無毒等優點常被選作高質的天然食用色素。但傳統紅曲色素的生產時間長，效率較低，且生產過程中常伴隨著桔霉素的生成。而桔霉素具有強烈的腎毒性，國家標準（GB/T 5009.222-2008）中對紅曲液態、固態樣品中桔霉素含量的限定分別為：液態＜50μg/L；固態＜1mg/kg。

技術實現要素：

本發明的目的在于針對傳統技術的不足，提供一種高色價兼具高生物安全的紅曲色素發酵制備方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種紅曲色素的發酵制備方法，包括以下步驟：

1）紅曲霉種子液的制備：將兩塊直徑為6 mm的紅曲霉菌餅接種于50mL PD液體培養基中，于30-32℃、120-150r/min條件下恒溫振蕩培養2-3d，得紅曲霉種子液；

2）紅曲色素的發酵：按液態發酵培養基體積的10%接入步驟1）所得紅曲霉種子液，32℃、180r/min條件下培養12d；

3）發酵液中桔霉素的去除：培養結束后，將所得發酵液與體積濃度為70-75%的乙醇溶液按體積比1:7-1:10混合搖勻，室溫下避光靜置20-40min，取出后4000 r/min離心5-10 min，所得上清液于旋轉蒸發器中55℃-60℃條件下蒸干，再加入少量體積濃度為70-75%的乙醇溶液溶解，得濃縮液；取所得濃縮液采用硅膠柱層析進行分離，并根據硅膠柱上不同顏色的區間帶分別進行收集，將紅色區間帶收集得到的洗脫液于旋轉蒸發器中55℃-60℃蒸干，即得去除桔霉素的紅曲色素。

所用紅曲霉菌為紫色紅曲霉183-3。

所述PD液體培養基的制備方法為：將200g馬鈴薯去皮、切塊，于1000 mL水中煮沸半小時，然后用紗布過濾，濾液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水補足至1000 mL，再于121℃滅菌30 min，即得。

所述液態發酵培養基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt% ZnSO₄、0.02wt% MnSO₄、0.005% FeSO₄，其初始pH值為4.5-5.0。

所述硅膠柱層析分離采用濕法上柱；所用柱子的徑高比為1:10-1:15；所用硅膠為80-120目，其重量為上樣濃縮液體積的20-25倍；所用洗脫劑為乙酸乙酯，其流速為1-2滴/s。

本發明的顯著優點在于：

（1）本發明在液態發酵培養基中以可溶性淀粉作為碳源，并添加硫酸鹽發酵紅曲霉，可大大提高紅曲色素的產量，其產量可達350.8U/mL，與現有發酵工藝相比（紅色價為138.3U/mL）相比，紅曲色素產量提高了1.54倍。

（2）本發明在液態發酵的基礎上結合硅膠柱層析法進行制備，可有效去除桔霉素，經HPLC檢測，所得紅曲色素中桔霉素含量為17.2μg/L，達國標要求。

（3）本發明在大幅度提高紅曲色素產量的同時可有效去除桔霉素，其方法操作簡單，實用性強，為紅曲色素在食品方面得到更廣泛的應用打下了基礎。

附圖說明

圖1為發酵后所得發酵液的高效液相色譜圖。

圖2為柱層析分離后所得樣品溶液的高效液相色譜圖。

具體實施方式

為了使本發明所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發明不僅限于此。

所用紫色紅曲霉183-3為申請人自行選育獲得，其選育方法參見“高產紅色素及糖化酶紅曲菌株的誘變選育”（徐美愛 等，《中國食品學報》，2015，15(2)：74-82）。

實施例1 液態發酵

（1）取紫色紅曲霉183-3菌株斜面，用灼燒滅菌后的接種環挑取孢子于PDA平板上劃線，30℃培養3-4d，挑取生長快、菌落大的進行傳代培養，獲得生長力旺盛的紅曲霉菌株；

（2）用打孔器在紅曲霉平板上打出2個菌餅（6mm），接種到PD液體培養基中（培養基分裝于250mL錐形瓶中，裝液量為50mL/瓶），置于往復式搖床中，于32℃、120r/min條件下恒溫振蕩培養3d，得紅曲霉種子液；

（3）將液態發酵培養基分裝于250mL錐形瓶中，裝液量為50mL/瓶，然后接入5mL紅曲霉種子液，于32℃、180r/min條件下培養12d，得發酵液。

所用PD液體培養基的制備方法為：將200g馬鈴薯去皮、切塊，于1000 mL水中煮沸半小時，然后用紗布過濾，濾液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水補足至1000 mL，再于121℃滅菌30 min，即得。

所用液態發酵培養基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt% ZnSO₄、0.02wt% MnSO₄、0.005% FeSO₄，其初始pH值為5.0。

實施例2 桔霉素的去除

（1）取發酵液10mL，加入90mL體積濃度為75%的乙醇溶液，震蕩混勻，室溫下避光放置20min，取出后4000r/min離心8min，所得上清液于旋轉蒸發器中55℃蒸干，再加入5mL體積濃度為75%乙醇溶液溶解，得濃縮液；

（2）將10g、80-120目的柱層析用硅膠用乙酸乙酯浸泡后濕法裝柱，柱子的直徑為10mm，裝柱高度為10cm；取0.5mL濃縮液上樣，以乙酸乙酯為洗脫劑進行洗脫，洗脫劑流速控制在1-2滴/秒，根據硅膠柱上不同顏色的區間帶分別進行收集；

（3）將紅色區間帶收集得到的洗脫液于旋轉蒸發器中55℃蒸干，加入3mL體積濃度為75%的乙醇溶液溶解，得樣品溶液。

實施例3 HPLC檢測方法

采用配有熒光檢測器的高效液相色譜系統

色譜柱：HITACHI LaChromUltra C18 (150mm×4.6mm，粒度5μm)；

流動相：乙腈：超純水（用磷酸調pH至2.5）=35：65；

檢測器：熒光檢測器，激發波長331nm，發射波長500nm；

進樣量：20μL；

流速：1 mL/min；

柱溫：28℃。

實驗結果：圖1、2分別為所檢測發酵液與樣品溶液的高效液相色譜圖。從圖中可以看出，發酵液中桔霉素（t=12.989）含量較高，而經硅膠柱層析后的樣品溶液中幾乎不含有桔霉素。

經計算，發酵液中桔霉素含量為39.09mg/L，而經硅膠柱層析分離后樣品溶液中桔霉素含量為17.2μg/L，符合國家標準要求（液態＜50μg/L），且紅曲色素收率為66.98%。

以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。